that form stable monomers is desire

that form stable monomers is desired, this can for example be achieved by fusing respective oligomerization domains such as jun-fos domains หรือ leucin-zippers to มิวทีน of the การเปิดเผย หรือ by the use of "Duocalins" (see also below).

A tear ไลโปคาลิน มิวทีน according to the present การเปิดเผย can be obtained by means of การก่อกลายพันธุ์ of a naturally occurring form of human tear ไลโปคาลิน. The term "การก่อกลายพันธุ์" ตามที่ใช้ในที่นี้ means that the experimental conditions are chosen such that the amino acid naturally occurring at a given sequence position of ไลโปคาลินนุนุ (Swiss• Prot data bank entry P31025) can be substituted by at least one amino acid that is not present at this specific position in the respective natural โพลีเปปไทด์ sequence. The term "การก่อกลายพันธุ์" also รวมถึง the (additional) modification of the length of sequence segments
by deletion หรือ insertion of one หรือ more amino acids. Thus, it is within the scope of the การเปิดเผย that, for example, one amino acid at a chosen sequence position is replaced by a stretch of three random mutations, leading to an insertion of two amino acid เรซิดิว compared to the length of the respective segment of the wild type protein. Such an insertion หรือ deletion may be introduced independently from each other in any of the peptide segments that
can be เป้าหมายed to การก่อกลายพันธุ์ in the การเปิดเผย. In one exemplary embodiment of the

การเปิดเผย, an insertion of several mutations may be introduced into the loop AB of the chosen ไลโปคาลิน scaffold (cf. PCT publication WO 2005/019256 which is incorporatedby reference in its entiretyherein). The term "random การก่อกลายพันธุ์" means that no predetermined single amino acid (mutation) is present at a certain sequence position but that at least two amino acids can be incorporated with a certain probability at a predefined sequence position during การก่อกลายพันธุ์.

[0065] The coding sequence of ไลโปคาลินนุนุ (Redl, B. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 20282-20287) is used as a starting point for the การก่อกลายพันธุ์ of the peptide segments selected in the present การเปิดเผย. For the การก่อกลายพันธุ์ of the recited amino acid positions, the person skilled in the art has at his disposal the various established standard methods for ตำแหน่ง-directed การก่อกลายพันธุ์. A commonly used technique is the introduction of mutations by means of PCR (polymerase chain reaction) using ของผสม of synthetic oligonucleotides, which bear a degenerate base composition at the desired sequence positions. For example, use of the โคดอน NNK หรือ NNS (โดยที่ N = adenine, guanine, cytosine or
thymine; K = guanine หรือ thymine; S = adenine หรือ cytosine) allows incorporation of all 20

amino acids plus the amber stop โคดอน during การก่อกลายพันธุ์, whereas the โคดอน VVS (โดยที่

V = adenine, guanine หรือ cytosine) limits the number of possibly incorporated amino acids to

12, since it excludes the amino acids Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val from being incorporated into the selected position of the โพลีเปปไทด์ sequence; use of the โคดอน NMS (โดยที่ M =adenine หรือ cytosine), for example, restricts the number of possible amino acids to 11 at a selected sequence position since it excludes the amino acids Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val from being incorporated at a selected sequence position. Inthis respect it is noted that โคดอนs for other amino acids (than the regular 20 naturally occurring amino acids) such as selenoซิสเทอีน หรือ pyrrolysine can also be incorporated into a nucleic acid of a มิวทีน.
It is also possible, as described by Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498-500, หรือ Wang, L.,

and

• Schultz,


P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, to use "artificial" โคดอนs such as UAG which

are usually recognized as stop โคดอนs in order to insert other unusual amino acids, for example o-methyl-L-ไทโรซีน หรือ p-aminoฟีนิลอะลานีน.
[0066] The use of nucleotide building blocks with reduced base pair specificity, as for example inosine, 8-oxo-2'deoxyguanosine หรือ 6(2'-deoxy-,B-D-ribofuranosyl)-3,4-dihydro-8H• pyrimindo-1,2-oxazine-7-one (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), is another
option for the introduction of mutations into a chosen sequence segment.


[0067] A further possibility is the so-called triplet-การก่อกลายพันธุ์. This method uses ของผสม of different nucleotide triplets, each of which codes for one amino acid, for incorporation into the coding sequence (Virnekas B, et al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 5600-
5607).

[0068] One possible strategy for introducing mutations in the selected บริเวณs of the respective โพลีเปปไทด์s is based on the use of four oligonucleotides, each of which is partially derived from one of the corresponding sequence segments to be mutated. When synthesizing these oligonucleotides, a person skilled in the art can employ ของผสม of nucleic acid building blocks for the synthesis of those nucleotide triplets which correspond to the amino acid positions to be mutated so that โคดอนs encoding all natural amino acids randomly arise, which at last results in the generation of a ไลโปคาลิน peptide library. For example, the first oligonucleotide corresponds in its sequence - apart from the mutated positions - to the coding strand for the peptide segment to be mutated at the most N-terminal position of the ไลโปคาลิน โพลีเปปไทด์. Accordingly, the second oligonucleotide corresponds to the non-coding strand for the second sequence segment following in the โพลีเปปไทด์ sequence. The third oligonucleotide correspondsin turn to the coding strand for the corresponding third sequence segment. Finally, the fourth oligonucleotide corresponds to the non-coding strand for the fourth sequence segment. A polymerase chain reaction can be performed with the respective first and second oligonucleotide and separately, if necessary, with the respective third and fourth oligonucleotide.

