1. IntroductionGliomas are a hetero

1. Introduction
Gliomas are a heterogeneous group of primary brain tumors, glioblastoma
(GBM) being the most malignant one. Only 5% of glioblastoma
patients survive 5 years after diagnosis and the majority dies
within two years [1]. Standard therapy comprises maximal safe
resection, followed by radiotherapy with concomitant systemic therapy
using the alkylating agent temozolomide. However, patients
respond differently to the standard therapy due to the high heterogeneity
of the disease. The cancer stem cell (CSC) theory suggests
that only a subpopulation of tumor cells in glioblastoma is able to initiate
tumor growth and drive its development [2]. According to this
theory all standard therapies will eventually fail if CSCs are not
removed. The high content of CSCs has been correlated with worse
prognosis or increased aggressiveness in many tumor types, such
as breast [3], head and neck [4], oropharyngeal cancer [5], and
glioma [6]. Given that CSCs are resistant to classical chemo and
radiotherapy, several novel approaches to specifically target them have
been suggested. Among these, inducing differentiation of CSCs is one of
the most promising [7]. In particular, the bone morphogenetic protein 4
(BMP4) was found to induce CSC differentiation and to consequently
block proliferation and tumor growth [8]. The bone morphogenetic protein
7 variant (BMP7) [9] and all-trans retinoic acid (ATRA) had a very
similar effect [10].
Because of the central role of CSCs in tumor development and their
prognostic value, it would be important to develop methods to monitor
their presence/abundance in tumor samples [11], as well as the efficacy
of stem cell-differentiating agents. Glioma stem cells have some known
characteristics, such as ability of self-renewal, ability to give rise to different
cell types, and the expression of molecular markers, such as
nestin, CD133 and Sox2. These cells are also able to regenerate the heterogeneous
cell populations similar to the original tumor, when
transplanted to a nude mice. Most of these properties are however not
an exclusive feature of CSC and do not provide a reliable strategy to
study their abundance [12]. In the present study we suggest the use of
Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy as an alternative
approach to find small differences between glioma stem cells and glioma
cells without stem cell properties, and to estimate the content of
CSCs in a heterogeneous sample.
FITR is a well-established label-free analytical methodology for the
analysis of biological samples [13]. It provides spatially resolved information
on the composition and structure of the most relevant biomacromolecules
[14], probing their vibrational modes without inducing
sample damaging [15]. In the last decades, advances in detector technology
[16] and source brightness [17] have made it possible to perform
single cell analysis, allowing the fine characterization of heterogeneous
cell populations.
The topic of cell differentiation has already been studied using FTIR
in different systems [18,19,20,21,22]. Nevertheless, each of the investigated
samples (cell type, tissue) is biochemically different: in adipose
cells there is an accumulation of triglycerides, in hepatocytes and muscle
cells there is a high level of glycogen, in brain cells typical lipid constituents
are different to other cell types and the panel of expressed
proteins is different for each. Therefore, the marker regions of infrared
spectra that could distinguish glioma stem cells from differentiated
ones would likely be different from those previously identified in
other cell types.
In this work, we report the changes in biochemical composition that
occur during the differentiation of NCH421k as a glioma stem cell
model. Using Principal Component Analysis (PCA), we identified clear
signatures of differentiation affecting proteome and lipidome cellular
profiles, but also the extent of protein phosphorylation and intracellular
glycogen level. Moreover, we tested the ability of the technique to estimate
the content of stem-like cells in heterogeneous samples demonstrating
the predictive capability of the technique and its potential for
diagnostic purposes.
2. Materials and methods
2.1. Cells and differentiation
NCH421k cells as a glioma stem cell model were purchased from CLS
cell lines service and grown as floating neurospheres in DMEM/F12
medium supplemented with 0.25% BSA, 1% ITS, 20 ng/mL epidermal
growth factor and 20 ng/mL basic fibroblast growth factor at 37 °C in
5% CO2 atmosphere (control cells from here on). Cells were routinely
passaged every 4 days. Differentiation of neurospheres was induced as
described by Campos [10] by growing them in the same medium containing
10% FBS and 10 nM ATRA for 72 h (ATRA-differentiated from
here on). To follow cell cycle phase distribution, PI staining was performed
as described elsewhere [23].
2.2. Sample preparation
From control cells (neurospheres) single cell suspension was prepared.
ATRA-differentiated cells were instead collected by trypsinization.
Each sample was washed in physiological solution and divided into two
parts, one for FTIR microspectroscopy analysis and the other for parallel
IF, WB or PCR.
2.3. PCR
RNA was isolated using Isol-RNA lysis reagent following the
manufacturer's instructions (5Prime) and 2 μg of RNA was transcribed
to cDNA using a cDNA Archive kit (Applied Biosystems). Expression
levels of GFAP, nestin, CD133 and β-actin as endogenous
control were measured by PCR (BioRad) using the SYBR Green master
mix (BioRad) and the following primer pairs (sequences selected
from primerdepot NIH): GFAP F: acagacttggtgtccaggct, R:
gagatcgccacctacaggaa; nestin F: gggagttctcagcctccag R:
ggagaaacagggcctacaga; CD133 F: gcattggcatcttctatggtt, R:
cgccttgtccttggtagtgt; and β-actin F: ccttgcacatgccggag R:
gcacagagcctcgcctt. PCR conditions were 50 °C for 2 min, 95 °C for
10 min and 45 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min; the data
were analyzed by the ΔΔCt algorithm. Statistical significance
between expressions was determined by two tailed Student's t-test
and p b 0.05 was considered significant.