[0069] The amplification products of both of these reactions can be combined by various known methods into a single nucleic acid that รวมถึง the sequence from the first to the fourth sequence segments, in which mutations have been introduced at the selected positions. To this end, both of the products can for example be เป้าหมายed to a new polymerase chain reaction using flanking oligonucleotides as well as one หรือ more mediator nucleic acid molecules, which contribute the sequence between the second and the third sequence segment. In the choice of the number and arrangement within the sequence of the oligonucleotides used for the การก่อกลายพันธุ์, the person skilled in the art has numerous alternatives at his disposal.
[0070] The nucleic acid molecules defined above can be connected by ligation with the missing 5'- and 3'-sequences of a nucleic acid encoding a ไลโปคาลิน โพลีเปปไทด์ and/or the เวกเตอร์, and can be cloned in a known host organism. A multitude of established procedures are available for ligation and cloning. For example, recognition sequences for restriction endonucleases also present in the sequence of the cloning เวกเตอร์ can be engineered into the sequence of the synthetic oligonucleotides. Thus, after amplification of the respective PCR product and enzymatic cleavage the resulting ชิ้นส่วนย่อย can be easily cloned using the corresponding recognition sequences.

[0071] Longer sequence segments within the gene coding for the protein selected for การก่อกลายพันธุ์ can also be เป้าหมายed to random การก่อกลายพันธุ์ via known methods, for example by use of the polymerase chain reaction under conditions of increased error rate, by chemical การก่อกลายพันธุ์ หรือ by using bacterial mutator strains. Such methods can also be used for further optimization of the target แอฟฟินิตี้ หรือ specificity of a ไลโปคาลิน มิวทีน. Mutations possibly occurring outside the segments of experimental การก่อกลายพันธุ์ are often tolerated หรือ can even prove to be advantageous, for example if they contribute to an improved folding efficiency หรือ folding stability of the ไลโปคาลิน มิวทีน.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แบบฟอร์มที่ monomers มั่นคงถูกต้อง นี้สามารถเช่นทำได้ โดยโดเมน oligomerization นั้น ๆ เช่น jun-fos โดเมนหรือ leucin-รูดซิปไปมิวทีนการเปิดเผยหรือโดยการใช้ "Duocalins" (ดูด้านล่างยัง)มิวทีนไลโปคาลินการฉีกขาดตามการเปิดเผยปัจจุบันได้ โดยการก่อกลายพันธุ์ไลโปคาลินน้ำตามนุษย์รูปแบบเกิดขึ้นตามธรรมชาติ หมายถึงตามที่ใช้ในที่นี้คำว่า "การก่อกลายพันธุ์" ที่จะเลือกเงื่อนไขทดลองที่สามารถใช้ทดแทนกรดอะมิโนธรรมชาติที่เกิดขึ้นที่ตำแหน่งที่กำหนดลำดับของไลโปคาลินนุนุ (Swiss• Prot ข้อมูลรายการบัญชีธนาคาร P31025) โดยกรดอะมิโนที่ไม่มีตำแหน่งเฉพาะในลำดับโพลีเปปไทด์ธรรมชาติที่เกี่ยวข้อง คำว่า "การก่อกลายพันธุ์" รวมถึงนอกจากนี้การปรับเปลี่ยนความยาวของลำดับส่วน (เพิ่มเติม)โดยการแทรกหรือการลบของกรดอะมิโนหนึ่งหรือเพิ่มเติม ดังนั้น ได้ภายในขอบเขตของการเปิดเผยว่า เช่น กรดอะมิโนหนึ่งที่ตำแหน่งลำดับท่านถูกแทนที่ ด้วยยืดของสามสุ่มกลายพันธุ์ นำไปสู่การแทรกเรซิดิวกรดอะมิโนสองเมื่อเทียบกับความยาวของส่วนต่าง ๆ ของโปรตีนชนิดป่า เช่นการแทรกหรือการลบอาจจะแนะนำอย่างเป็นอิสระจากกันในเพปไทด์ในส่วนที่ได้ เป้าหมายed กับการก่อกลายพันธุ์ในการเปิดเผย ในหนึ่งโทษศูนย์รวมแห่งการการเปิดเผย แทรกของกลายพันธุ์หลายอาจถูกนำเข้าสู่วง AB ของนั่งร้านไลโปคาลินท่าน (มัทธิว PCT ประกาศ WO 2005/019256 ซึ่งเป็นการอ้างอิง incorporatedby ใน entiretyherein ของ) คำว่า "การก่อกลายพันธุ์สุ่ม" หมายความ ว่า ไม่กำหนดไว้เดียวกรดอะมิโน (กลายพันธุ์) อยู่ในลำดับที่บางตำแหน่งแต่ว่า สามารถรวมกรดอะมิโนหนึ่งกับความในลำดับที่กำหนดไว้ล่วงหน้าตำแหน่งระหว่างการก่อกลายพันธุ์[0065] ลำดับรหัสของไลโปคาลินนุนุ (Redl, J. B. et al. (1992) Biol. Chem. 267, 20282-20287) ใช้เป็นจุดเริ่มต้นการก่อกลายพันธุ์ของเพปไทด์เซ็กเมนต์ที่เลือกในการเปิดเผยปัจจุบัน สำหรับการก่อกลายพันธุ์ตำแหน่งกรดอะมิโนอัล ผู้เชี่ยวชาญในศิลปะมีมา การก่อตั้งวิธีการมาตรฐานสำหรับกำกับตำแหน่งการก่อกลายพันธุ์ เทคนิคที่ใช้กันทั่วไปคือ การแนะนำของการกลายพันธุ์โดยวิธี PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส) ของผสม oligonucleotides สังเคราะห์ ที่หมีเป็นองค์ประกอบพื้นฐาน degenerate ที่ตำแหน่งลำดับที่ต้อง ใช้ ตัวอย่าง ใช้ออกเป็น NNK โคดอน NNS (โดยที่ N = adenine, guanine, cytosine หรือไทมีน K =ไทมีนหรือ guanine S = adenine หรือ cytosine) อนุญาตให้จดทะเบียนทั้งหมด 20กรดอะมิโนพลัสแอมเบอร์หยุดโคดอนระหว่างการก่อกลายพันธุ์ ในขณะที่โคดอน VVS (โดยที่V = adenine, guanine หรือ cytosine) จำกัดจำนวนกรดอะมิโนเรทอาจจะ12 เนื่องจากมันแยกกรดอะมิโน Cys เมา ลือ Met เพ Trp, Tyr วาลจากถูกรวมเข้าไปในตำแหน่งที่เลือกลำดับโพลีเปปไทด์ ใช้โคดอน NMS (โดยที่ M = adenine หรือ cytosine), เช่น จำกัดจำนวนกรดอะมิโนได้ 11 ที่ตำแหน่งลำดับที่เลือก เพราะมันแยกกรดอะมิโนอาร์กิวเมนต์ของค่า Cys Gly เมา ลือ Met เพ,, Trp วาลจากกำลังรวมที่ตำแหน่งลำดับที่เลือก เคารพ inthis ตั้งข้อสังเกตว่า การ โคดอนs สำหรับกรดอะมิโนอื่น ๆ (กว่าปกติ 20 เกิดขึ้นตามธรรมชาติกรดอะมิโน) เช่น selenoซิสเทอีน หรือ pyrrolysine ยังสามารถรวมเข้าไปในกรดนิวคลีอิกของมิวทีนก็สามารถทำได้ ตามที่อธิบายไว้ โดยวัง L., et al. (2001) วิทยาศาสตร์ 292, 498-500 หรือวัง L. และ • Schultz P.G. (2002) Chem. สื่อสาร 1, 1-11 การใช้ โคดอนs "เทียม" เช่นสหภาพแรงงานซึ่ง มักจะรู้จักเป็น โคดอนs หยุดการใส่กรดอื่น ๆ อะมิโนผิดปกติ หรือเช่น o-methyl-L-ไทโรซีน p aminoฟีนิลอะลานีน [0066] นิวคลีโอไทด์ประกอบด้วยการใช้ลดลงคู่ฐาน specificity สำหรับตัวอย่าง inosine, 8-oxo-2' deoxyguanosine หรือ 6(2'-deoxy-,B-D-ribofuranosyl)-3, 4-dihydro-8H• pyrimindo-1, 