2.4. GFAP and CD133 immunofluorescent staining
To determine the percentage of differentiated cells, staining of
astrocyte-marker GFAP and stem cell marker CD133 was performed.
Staining was performed on cells in single cell suspension. Cells were
then fixed in 3.7% paraformaldehyde, blocked in 4% BSA and incubated
in anti-GFAP primary antibody (Novus Biologicals, 1:50 in 1% BSA in
PBS). For CD133 primary antibody incubation (Miltenyi, 1:11) was
done before fixation. Afterwards, cells were incubated in Alexa488
anti-rabbit (Invitrogen, Molecular Probes, 1:300) and nuclei were counterstained
with Toto3 (Invitrogen Molecular Probes, 1:5000). Images of
at least 200 cells were acquired using a Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope
and the percentage of differentiated cells was calculated as the
number of GFAP positive cells versus all cells stained by Toto3.
2.5. Apoptosis assessment
Annexin V staining was used to detect early stages of apoptosis. For
positive control, cells were treated with 10 μM camptothecin for 4 h.
Control, ATRA and camptothecin treated cells were washed in PBS and
resuspended in Annexin V binding buffer: 10 mM Hepes, pH 7.4,
140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl2. The staining was performed according
to the instructions of the producer (Roche) and 10,000 cells were analyzed
on FACSCalibur (Becton Dickinson) using CellQuestPro software.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำกลุ่มแตกต่างกันของเนื้องอกสมองหลัก glioblastoma จะ gliomas(GBM) เป็นหนึ่งร้ายแรงที่สุด เพียง 5% ของ glioblastomaผู้ป่วยอยู่รอด 5 ปีหลังการวินิจฉัยและส่วนใหญ่เสียชีวิตภายในสองปี [1] รักษามาตรฐานประกอบด้วยปลอดภัยสูงสุดresection ตาม ด้วยการฉายแสงด้วยมั่นใจระบบบำบัดใช้ temozolomide แทน alkylating อย่างไรก็ตาม ผู้ป่วยตอบสนองการรักษามาตรฐานจาก heterogeneity สูงแตกต่างกันของโรค แนะนำทฤษฎีเซลล์ต้นกำเนิด (CSC) โรคมะเร็งว่าเฉพาะ subpopulation ของเซลล์เนื้องอกใน glioblastoma สามารถเริ่มต้นเนื้องอกเจริญเติบโต และการพัฒนา [2] ขับรถ ตามนี้ทฤษฎีมาตรฐานรักษาทั้งหมดจะในที่สุดล้มเหลวถ้า CSCs ไม่เอาออก เนื้อหาสูงของ CSCs ได้ถูก correlated กับแย่ลงคาดคะเนหรือ aggressiveness เพิ่มขึ้นในหลายโรคเนื้องอกชนิด เช่นเป็นเต้านม [3], ศีรษะ และคอ [4] [5], oropharyngeal มะเร็ง และglioma [6] ระบุว่าจะทนให้ chemo คลาสสิก CSCs และมีหลายวิธีการใหม่ ๆ เพื่อเป้าหมายดังกล่าวโดยเฉพาะการฉายแสงการแนะนำ ในหมู่เหล่านี้ สร้างความแตกต่างของ CSCs inducing เป็นหนึ่งว่า [7] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โปรตีน morphogenetic ของกระดูก 4มีการค้นพบ (BMP4) เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่างของ CSC และดังนั้นบล็อกการงอกและเจริญเติบโตของเนื้องอก [8] โปรตีน morphogenetic ของกระดูก7 ตัวแปร (BMP7) [9] และธุรกรรมทั้งหมด retinoic กรด (ATRA) มากคล้ายผล [10]เพราะ CSCs บทบาทศูนย์กลางในการพัฒนาเนื้องอก และการค่า prognostic มันจะต้องพัฒนาวิธีการตรวจสอบนักแสดง/อุดมสมบูรณ์ในตัวอย่างเนื้องอก [11], ประสิทธิภาพความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดตัวแทน Glioma เซลล์ต้นกำเนิดมีบางเรียกว่าลักษณะ เช่นความสามารถของตนเองต่ออายุ ความสามารถในการก่อให้เกิดการแตกต่างกันเซลล์ชนิด และค่าของโมเลกุลเครื่องหมาย เช่นCD133 nestin และ Sox2 เซลล์เหล่านี้จะยังสามารถสร้างขึ้นใหม่ที่แตกต่างกันเซลล์คล้ายกับเนื้องอกเดิม ประชากรเมื่อtransplanted กับหนูเปลือยกาย ส่วนใหญ่ของคุณสมบัติเหล่านี้เป็นอย่างไรก็ตามไม่มีคุณลักษณะพิเศษของ CSC และให้กลยุทธ์ที่น่าเชื่อถือไปศึกษาความอุดมสมบูรณ์ของพวกเขา [12] ในการศึกษาปัจจุบัน เราแนะนำการใช้ฟูรีเยช่วงอินฟราเรด (FTIR) microspectroscopy ที่แปลงเป็นทางเลือกวิธีการหาความแตกต่างเล็ก ๆ ระหว่างเซลล์ต้นกำเนิด glioma gliomaเซลล์ โดยไม่มีคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิด และประเมินเนื้อหาของCSCs ในตัวอย่างที่แตกต่างกันลดสุดพิเศษถูกวิธีฟรีป้ายชื่อแบบวิเคราะห์ดีขึ้นสำหรับการการวิเคราะห์ตัวอย่างทางชีวภาพ [13] ให้ข้อมูลแก้ไข spatiallyองค์ประกอบและโครงสร้างของ biomacromolecules มากที่สุด[14], โดยอาศัยวิธีการ vibrational โดย inducingตัวอย่างที่เสียหาย [15] ในทศวรรษที่ผ่านมา ความก้าวหน้าของเทคโนโลยีการตรวจจับ[16] และแหล่งความสว่าง [17] ได้ทำการเซลล์เดียววิเคราะห์ ให้คุณสมบัติที่ดีของแตกต่างกันเซลล์ประชากรหัวข้อของการสร้างความแตกต่างของเซลล์ได้แล้วการศึกษาใช้ FTIRแตกต่างกันระบบ [18,19,20,21,22] อย่างไรก็ตาม แต่ละการ investigatedตัวอย่าง (เซลล์ เนื้อเยื่อ) จะแตกต่างกัน biochemically: ใน adiposeการสะสมของระดับไตรกลีเซอไรด์ ใน hepatocytes และกล้ามเนื้อเป็นเซลล์ที่มีมีเซลล์เป็นไกลโคเจน constituents ไขมันโดยทั่วไปของเซลล์สมองในระดับสูงจะแตกต่างกับเซลล์ชนิดอื่น ๆ ในแผงของแสดงโปรตีนจะแตกต่างกันสำหรับแต่ละ ดังนั้น เครื่องหมายพื้นที่ของอินฟราเรดแรมสเป็คตราที่สามารถแยก glioma เซลล์ต้นกำเนิดจากทั่วคนอาจจะแตกต่างจากที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ ในเซลล์ชนิดอื่น ๆในงานนี้ เราได้รายงานการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบชีวเคมีที่เกิดขึ้นระหว่างการสร้างความแตกต่างของ NCH421k เป็นเซลล์ต้นกำเนิด gliomaแบบจำลอง เราใช้การวิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก (PCA), ระบุชัดเจนลายเซ็นที่สร้างความแตกต่างที่กระทบ proteome และโทรศัพท์มือถือ lipidomeโพรไฟล์ แต่ขอบเขต ของโปรตีน phosphorylation และ intracellularระดับไกลโคเจน นอกจากนี้ เราทดสอบความสามารถในเทคนิคการประเมินเนื้อหาของเซลล์ต้นกำเนิดเหมือนในตัวอย่างที่แตกต่างกันที่เห็นความสามารถในการคาดการณ์ของเทคนิคและศักยภาพในการวินิจฉัย2. วัสดุและวิธีการ2.1. เซลล์ และสร้างความแตกต่างNCH421k เซลล์เป็นเซลล์ต้นกำเนิด glioma ซื้อจากมหาชนรายการเซลล์เติบโตลอย neurospheres DMEM/F12 และบริการสื่อเสริม ด้วย 0.25% บีเอสเอ 1% ของ 20 ng/mL epidermalปัจจัยการเจริญเติบโตและอัตราการเจริญเติบโตของ fibroblast พื้นฐาน 20 ng/mL ที่ 37 ° C ในบรรยากาศ 5% CO2 (ควบคุมเซลล์จากบน) เซลล์อยู่เป็นประจำpassaged ทุก 4 วัน สร้างความแตกต่างของ neurospheres ถูกทำให้เกิดเป็นอธิบาย โดย Campos [10] โดยเจริญเติบโตในที่ประกอบด้วยขนาดเดียวกัน10% FBS และ 10 nM ATRA สำหรับ 72 h (ATRA-differentiated จากที่นี่บน) ตามวงจรเซลล์ระยะกระจาย PI ย้อมสีทำเป็นอธิบายอื่น ๆ [23]2.2. ตัวอย่างจากการควบคุม คือเตรียมระงับเซลล์เดียวเซลล์ (neurospheres)เซลล์ที่แตกต่างกัน ATRA ถูกเก็บรวบรวม โดย trypsinization แทนแต่ละอย่างถูกล้างในโซลูชันสรีรวิทยา และแบ่งออกเป็นสองชิ้นส่วน สำหรับวิเคราะห์ FTIR microspectroscopy และอื่น ๆ สำหรับขนานถ้า WB หรือ PCR2.3 การ PCRอาร์เอ็นเอที่แยกโดยใช้อาร์เอ็นเอ Isol lysis รีเอเจนต์ต่อคำแนะนำ (5Prime) และ μg 2 ของอาร์เอ็นเอของผู้ผลิตถูกทับศัพท์การ cDNA ใช้ cDNA ชุดถาวร (Biosystems ใช้) นิพจน์ระดับของ GFAP, nestin, CD133 และแอกตินβเป็น endogenousตัวควบคุมถูกวัด โดย PCR (BioRad) ใช้หลัก SYBR Greenผสม (BioRad) และคู่รองพื้นต่อไปนี้ (เลือกลำดับจาก primerdepot NIH): GFAP F: acagacttggtgtccaggct, R:gagatcgccacctacaggaa nestin F: gggagttctcagcctccag R:ggagaaacagggcctacaga CD133 F: gcattggcatcttctatggtt, R:cgccttgtccttggtagtgt และβ-แอกติน F: ccttgcacatgccggag R:gcacagagcctcgcctt เงื่อนไข PCR ได้ 50 องศาเซลเซียสใน 2 นาที 95 ° C สำหรับ10 นาทีและรอบ 45 95 องศาเซลเซียส 15 s และ 60 ° C สำหรับ 1 นาที ข้อมูลมีวิเคราะห์ โดยอัลกอริทึม ΔΔCt นัยสำคัญทางสถิติระหว่างนิพจน์ถูกกำหนด โดย t-ทดสอบสองหางของนักเรียนและ p b 0.05 ถือเป็นสำคัญ2.4 GFAP และ CD133 ย้อมสี immunofluorescentเพื่อกำหนดเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ต่าง ๆ การย้อมสีของแอสโทรไซต์เครื่องหมาย GFAP และเซลล์ต้นกำเนิดเครื่องหมาย CD133 ที่ดำเนินการย้อมสีที่ดำเนินการในเซลล์เซลล์เดียวระงับ เซลล์ได้ถาวรใน paraformaldehyde 3.7% บล็อกใน 4% บีเอสเอ และ incubated แล้วในหลักแอนติบอดีต้าน GFAP (โนวัส Biologicals, 1:50 ในบีเอสเอ 1% ในPBS) สำหรับ CD133 ถูกบ่มแอนติบอดีหลัก (Miltenyi, 1:11)ทำก่อนเบี ภายหลัง เซลล์ถูก incubated ใน Alexa488counterstained กระต่ายป้องกัน (Invitrogen, Probes โมเลกุล 1:300) และแอลฟากับ Toto3 (Invitrogen โมเลกุลคลิปปากตะเข้ 1:5000) ภาพของน้อย 200 เซลล์ที่ได้รับมาใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal Zeiss ทต้า 510 Metaและมีคำนวณเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ต่าง ๆ เป็นจำนวน GFAP บวกเซลล์กับเซลล์ทั้งหมดที่สี โดย Toto32.5 การ Apoptosis ประเมินใช้ annexin V ย้อมสีตรวจพบตั้งแต่ระยะเริ่มแรกของ apoptosis สำหรับควบคุมบวก เซลล์ได้รับการรักษา ด้วย 10 μM camptothecin สำหรับ 4 hควบคุม ATRA และ camptothecin รักษาเซลล์ถูกล้างใน PBS และresuspended ในบัฟเฟอร์รวม Annexin V: Hepes, pH 7.4, 10 มม.NaCl 140 มม. และ CaCl2 2.5 mM การย้อมสีทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Roche) และ 10000 เซลล์ถูกวิเคราะห์ใน FACSCalibur (สัน Becton) โดยใช้ซอฟต์แวร์ CellQuestPro

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1. บทนำ
Gliomas เป็นกลุ่มที่แตกต่างกันของเนื้องอกในสมองหลัก glioblastoma
(GBM) เป็นหนึ่งในมะเร็งมากที่สุด เพียง 5% ของ glioblastoma
ผู้ป่วยอยู่รอด 5
ปีหลังการวินิจฉัยและส่วนใหญ่เสียชีวิตภายในสองปี[1] การรักษาด้วยมาตรฐานความปลอดภัยสูงสุดประกอบด้วยการผ่าตัดตามด้วยการรักษาด้วยรังสีกับการรักษาด้วยระบบกันโดยใช้ตัวแทนalkylating temozolomide อย่างไรก็ตามผู้ป่วยตอบสนองแตกต่างกันไปการรักษามาตรฐานอันเนื่องมาจากความแตกต่างในระดับสูงของการเกิดโรค เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) ทฤษฎีแสดงให้เห็นว่ามีเพียงsubpopulation ของเซลล์มะเร็งใน glioblastoma สามารถที่จะเริ่มต้นการเจริญเติบโตของเนื้องอกและผลักดันการพัฒนา [2] ตามนี้ทฤษฎีทุกการรักษามาตรฐานในที่สุดก็จะล้มเหลวถ้า CSCS ไม่ได้เอาออก เนื้อหาที่สูงของ CSCS ได้รับที่เลวร้ายยิ่งมีความสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรคหรือความก้าวร้าวเพิ่มขึ้นในรูปแบบของเนื้องอกจำนวนมากเช่นเต้านม[3], ศีรษะและลำคอ [4] มะเร็ง oropharyngeal [5] และGlioma [6] ระบุว่า CSCS มีความทนทานต่อคีโมคลาสสิกและการรักษาด้วยรังสี, นวนิยายหลายวิธีที่จะกำหนดเป้าหมายเฉพาะพวกเขาได้รับการแนะนำ ระหว่างนี้การกระตุ้นให้เกิดความแตกต่างของ CSCS เป็นหนึ่งในแนวโน้มมากที่สุด[7] โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีน morphogenetic กระดูก 4 (BMP4) พบว่าทำให้เกิดความแตกต่างของ CSC และจึงป้องกันการงอกและการเจริญเติบโตของเนื้องอก[8] กระดูก morphogenetic โปรตีน7 ตัวแปร (BMP7) [9] และกรดทั้งหมดทรานส์ retinoic (ATRA) มีมากผลที่คล้ายกัน[10]. เพราะบทบาทสำคัญของ CSCS ในการพัฒนาเนื้องอกของพวกเขาและค่าพยากรณ์ก็จะเป็นสิ่งสำคัญที่จะพัฒนาวิธีการในการตรวจสอบสถานะของพวกเขา / ความอุดมสมบูรณ์ในตัวอย่างเนื้องอก [11] เช่นเดียวกับการรับรู้ความสามารถของเซลล์ต้นกำเนิดที่แตกต่างตัวแทน เซลล์ต้นกำเนิด Glioma มีบางส่วนที่รู้จักกันในลักษณะเช่นความสามารถของตัวเองต่ออายุความสามารถในการก่อให้เกิดความแตกต่างกันชนิดของเซลล์และการแสดงออกของโมเลกุลเช่นnestin, CD133 และ Sox2 เซลล์เหล่านี้ยังสามารถที่จะงอกใหม่ที่แตกต่างกันของประชากรเซลล์คล้ายกับเนื้องอกเดิมเมื่อย้ายไปหนูเปลือย ส่วนใหญ่ของคุณสมบัติเหล่านี้มี แต่ไม่ได้เป็นคุณลักษณะพิเศษของก.