2-oxazine-7-หนึ่ง (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), เป็นอีกตัวเลือกสำหรับบทนำของกลายพันธุ์เป็นเซ็กเมนต์ลำดับท่านสามารถเพิ่มเติมของ A [0067] จะเรียกว่า triplet การก่อกลายพันธุ์ วิธีนี้ใช้ของผสมของนิวคลีโอไทด์แตกต่าง triplets แห่งใดรหัสสำหรับกรดอะมิโนหนึ่ง การจดทะเบียนเป็นลำดับที่เจาะจง (Virnekas B, et al., (1994) กรดนิวคลีอิก Res 22, 5600 -5607)[0068] กลยุทธ์หนึ่งได้การแนะนำการกลายพันธุ์ใน บริเวณs เลือกของ โพลีเปปไทด์s เกี่ยวข้องจะขึ้นอยู่กับการใช้ oligonucleotides 4 ซึ่งบางส่วนมาจากหนึ่งเซ็กเมนต์ลำดับที่สอดคล้องกันเพื่อจะกลาย เมื่อสังเคราะห์ oligonucleotides เหล่านี้ ผู้เชี่ยวชาญในศิลปะสามารถใช้ของผสมของกรดนิวคลีอิกประกอบสำหรับสังเคราะห์ triplets ที่นิวคลีโอไทด์ซึ่งสอดคล้องกับตำแหน่งกรดอะมิโนจะสามารถกลายให้ โคดอนs เข้ารหัสกรดอะมิโนธรรมชาติทั้งหมดได้เกิดขึ้น ซึ่งในผลลัพธ์สุดท้ายในการสร้างของไลบรารีเพปไทด์ไลโปคาลิน ตัวอย่าง oligonucleotide แรกตรงในลำดับของ - จากตำแหน่งกลาย - การเดอะสแตรนด์รหัสสำหรับเซ็กเมนต์ของเพปไทด์จะเป็นกลายที่สุด สถานี N ตำแหน่งของไลโปคาลินโพลีเปปไทด์ ตาม oligonucleotide สองสอดคล้องกับสาระไม่ได้เขียนโค้ดสำหรับเซ็กเมนต์ลำดับที่สองต่อไปนี้ในลำดับโพลีเปปไทด์ Correspondsin oligonucleotide สามเปิดเดอะสแตรนด์รหัสสำหรับบุคคลที่สามที่เกี่ยวข้องลำดับเซ็กเมนต์ สุดท้าย oligonucleotide สี่ตรงกับสาระไม่ได้เขียนโค้ดสำหรับเซ็กเมนต์ลำดับสี่ ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสสามารถดำเนิน oligonucleotide และสองตามลำดับ และ แยก ถ้าจำเป็น มี oligonucleotide สาม และสี่ตามลำดับนั้น[0069] ผลิตภัณฑ์ขยายของทั้งสองปฏิกิริยาเหล่านี้สามารถรวม โดยวิธีต่าง ๆ รู้จักเป็นกรดนิวคลีอิกเดียวที่รวมถึงลำดับแรกจากการสี่ลำดับส่วน การกลายพันธุ์ได้ถูกแนะนำตามตำแหน่งที่เลือกได้ เพื่อการนี้ ผลิตภัณฑ์ทั้งสองตัวได้ เป้าหมายed ใหม่พอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่โดยใช้ flanking oligonucleotides เป็นหนึ่งหรือเพิ่มเติมผู้ไกล่เกลี่ยกรดนิวคลีอิกโมเลกุล ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของลำดับที่สองและส่วนลำดับที่สาม เลือกหมายเลขและจัดเรียงในลำดับของ oligonucleotides ที่ใช้สำหรับการการก่อกลายพันธุ์ บุคคลผู้เชี่ยวชาญในศิลปะให้มีทางเลือกมากมายที่ [0070] โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่กำหนดข้างต้นสามารถเชื่อมต่อ ด้วยไข่ด้วยหายไป 5'-3 ลำดับของกรดนิวคลีอิกเข้าไลโปคาลินโพลีเปปไทด์หรือเวกเตอร์ และสามารถ cloned ในสิ่งมีชีวิตที่รู้จักโฮสต์ได้ หลากหลายของกระบวนการสร้างไข่และการโคลนได้ ตัวอย่าง ลำดับการรับรู้สำหรับ endonucleases ข้อจำกัดที่ยังอยู่ในลำดับของ cloning เวกเตอร์สามารถวิศวกรรมเป็นลำดับของ oligonucleotides สังเคราะห์ ดังนั้น หลังจากขยายผลิตภัณฑ์ PCR ตามลำดับและเอนไซม์ในระบบปริ ชิ้นส่วนย่อยผลสามารถจะง่าย ๆ cloned ใช้ลำดับที่การรับรู้ที่สอดคล้องกันส่วนลำดับยาว [0071] ภายในรหัสยีนสำหรับโปรตีนสำหรับการก่อกลายพันธุ์ยังได้ เป้าหมายed กับการก่อกลายพันธุ์สุ่มผ่านวิธีการทราบ โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสภายใต้เงื่อนไขของข้อผิดพลาดเพิ่มขึ้นอัตรา การก่อกลายพันธุ์เคมีหรือโดยการใช้สายพันธุ์แบคทีเรีย mutator นอกจากนี้ยังสามารถใช้วิธีดังกล่าวสำหรับการปรับเพิ่มเติมของ specificity หรือแอฟฟินิตี้เป้าหมายของไลโปคาลินมิวทีน มักจะมีอภัยโทษกลายพันธุ์อาจเกิดขึ้นภายนอกส่วนของการก่อกลายพันธุ์ทดลองหรือสามารถพิสูจน์ได้จะได้เปรียบ เช่นถ้าจะนำไปสู่การปรับปรุงพับประสิทธิภาพหรือเสถียรภาพของไลโปคาลินมิวทีนพับได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ที่โมโนเมอร์ที่มีเสถียรภาพรูปแบบที่เป็นที่ต้องการสามารถเช่นนี้ทำได้โดยการหลอมรวมโดเมน oligomerization ที่เกี่ยวข้องเช่นโดเมนมิถุนายน-เหลวไหลหรือ leucin-รูดซิปไปมิวทีนของการเปิดเผยหรือโดยการใช้ "Duocalins" (ดูด้านล่าง) . ฉีกไลโปคาลินมิวทีนไปตามการเปิดเผยในปัจจุบันสามารถหาได้โดยวิธีการของการก่อกลายพันธุ์ของรูปแบบที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติของการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลิน คำว่า "การก่อกลายพันธุ์" ตามที่ใช้ในที่นี้หมายความว่าเงื่อนไขการทดลองได้รับการแต่งตั้งดังกล่าวว่ากรดอะมิโนธรรมชาติที่เกิดขึ้นในตำแหน่งที่ลำดับที่กำหนดของไลโปคาลินนุนุ (สวิส• Prot ข้อมูลเข้าธนาคาร P31025) สามารถใช้แทนอย่างน้อยหนึ่งกรดอะมิโนที่ไม่ได้อยู่ในตำแหน่งนี้ในธรรมชาตินั้นโพลีเปปไทด์ลำดับ คำว่า "การก่อกลายพันธุ์" นอกจากนี้ยังรวมถึงนี้ (เพิ่มเติม) การปรับเปลี่ยนความยาวของส่วนลำดับโดยการลบหรือแทรกหนึ่งหรือกรดอะมิโนมากขึ้น ดังนั้นจึงเป็นที่อยู่ในขอบเขตของการเปิดเผยว่าสำหรับตัวอย่างเช่นหนึ่งในกรดอะมิโนในตำแหน่งที่ลำดับที่ได้รับการคัดเลือกจะถูกแทนที่ด้วยความกว้างของสามการกลายพันธุ์แบบสุ่มที่นำไปสู่การแทรกของสองกรดอะมิโนเรซิดิวเมื่อเทียบกับความยาว ของส่วนที่เกี่ยวข้องของโปรตีนชนิดป่า ดังกล่าวแทรกหรือลบอาจได้รับการแนะนำอย่างเป็นอิสระจากกันในส่วนใด ๆ ของเปปไทด์ที่สามารถเป็นเป้าหมายเอ็ดเพื่อการก่อกลายพันธุ์ในการเปิดเผย หนึ่งในศูนย์รวมที่เป็นแบบอย่างของการเปิดเผยการแทรกหลายกลายพันธุ์อาจจะนำเข้าสู่วง AB เลือกของไลโปคาลินนั่งร้าน (cf สิ่งพิมพ์ PCT WO 2005/019256 ซึ่งเป็น incorporatedby อ้างอิงใน entiretyherein ของมัน) คำว่า "สุ่มการก่อกลายพันธุ์" หมายความว่าไม่มีกรดอะมิโนเดียวที่กำหนดไว้ (กลายพันธุ์) มีอยู่ในตำแหน่งที่ลำดับที่หนึ่ง แต่อย่างน้อยก็สองกรดอะมิโนที่สามารถรวมกับความน่าจะเป็นหนึ่งในตำแหน่งที่ลำดับที่กำหนดไว้ล่วงหน้าในช่วงการก่อกลายพันธุ์ . [0065] ลำดับการเข้ารหัสของไลโปคาลินนุนุ (Redl บี et al. (1992) เจ Biol. Chem. 267, 20282-20287) ถูกนำมาใช้เป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการก่อกลายพันธุ์ ของกลุ่มเปปไทด์ที่เลือกไว้ในปัจจุบันการเปิดเผย สำหรับการก่อกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนตำแหน่งท่องคนที่มีทักษะในงานศิลปะได้ในการกำจัดของเขาต่าง ๆ ที่จัดตั้งขึ้นวิธีการมาตรฐานตำแหน่ง -directed การก่อกลายพันธุ์ เทคนิคที่ใช้กันทั่วไปคือการแนะนำของการกลายพันธุ์โดยวิธีการของ PCR (วิธี polymerase chain reaction) โดยใช้ของผสมของ oligonucleotides สังเคราะห์ซึ่งแบกองค์ประกอบฐานที่เลวตำแหน่งลำดับที่ต้องการ ยกตัวอย่างเช่นการใช้งานของโคดอน NNK หรือ NNS (โดยที่ยังไม่มี = adenine, guanine cytosine หรือมีน; K = guanine หรือมีน; S = adenine หรือ cytosine) ช่วยให้การรวมตัวกันของทั้ง 20 กรดอะมิโนรวมทั้งหยุดสีเหลืองอำพันโคดอนในช่วง การก่อกลายพันธุ์ในขณะที่โคดอน VVS (โดยที่V = adenine, guanine หรือ cytosine) จำกัด จำนวนของนิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นอาจจะเป็นกรดอะมิโนที่จะ12 เพราะมันไม่รวมกรดอะมิโน Cys, Ile, Leu, Met, เพ Trp, เทอร์วาลจากการถูกรวมอยู่ในตำแหน่งที่เลือกของโพลีเปปไทด์ลำดับ; การใช้งานของโคดอน NMS (โดยที่ M = adenine หรือ cytosine) ตัวอย่างเช่นการ จำกัด จำนวนของกรดอะมิโนที่เป็นไปได้ถึง 11 ในตำแหน่งที่ลำดับที่เลือกเพราะมันไม่รวมกรดอะมิโน Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met , เพ Trp วาลจากการถูกรวมอยู่ในตำแหน่งที่ลำดับที่เลือก inthis เคารพเป็นที่สังเกตว่าโคดอนสำหรับกรดอะมิโนอื่น ๆ (กว่าปกติ 20 เกิดขึ้นตามธรรมชาติกรดอะมิโน) เช่น seleno ซิสเทอีนหรือ pyrrolysine ยังสามารถรวมอยู่ในกรดนิวคลีอิกของมิวทีน. มันเป็น ยังเป็นไปได้ตามที่อธิบายวังลิตร, et al (2001) วิทยาศาสตร์ 292, 498-500, หรือวังลิตรและ•ชูลท์ซ, PG (2002) เคมี การสื่อสาร 1, 1-11, การใช้ "เทียม" โคดอน s เช่น UAG ซึ่งได้รับการยอมรับมักจะเป็นหยุดโคดอนในการแทรกอื่นๆ กรดอะมิโนที่ผิดปกติเช่น o-methyl-L- ไทโรซีนหรือพีอะมิโน ฟีนิลอะลานีน. [0066] การใช้งานของกลุ่มอาคารที่เบื่อหน่ายกับความจำเพาะฐานคู่ลดเป็นเช่น inosine 8 โอเอ็กซ์โอ-2'deoxyguanosine หรือ 6 (2'-deoxy-, BD-ribofuranosyl) -3, 4 dihydro-8H • pyrimindo-1,2-oxazine-7-หนึ่ง (Zaccolo et al. (1996) เจ Mol. Biol. 255, 589-603) เป็นอีกหนึ่งตัวเลือกสำหรับการเปิดตัวของการกลายพันธุ์เป็นลำดับที่ได้รับการแต่งตั้งส่วน. [0067] ความเป็นไปได้ต่อไปคือสิ่งที่เรียกว่า triplet- การก่อกลายพันธุ์ วิธีนี้จะใช้ของผสมของแฝดเบื่อหน่ายที่แตกต่างกันซึ่งแต่ละรหัสสำหรับกรดอะมิโนหนึ่งสำหรับการรวมตัวเป็นลำดับการเข้ารหัส (Virnekas B, et al. (1994) กรดนิวคลีอิก Res 22 5600- 5607). [0068] หนึ่ง กลยุทธ์ที่เป็นไปได้สำหรับการแนะนำการกลายพันธุ์ในบริเวณ s เลือกของแต่ละโพลีเปปไทด์ s จะขึ้นอยู่กับการใช้งานของสี่ oligonucleotides แต่ละที่ได้มาบางส่วนจากหนึ่งในกลุ่มลำดับที่สอดคล้องกันที่จะกลายพันธุ์ เมื่อสังเคราะห์ oligonucleotides เหล่านี้เป็นคนที่มีฝีมือในงานศิลปะสามารถจ้างของผสมของหน่วยการสร้างกรดนิวคลีอิกสำหรับการสังเคราะห์ของบรรดาแฝดเบสซึ่งสอดคล้องกับตำแหน่งของกรดอะมิโนที่จะกลายพันธุ์เพื่อให้โคดอน s เข้ารหัสกรดอะมิโนจากธรรมชาติทั้งหมดสุ่มเกิดขึ้น ซึ่งผลสุดท้ายในรุ่นของไลโปคาลินห้องสมุดเปปไทด์ ยกตัวอย่างเช่น oligonucleotide แรกที่สอดคล้องตามลำดับของ - นอกเหนือจากตำแหน่งการกลายพันธุ์ - เพื่อสาระการเข้ารหัสสำหรับกลุ่มเปปไทด์ที่จะกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง N-ขั้วมากที่สุดของไลโปคาลินโพลีเปปไทด์ ดังนั้น oligonucleotide สองสอดคล้องกับสาระที่ไม่ได้เข้ารหัสสำหรับส่วนลำดับที่สองต่อไปนี้ในโพลีเปปไทด์ลำดับ oligonucleotide สาม correspondsin หันไปสาระการเข้ารหัสสำหรับส่วนลำดับที่สามที่สอดคล้องกัน ในที่สุด oligonucleotide สี่สอดคล้องกับสาระที่ไม่ได้เข้ารหัสสำหรับส่วนลำดับที่สี่ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์สามารถดำเนินการกับ oligonucleotide ที่หนึ่งและสองตามลำดับและแยกถ้าจำเป็นกับ oligonucleotide ที่สามและสี่ตามลำดับ. [0069] ผลิตภัณฑ์การขยายของทั้งสองปฏิกิริยาเหล่านี้สามารถนำมารวมกันโดยวิธีการที่รู้จักกันต่างๆเป็นนิวคลีอิกเดียว กรดที่รวมถึงลำดับจากครั้งแรกที่กลุ่มลำดับที่สี่ซึ่งในการกลายพันธุ์ที่ได้รับการแนะนำที่ตำแหน่งที่เลือก ด้วยเหตุนี้ทั้งสองผลิตภัณฑ์ที่สามารถยกตัวอย่างเช่นเป็นเป้าหมายเอ็ดไปปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอใหม่โดยใช้ oligonucleotides ขนาบข้างเช่นเดียวกับคนกลางหรืออื่น ๆ โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่มีส่วนร่วมระหว่างลำดับที่สองและส่วนลำดับที่สาม ในการเลือกของตัวเลขและการจัดการภายในลำดับของ oligonucleotides ที่ใช้สำหรับการก่อกลายพันธุ์คนที่มีทักษะในงานศิลปะมีทางเลือกมากมายในการกำจัดของเขา. [0070] โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่กำหนดไว้ข้างต้นสามารถเชื่อมต่อกันด้วย ligation กับ หายไป 5'- และ 3'-ลำดับของกรดนิวคลีเข้ารหัสไลโปคาลินโพลีเปปไทด์และ / หรือเวกเตอร์และสามารถโคลนในสิ่งมีชีวิตที่รู้จักกันเป็นเจ้าภาพ ความหลากหลายของขั้นตอนการจัดตั้งที่มีอยู่สำหรับ ligation และการโคลน ยกตัวอย่างเช่นลำดับการยอมรับสำหรับข้อ จำกัด endonucleases ยังอยู่ในลำดับของการโคลนเวกเตอร์ที่สามารถออกแบบเป็นลำดับของ oligonucleotides สังเคราะห์ ดังนั้นหลังจากการขยายของผลิตภัณฑ์ PCR ที่เกี่ยวข้องและความแตกแยกของเอนไซม์ที่เกิดชิ้นส่วนย่อยสามารถโคลนอย่างง่ายดายโดยใช้ลำดับการรับรู้ที่สอดคล้องกัน. [0071] อีกต่อไปส่วนลำดับภายในเข้ารหัสยีนของโปรตีนเลือกสำหรับการก่อกลายพันธุ์ยังสามารถเป็นเป้าหมาย เอ็ดจะสุ่มการก่อกลายพันธุ์ที่รู้จักกันผ่านทางวิธีการเช่นโดยการใช้วิธี polymerase chain reaction ภายใต้เงื่อนไขของอัตราความผิดพลาดที่เพิ่มขึ้นโดยทางเคมีการก่อกลายพันธุ์หรือโดยใช้สายพันธุ์แบคทีเรีย Mutator วิธีการดังกล่าวนอกจากนี้ยังสามารถนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพต่อไปของเป้าหมายแอฟฟินิตี้หรือความจำเพาะของไลโปคาลินมิวทีน การกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นอาจจะเป็นที่อยู่นอกกลุ่มทดลองการก่อกลายพันธุ์จะทนหรือมักจะสามารถพิสูจน์ให้เป็นประโยชน์เช่นถ้าพวกเขานำไปสู่การปรับปรุงประสิทธิภาพการพับหรือพับความมั่นคงของไลโปคาลินมิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ที่ฟอร์มคงที่แบบที่ต้องการ นี้สามารถทำได้โดยการรวม ตัวอย่างเช่นเช่น จุนเซชันโดเมนแต่ละโดเมนค็อค leucin FOS zippers เพื่อมิวทีนของค็อคการเปิดเผยโดยการใช้ " duocalins " ( ดูด้านล่าง ) .