พ. และไม่ให้เป็นกลยุทธ์ที่น่าเชื่อถือในการศึกษาความอุดมสมบูรณ์ของพวกเขา[12] ในการศึกษาปัจจุบันเราขอแนะนำการใช้งานของฟูเรียร์อินฟราเรด (FTIR) microspectroscopy เป็นทางเลือกวิธีการที่จะพบความแตกต่างเล็กๆ ระหว่างเซลล์ต้นกำเนิด Glioma และ Glioma เซลล์โดยไม่ต้องคุณสมบัติเซลล์ต้นกำเนิดและเพื่อประเมินเนื้อหาของCSCS ในตัวอย่างที่แตกต่างกัน. Fitr เป็น วิธีการวิเคราะห์ป้ายฟรีที่ดีขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างทางชีวภาพ[13] จะให้ข้อมูลเชิงพื้นที่ได้รับการแก้ไขในองค์ประกอบและโครงสร้างของ biomacromolecules ที่เกี่ยวข้องมากที่สุด [14], แหย่โหมดการสั่นของพวกเขาโดยการกระตุ้นให้เกิดตัวอย่างความเสียหาย[15] ในทศวรรษที่ผ่านมาความก้าวหน้าในด้านเทคโนโลยีการตรวจจับ[16] และแหล่งที่มาสว่าง [17] ได้ทำให้มันเป็นไปได้ที่จะดำเนินการวิเคราะห์เซลล์เดียวที่ช่วยให้ตัวละครที่ดีของการที่แตกต่างกันของประชากรเซลล์. เรื่องของความแตกต่างของเซลล์ได้รับการศึกษาโดยใช้ FTIR แตกต่างกัน ระบบ [18,19,20,21,22] อย่างไรก็ตามแต่ละการตรวจสอบตัวอย่าง (เซลล์เนื้อเยื่อ) ที่แตกต่างกันทางชีวเคมีในไขมันเซลล์มีการสะสมของไตรกลีเซอไรด์ที่อยู่ในเซลล์ตับและกล้ามเนื้อเซลล์ที่มีระดับสูงของไกลโคเจนในเซลล์สมององค์ประกอบของไขมันโดยทั่วไปมีความแตกต่างกับคนอื่นๆ ชนิดของเซลล์และแผงของผู้แสดงความโปรตีนที่แตกต่างกันสำหรับแต่ละ ดังนั้นภูมิภาคเครื่องหมายของอินฟราเรดสเปกตรัมที่สามารถแยกแยะความแตกต่างเซลล์ต้นกำเนิด Glioma จากความแตกต่างคนมีแนวโน้มที่จะมีความแตกต่างจากที่ระบุก่อนหน้านี้ในเซลล์ชนิดอื่นๆ . ในงานนี้เรารายงานการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบทางชีวเคมีที่เกิดขึ้นในช่วงการเปลี่ยนแปลงของ NCH421k เป็นที่ Glioma เซลล์ต้นกำเนิดรูปแบบ โดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) เราระบุชัดเจนลายเซ็นของความแตกต่างที่มีผลต่อโปรตีนและlipidome โทรศัพท์มือถือรูปแบบแต่ยังขอบเขตของฟอสโฟโปรตีนภายในเซลล์และระดับไกลโคเจน นอกจากนี้เราได้ทดสอบความสามารถในการใช้เทคนิคในการประเมินเนื้อหาของเซลล์ต้นกำเนิดเหมือนในตัวอย่างที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการคาดการณ์ของเทคนิคและศักยภาพสำหรับวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัย. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 เซลล์และความแตกต่างเซลล์ NCH421k เป็นรูปแบบเซลล์ต้นกำเนิด Glioma ที่ซื้อมาจาก CLS เซลล์บริการเส้นและเติบโตขึ้นเป็นลอย neurospheres ใน DMEM / F12 กลางเสริมด้วย 0.25% บีเอสเอ, 1% ITS 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตรผิวหนังปัจจัยการเจริญเติบโตและ20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ปัจจัยการเจริญเติบโต fibroblast พื้นฐานที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศCO2 5% (เซลล์ควบคุมจากที่นี่) เซลล์ที่ถูกประจำpassaged ทุก 4 วัน ความแตกต่างของ neurospheres ถูกชักนำเป็นอธิบายโดยCampos [10] โดยการปลูกไว้ในสูตรเดิมที่มีFBS 10% และ 10 นาโนเมตร ATRA 72 h (ATRA-แตกต่างจากที่นี่ใน) ที่จะปฏิบัติตามขั้นตอนการกระจายของเซลล์วงจรการย้อมสี PI ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น[23]. 2.2 การเตรียมความพร้อมตัวอย่างจากเซลล์ควบคุม (neurospheres) ระงับเซลล์เดียวถูกจัดทำขึ้น. เซลล์ ATRA-แตกต่างที่ถูกเก็บรวบรวมแทนโดย trypsinization. แต่ละตัวอย่างถูกล้างในการแก้ปัญหาทางสรีรวิทยาและแบ่งออกเป็นสองส่วนหนึ่งสำหรับ FTIR วิเคราะห์ microspectroscopy และอื่น ๆ สำหรับคู่ขนานถ้า, WB หรือ PCR. 2.3 PCR RNA ที่แยกได้โดยใช้น้ำยาสลาย Isol-RNA ต่อไปนี้คำแนะนำของผู้ผลิต(5Prime) และ 2 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอที่ถูกคัดลอกไปcDNA โดยใช้ยีนชุด Archive (Applied Biosystems) การแสดงออกของระดับของ GFAP, nestin, CD133 และβ-โปรตีนเป็นภายนอกการควบคุมถูกวัดโดยวิธีPCR (BioRad) โดยใช้สีเขียว SYBR ต้นแบบผสม(BioRad) และคู่ไพรเมอร์ต่อไปนี้ (ลำดับที่เลือกจากprimerdepot NIH): GFAP F: acagacttggtgtccaggct วิจัย : gagatcgccacctacaggaa; nestin F: gggagttctcagcctccag R: ggagaaacagggcctacaga; CD133 F: gcattggcatcttctatggtt วิจัย: cgccttgtccttggtagtgt; และ F-βโปรตีน: ccttgcacatgccggag R: gcacagagcctcgcctt เงื่อนไข PCR เป็น 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 นาทีและ 45 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที; ข้อมูลที่ได้มาวิเคราะห์โดยขั้นตอนวิธีΔΔCt นัยสำคัญทางสถิติระหว่างการแสดงออกที่ถูกกำหนดโดย t-test นักศึกษาเทลด์สองและPB 0.05 ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญ. 2.4 GFAP และการย้อมสี CD133 พยาธิการตรวจสอบอัตราร้อยละของเซลล์ที่แตกต่างกันที่การย้อมสีของGFAP astrocyte เครื่องหมายและเซลล์ต้นกำเนิดเครื่องหมาย CD133 ได้ดำเนินการ. การย้อมสีที่ได้ดำเนินการต่อเซลล์ในการระงับเซลล์เดียว เซลล์ที่ถูกคงที่แล้ว paraformaldehyde 3.7% บล็อกในบีเอสเอ 4% และบ่มในการต่อต้านGFAP แอนติบอดีหลัก (Biologicals Novus, 01:50 ในบีเอสเอ 1% ในพีบีเอส) สำหรับ CD133 บ่มแอนติบอดีหลัก (Miltenyi, 01:11) ได้ทำมาก่อนการตรึง หลังจากนั้นเซลล์ถูกบ่มใน Alexa488 ต่อต้านกระต่าย (Invitrogen, Probes โมเลกุล 1: 300) และนิวเคลียสถูก counterstained กับ Toto3 (Invitrogen Probes โมเลกุล 1: 5000) ภาพอย่างน้อย 200 เซลล์ที่ได้มาใช้ Zeiss LSM 510 กล้องจุลทรรศน์ confocal Meta และร้อยละของเซลล์ที่แตกต่างที่คำนวณได้เป็นจำนวน GFAP บวกเมื่อเทียบกับเซลล์ทุกเซลล์สีโดย Toto3. 2.5 การประเมินการตายการย้อมสี Annexin V ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบขั้นตอนแรกของการตาย สำหรับการควบคุมบวกเซลล์ได้รับการรักษาด้วยยา Camptothecin 10 ไมครอน 4 ชม. ควบคุม ATRA และยา Camptothecin รับการรักษาเซลล์ที่ถูกล้างในพีบีเอสและresuspended ใน Annexin V ผูกพันบัฟเฟอร์: 10 มิลลิ HEPES พีเอช 7.4, 140 มิลลิโซเดียมคลอไรด์และ 2.5 มิลลิ CaCl2 การย้อมสีที่ได้ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Roche) และ 10,000 เซลล์ถูกนำมาวิเคราะห์ในFACSCalibur (Becton ดิกคินสัน) โดยใช้ซอฟแวร์ CellQuestPro

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . หลักการค้นหาความจริงเบื้องต้น
เป็นกลุ่มข้อมูลเนื้องอกในสมองหลัก เซลส์
( GBM ) เป็นมะเร็งมากที่สุดคนหนึ่ง เพียง 5 % ของผู้ป่วยที่รอดชีวิตที่ 5 ปีหลังการวินิจฉัยเซลส์

และส่วนใหญ่จะตายภายในสองปี [ 1 ] การรักษามาตรฐานประกอบด้วยสูงสุดปลอดภัย
Resection ตามด้วยรังสีรักษาร่วมกับผู้ป่วย ระบบบําบัด
โดยใช้สารเทโมโซโลไมด์ . อย่างไรก็ตามผู้ป่วย
ตอบสนองแตกต่างกันไปการรักษามาตรฐาน เนื่องจากการสูง
ความหลากหลายของโรค มะเร็งเซลล์ต้นกำเนิด ( CSC ) ทฤษฎีชี้ให้เห็น
เพียง subpopulation ของเซลล์เนื้อร้าย เซลส์สามารถเริ่มต้น
การเจริญเติบโตของเนื้องอกและไดรฟ์การพัฒนา [ 2 ] ตามทฤษฎีนี้
รักษามาตรฐานทั้งหมดในที่สุดจะล้มเหลวถ้า cscs ไม่ได้
ลบออกเนื้อหาสูงของ cscs มีความสัมพันธ์กับอาการแย่
หรือเพิ่มความก้าวร้าวในประเภทเนื้องอกมากมาย เช่น
เป็นเต้านม [ 3 ] , หัวและคอ [ 4 ] , oropharyngeal มะเร็ง [ 5 ] ,
เซลส์ [ 6 ] ระบุว่า cscs ป้องกันการทำคีโมและคลาสสิก
รังสีรักษาหลายวิธีนวนิยายโดยเฉพาะเป้าหมายที่พวกเขาได้
ถูกแนะนำ ระหว่างนี้ ทำให้เกิดความแตกต่างของ cscs เป็นหนึ่งของ
มีแนวโน้มมากที่สุด [ 7 ] โดยเฉพาะกระดูก morphogenetic โปรตีน 4
( bmp4 ) พบว่าเกิดความแตกต่างและจากนั้น
CSC บล็อก proliferation และการเจริญเติบโตเนื้องอก [ 8 ] กระดูก morphogenetic โปรตีน
7 ตัวแปร ( bmp7 ) [ 9 ] และทรานส์ retinoic acid ( ภัทร ) มีมาก
คล้ายผล [ 10 ] .