น้ำตาไลโปคาลินมิวทีนตามการการเปิดเผยปัจจุบันสามารถหาได้โดยวิธีการของการก่อกลายพันธุ์ของธรรมชาติที่เกิดขึ้นไลโปคาลินฉีกรูปแบบของมนุษย์คำว่า " การก่อกลายพันธุ์ " ตามที่ใช้ในที่นี้หมายความว่าสภาวะการทดลองถูกเลือก เช่น กรดอะมิโนธรรมชาติที่เกิดขึ้นที่ระบุลำดับตำแหน่งของไลโปคาลินนุนุ ( สวิส - ก่อนธนาคารข้อมูลรายการ p31025 ) สามารถทดแทนโดยอย่างน้อยหนึ่งกรดอะมิโนที่ไม่อยู่ในตำแหน่งนี้ที่เฉพาะเจาะจงในแต่ละธรรมชาติลำดับคำว่า " การก่อกลายพันธุ์ " ยังรวมถึง ( เพิ่มเติม ) ปรับเปลี่ยนความยาวของลำดับส่วน
โดยการลบค็อคแทรกหนึ่งค็อคอะมิโนมากกว่ากรด ดังนั้น มันอยู่ภายในขอบเขตของการเปิดเผยที่ , ตัวอย่างเช่น , หนึ่งในกรดอะมิโนที่เลือกลำดับตำแหน่งถูกแทนที่ด้วยยืดสามการกลายพันธุ์แบบสุ่มาไปแทรกสองกรดอะมิโนเรซิดิวเมื่อเทียบกับความยาวของส่วนที่เกี่ยวข้องของโปรตีนชนิดป่า เช่นการแทรกค็อคการลบอาจจะแนะนำโดยอิสระจากแต่ละอื่น ๆในใด ๆของเปปไทด์ที่สามารถเป้าหมาย
ส่วนเอ็ดการก่อกลายพันธุ์ในการเปิดเผย . หนึ่งในคุณสมบัติที่เป็นแบบอย่างของ