เพราะบทบาทของ cscs ในการพัฒนาเนื้องอกและค่าการทำนายของพวกเขา
,มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะพัฒนาวิธีการตรวจสอบสถานะของตน /
ความอุดมสมบูรณ์เนื้องอกในตัวอย่าง [ 11 ] เช่นเดียวกับประสิทธิภาพ
เซลล์ต้นกำเนิดการตัวแทน สเต็มเซลล์เซลส์มีรู้จัก
ลักษณะ เช่น ความสามารถของตนเองต่ออายุ , ความสามารถในการก่อให้เกิดชนิด
เซลล์ต่าง ๆและการแสดงออกของโมเลกุลเครื่องหมาย เช่น
เนสติน cd133 sox2 , และ .เซลล์เหล่านี้จะยังสามารถสร้างประชากรเซลล์แตกต่างกัน
คล้ายกับเนื้องอกที่เป็นต้นฉบับ เมื่อ
ย้ายไปนู้ดหนู ที่สุดคุณสมบัติเหล่านี้ แต่ไม่ได้
คุณลักษณะพิเศษของ CSC และไม่ได้ให้กลยุทธ์ที่เชื่อถือได้
การศึกษาความอุดมสมบูรณ์ [ 12 ] ในการศึกษาครั้งนี้เราขอแนะนำการใช้ฟูเรียร์ Infrared ( FTIR )

microspectroscopy เป็นทางเลือกวิธีการค้นหาความแตกต่างเล็กระหว่างเซลส์เซลส์เซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์โดยไม่ต้องคุณสมบัติ
เซลล์ต้นกำเนิดและเพื่อประเมินเนื้อหาของ

cscs ในตัวอย่างเดียวกัน fitr เป็นป้ายที่มีชื่อเสียงฟรีวิเคราะห์วิธีการ
การวิเคราะห์ตัวอย่างทางชีวภาพ [ 13 ] มันมีความแตกต่างกันการแก้ไขข้อมูล
ต่อองค์ประกอบและโครงสร้างที่เกี่ยวข้องมากที่สุด biomacromolecules
[ 14 ]ละเอียดของโหมดการสั่นโดย inducing
ตัวอย่างความเสียหาย [ 15 ] ในทศวรรษที่ผ่านมา ความก้าวหน้าในเทคโนโลยีตรวจจับ
[ 16 ] [ 17 ] และแหล่งความสว่างได้ทำให้มันเป็นไปได้ที่จะแสดง
การวิเคราะห์เซลล์เดียวที่ให้ลักษณะที่ดีของพันธุ์

เซลล์ประชากร หัวข้อของการเปลี่ยนสภาพของเซลล์ได้ถูกศึกษาโดยใช้ระบบที่แตกต่างกัน (
[ 18,19,20,21,22 ]อย่างไรก็ตาม แต่ละแห่งตรวจสอบ
ตัวอย่าง ( เนื้อเยื่อชนิด เซลล์ที่แตกต่างกัน biochemically : ไขมัน
เซลล์มีการสะสมของไตรกลีเซอร์ไรด์ ในเซลล์ตับและเซลล์กล้ามเนื้อ
มีระดับสูงของไกลโคเจนในเซลล์ของสมองโดยทั่วไปองค์ประกอบไขมัน
ต่างกับเซลล์อื่น ๆ และคณะแสดง
โปรตีนคือ ที่แตกต่างกันสำหรับแต่ละ ดังนั้นเครื่องหมายของอินฟราเรดสเปกตรัมภูมิภาคที่สามารถแยกสเต็มเซลล์

คนที่แตกต่างจากเซลส์อาจจะแตกต่างจากที่เคยระบุไว้ในเซลล์อื่น ๆ
.
ในงานนี้ มีรายงานการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบทางชีวเคมีที่
เกิดขึ้นในระหว่างการ nch421k เป็นเซลส์แบบเซลล์ต้น

โดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก ( PCA ) ที่เราระบุไว้ชัดเจน
ลายเซ็นของความแตกต่างและมีผลต่อโปรตีน lipidome โปรไฟล์มือถือ
, แต่นอกจากนี้ ขอบเขตของโปรตีน และไกลโคเจน กรุงเทพมหานคร ระดับเซลล์ได้

นอกจากนี้ เราได้ทดสอบความสามารถของเทคนิคการประเมิน
เนื้อหาต้นเช่นเซลล์ในตัวอย่างที่แตกต่างกันแสดง
ทำนายความสามารถของเทคนิค และศักยภาพในการวินิจฉัย
.