การเปิดเผย , การแทรกของการกลายพันธุ์ที่หลายอาจจะแนะนำเป็นวง AB ของเลือกไลโปคาลินนั่งร้าน ( CF . PCT สิ่งพิมพ์ wo 2005 / 019256 ซึ่งเป็น incorporatedby อ้างอิงใน entiretyherein )คำว่า " สุ่มการก่อกลายพันธุ์ " หมายความว่า ไม่กำหนด เดี่ยวกรดอะมิโน ( การกลายพันธุ์ ) อยู่ที่ตำแหน่งลำดับหนึ่ง แต่อย่างน้อยสองกรดอะมิโนที่สามารถรวมกับบางความน่าจะเป็นที่กำหนดลำดับตำแหน่งในช่วงการก่อกลายพันธุ์

[ 0065 ] รหัสลำดับของไลโปคาลินนุนุ ( เรเดิล พ. et al . ( 1992 ) เจ วท บ วท .เคมี 267 20282-20287 ) ที่ใช้เป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการก่อกลายพันธุ์ของเปปไทด์ในกลุ่มที่เลือกการเปิดเผยปัจจุบัน สำหรับการก่อกลายพันธุ์เป็นตำแหน่งของกรดอะมิโน , บุคคลที่มีฝีมือในศิลปะได้จัดสร้างมาตรฐานต่าง ๆในวิธีที่ตำแหน่งการก่อกลายพันธุ์ .เป็นเทคนิคที่ใช้กันทั่วไปเป็นเบื้องต้นของการกลายพันธุ์โดยวิธี PCR ( ปฏิกิริยาลูกโซ่ ) ใช้ของผสมของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ ที่เป็นองค์ประกอบในการแบกฐานที่ต้องการลำดับตำแหน่ง เช่น ใช้ของโคดอน nnk ค็อค nns ( โดยที่ n = และเสียงกรอบแกรบ , ไซโตซีนหรือ
05 , K = เสียงกรอบแกรบค็อค thymine ;S = เพศตรงข้ามค็อคย้ายถิ่น ) ช่วยประสานทั้งหมด 20

กรดอะมิโนบวกแอมเบอร์หยุดโคดอนในระหว่างการก่อกลายพันธุ์ ส่วนโคดอน vvs ( โดยที่

V = และกัวนีนค็อค , ไซโตซีน ) จํากัดจํานวนอาจรวมกรดอะมิโน


12 เพราะมันยังไม่รวมภาวะกรดอะมิโน , ด้วย , ลู , พบ , เพ , TRP , tyr ,วาลจากถูกรวมอยู่ในการเลือกตำแหน่งของโพลีเปปไทด์ลำดับ ; ใช้ของโคดอน NMS ( โดยที่ M = เพศตรงข้ามค็อคย้ายถิ่น ) ตัวอย่างเช่น จำกัด จำนวนของกรดอะมิโนสามารถเลือกลำดับ 11 ตำแหน่ง ตั้งแต่มันยังไม่รวมกรดอะมิโน arg , ภาวะ GLY ด้วย , ลืม , พบ , เพ กวาลจากการรวมที่เลือกลำดับตำแหน่งมีความเคารพ มีข้อสังเกตว่าโคดอนสำหรับกรดอะมิโนอื่น ๆ ( กว่าปกติ 20 เกิดขึ้นตามธรรมชาติกรดอะมิโน ) เช่น seleno ซิสเทอีนค็อคไพโรไลซีนยังสามารถรวมอยู่ในกรดนิวคลีอิกของมิวทีน .
ก็เป็นไปได้ตามที่อธิบายไว้โดยหวัง , L . , et al . ( 2001 ) วิทยาศาสตร์ 292 , 498-500 ค็อค , วัง , และ L .






- ชูลท์ซ , PG ( 2002 ) เคมี เพราะว่า 1 , 1-11 ,ใช้ " ปัญญา " โคดอนเช่นอนุมัติซึ่ง

มักจะเป็นที่หยุดโคดอน s เพื่อใส่กรดอะมิโนอื่น ๆที่ผิดปกติ เช่น o-methyl-l - ไทโรซีนค็อค p-amino ฟีนิลอะลานีน .
[ 0066 ] การใช้ยีนสร้างบล็อกกับลดคู่เบสเฉพาะเจาะจงเป็นตัวอย่างอินโน 8-oxo-2'deoxyguanosine ค็อค , 6 ( 2 ' - ดีอ ซี - b-d-ribofuranosyl ) - 3บริการ 4-dihydro-8h pyrimindo-1,2-oxazine-7-one ( zaccolo et al . ( 1996 ) เจ. โมล วท บ วท . 255 , 589-603 ) เป็นอีกหนึ่งตัวเลือกสำหรับการแนะนำ
ของการกลายพันธุ์เป็นเลือกลำดับส่วน