2วัสดุและวิธีการ
2.1 . เซลล์และความแตกต่าง
nch421k เซลล์เป็นเซลส์สเต็มเซลล์แบบ ซื้อมาจาก CLS
เซลล์บริการและพัฒนาเป็นลอย neurospheres ใน dmem / F12
เติม 0.25 % BSA , 1% , 20 ng / ml epidermal growth factor
20 ng / ml การพัฒนาปัจจัยพื้นฐานลาสท์ที่ 37 ° C
5% CO2 ในบรรยากาศ ( เซลล์ควบคุมจากที่นี่ ) เซลล์ถูกตรวจ
passaged ทุก 4 วัน ความแตกต่างของการเป็น neurospheres
อธิบายโดยโพส [ 10 ] โดยการเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเดียวกัน
FBS 10 % และ 10 nm atra 72 H ( ภัทรที่แตกต่างจาก
ที่นี่ ) ตามขั้นตอนการกระจาย วัฏจักรของเซลล์ , PI staining แสดง
ตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [ 23 ] .
2.2 . ตัวอย่างการเตรียม
จากเซลล์ควบคุม ( neurospheres ) ระงับเซลล์เดียวที่เตรียมไว้
ภัทรจากเซลล์ถูกแทนโดยเก็บ trypsinization .
แต่ละตัวอย่างถูกล้างในสารละลายทางสรีรวิทยาและแบ่งออกเป็นสอง
ส่วนหนึ่งสำหรับการวิเคราะห์ microspectroscopy FTIR และอีกขนาน
ถ้า WB หรือ PCR .
2.3 RNA PCR
แยกใช้ isol RNA การสลายสารเคมีตามคําแนะนําของผู้ผลิต ( 5prime )
2 μกรัมของ RNA คือการทับศัพท์
วิธีใช้วิธีเก็บ Kit ( Applied Biosystems ) ระดับการแสดงออกของ gfap เนสติน
, , และ cd133 บีตา - actin เช่นการควบคุมภายนอก
วัดโดยวิธี PCR ( biorad ) ใช้สีเขียว SYBR อาจารย์
ผสม ( biorad ) และต่อไปนี้ ไพรเมอร์คู่ ( ลำดับเลือก
จาก primerdepot NIH ) : gfap acagacttggtgtccaggct F : R :
gagatcgccacctacaggaa ; F : R : gggagttctcagcctccag เนสติน ggagaaacagggcctacaga cd133
; F :gcattggcatcttctatggtt , R :
cgccttgtccttggtagtgt และบีตา - actin ccttgcacatgccggag F : R :
gcacagagcctcgcctt . เงื่อนไขคือ 50 ° C ) เป็นเวลา 2 นาที 95 องศา C
10 นาทีและ 45 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 1 นาที ; ข้อมูล
วิเคราะห์ข้อมูลโดยΔΔ CT ขั้นตอนวิธี
สถิติระหว่างนิพจน์ถูกกำหนดโดยสองหาง ) และนักศึกษา
P B อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับ . 05 คือการพิจารณาที่สำคัญ
2.4 .และ gfap cd133 immunofluorescent staining
เพื่อคำนวณหาค่าของความแตกต่างของเครื่องหมายเซลล์ การย้อมสี
gfap แอสโทรไซต์ cd133 สเต็มเซลล์ และเครื่องหมายแสดง .
staining คือใช้เซลล์แขวนลอยอยู่ในเซลล์เดียว เซลล์มี
แก้ไขแล้วใน 3.7 % พาราฟอร์มาลดิไฮด์ ถูกบล็อกในประเทศ 4 % และบ่ม
ในการป้องกัน gfap แอนติบอดีหลัก ( โนวัส ทุกอย่างในประเทศร้อยละ 50 ,
PBS )สำหรับการบ่มแอนติบอดี เป็น cd133 ( miltenyi "
, ) ก่อนการตรึง . หลังจากนั้นเซลล์ก็บ่มใน alexa488
ป้องกันกระต่าย ( Invitrogen โมเลกุลโพรบ 1:300 , ) และนิวเคลียสมี counterstained
กับ toto3 ( Invitrogen โมเลกุลโพรบ 1:5000 , ) รูปภาพของ
อย่างน้อย 200 เซลล์ได้มาใช้ Zeiss และด้วยกล้องจุลทรรศน์
510 เมตาและร้อยละของความแตกต่าง เซลล์มีค่าเป็นบวกเมื่อเทียบกับ gfap
จำนวนเซลล์ทุกเซลล์ คราบ toto3 .
2.5 ( การประเมิน
v staining ของเซลล์ที่ใช้ตรวจจับระยะแรกของการตาย . สำหรับ
ควบคุมบวก เซลล์จะถูกกับ 10 μ M อื่นๆ 4 H .
ควบคุมและเซลล์อื่นๆ ภัทรถูกล้างใน PBS และ
resuspended ในของเซลล์ V ผูกบัฟเฟอร์ : 10 มิลฮีเปส , pH 7.4
ขนาด 140 มม. และผลิต 2.5 มิลลิเมตร ย้อมได้ปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ให้ ( ยา ) และ 10 , 000 เซลล์มาวิเคราะห์
บน facscalibur ( เบคตอน Dickinson ) โดยใช้ซอฟต์แวร์ cellquestpro .