[ 0067 ] อีกความเป็นไปได้คือที่เรียกว่าแฝดสาม - การก่อกลายพันธุ์ . วิธีนี้ใช้ของผสมแฝดของนิวคลีโอไทด์แตกต่างกัน ซึ่งรหัสสำหรับกรดอะมิโนสำหรับการเข้ารหัสลำดับ ( virnekas B , et al . ( 1994 ) กรดนิวคลีอิก RES 22 , 5600 -
5607 )

[ 0068 ] หนึ่งกลยุทธ์ที่เป็นไปได้แนะนำการกลายพันธุ์ในเลือกบริเวณของแต่ละโพลีเปปไทด์ s จะขึ้นอยู่กับการใช้สี่โอลิโกนิวคลีโอไทด์แต่ละที่ได้มาบางส่วน จากหนึ่งในที่ลำดับส่วนจะกลายพันธุ์เมื่อสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์เหล่านี้ คนที่มีฝีมือในศิลปะสามารถจ้างของผสมกรดนิวคลีอิกสร้างบล็อกสำหรับการสังเคราะห์ของนิวคลีโอไทด์ แฝด ซึ่งสอดคล้องกับตำแหน่งของกรดอะมิโนจะกลายพันธุ์เพื่อให้โคดอน s เข้ารหัสทั้งหมดธรรมชาติกรดอะมิโนสุ่มเกิดขึ้น ซึ่งในที่สุดผลในรุ่นของไลโปคาลินเปปไทด์ห้องสมุด ตัวอย่างเช่นที่แรก ซึ่งสอดคล้องกับลำดับของมัน นอกเหนือจากตำแหน่งกลายพันธุ์ - การเขียนกลุ่มสาระกลุ่มเปปไทด์จะกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งกรดอะมิโนส่วนใหญ่ของไลโปคาลินโพลีเปปไทด์ . ตาม , ซึ่งสอดคล้องกับไม่สาระที่สองนะครับสำหรับส่วนต่อไปนี้ในโพลีเปปไทด์ลำดับสองลำดับการ correspondsin ซึ่งสามเปิดรหัสกลุ่มสาระที่ส่วนลำดับสาม ในที่สุด ซึ่งสอดคล้องกับที่ไม่ใช่รหัส 4 กลุ่มสาระกลุ่มลำดับ 4 มีการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส สามารถดำเนินการกับแต่ละตัวแรกและตัวที่สอง ซึ่งแยกกัน ถ้าจำเป็นด้วย ซึ่งสามและสี่นั้น .

[ 0069 ] โดยการเพิ่มผลิตภัณฑ์ของทั้งสองปฏิกิริยาสามารถรวมโดยวิธีการต่าง ๆ ที่รู้จักกันเป็นเดียวที่รวมถึงกรดนิวคลีอิกลำดับจากลำดับแรกสี่ส่วนซึ่งในการกลายพันธุ์ที่ได้รับการแนะนำในการเลือกตำแหน่ง จบเรื่องนี้ทั้งสองผลิตภัณฑ์ที่สามารถยกตัวอย่างได้เป้าหมายเอ็ดใหม่การใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้ flanking โอลิโกนิวคลีโอไทด์เป็นหนึ่งค็อคคนกลางมากกว่ากรดนิวคลีอิกโมเลกุล ซึ่งมีส่วนช่วยดับระหว่างสองและส่วนลำดับสามในทางเลือกของจำนวนและการจัดเรียงในลำดับของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ใช้สำหรับการก่อกลายพันธุ์ บุคคลที่มีฝีมือในศิลปะมีหลายทางเลือกที่พักของเขา
[ 0070 ] กรดนิวคลีอิกโมเลกุลที่กำหนดข้างต้น สามารถเชื่อมโดย Ligation กับหายไป 5 ' และ 3 ' - ลำดับของกรดนิวคลีอิกการเข้ารหัสไลโปคาลินโพลีเปปไทด์และ / หรือเวกเตอร์และสามารถโคลนในจักโฮสต์ระบบสิ่งมีชีวิต ความหลากหลายของวิธีการที่ใช้ได้สำหรับก่อตั้ง Ligation และโคลน . ตัวอย่างเช่นการรู้ลำดับสำหรับการสงบเงียบยังมีอยู่ในลำดับของการโคลนเวกเตอร์สามารถวางแผนในการเรียงลำดับของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ ดังนั้น หลังจากการขยายของแต่ละผลิตภัณฑ์ และเอนไซม์ ซึ่งความแตกแยกที่เกิดชิ้นส่วนย่อยสามารถได้อย่างง่ายดายสามารถใช้ลำดับการรับรู้ตรงกัน

[ 0071 ] ยาวลำดับส่วนภายในยีนรหัสสำหรับโปรตีนที่การก่อกลายพันธุ์ยังสามารถเป้าหมายเอ็ดสุ่มการก่อกลายพันธุ์ผ่านวิธีการที่รู้จักกัน เช่น โดยการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส ภายใต้เงื่อนไขที่เพิ่มขึ้นของอัตราความผิดพลาดโดยค็อคการก่อกลายพันธุ์เคมีด้วย mutator แบคทีเรียสายพันธุ์วิธีนี้ยังสามารถใช้สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพเพิ่มเติมของเป้าหมายแอฟฟินิตี้ค็อคความจำเพาะของไลโปคาลินมิวทีน . การกลายพันธุ์อาจเกิดขึ้นนอกกลุ่มของการก่อกลายพันธุ์ทดลองมักจะยอมรับค็อคสามารถพิสูจน์ให้เป็นประโยชน์ตัวอย่างเช่นถ้าพวกเขาจะช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการพับพับค็อคเสถียรภาพของไลโปคาลิน
มิวทีน .