- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and methods2.1. Materi
2. Materials and methods
2.1. Materials and reagents
Fresh red peppers (red ripe fruits of capsicum annuum L) were
purchased in September 25, 2012 from the local vegetable e market
located in Hunan Agricultural University. They were packaged in
polyethylene bags and stored in a refrigerator (4 C) prior to
extraction. Each 100 g pericarp (after removal of seeds and stalk) of
FRP contained 24.7 mg capsaicinoids and 439.2 mg carotenoids.
Capsaicin (98%, Sigma company, America). b-carotene (90%
(HPLC), Chengdu Mansite company, China). Ethanol, n-hexane,
acetone, ethyl acetate were of analytical grade and purchased from
local chemical company (Changsha, China). Re-distilled water was
used for the preparation of all solutions and dilutions.
2.2. Stage extraction process of capsaicinoids and red pigments
from FRPs
2.2.1. The total procedures
The pretreatment of FRPs was carried out as follows. The sarcocarp
was obtained by weeding out the stalk and seeds from FRPs.
Then the sarcocarp of peppers was cut up into small pieces of
2 2 mm approximately.
For optimizing the conditions of stage extraction, 10 g of FRPs
sarcocarp were put into a 100 mL glass flask and were immersed in
extractive solvent for 30 min. Then they were extracted by heat
refluxing extraction. The procedures of stage extraction were
shown in Fig. 1.
2.2.2. Optimizing extraction process
Effect of some extractive conditions on yield of capsaicinoids
and red colorants was firstly investigated by single-factor experiments,
respectively. These conditions, including the ratio of solvent
to material (2, 3, 4, 5, 6 mL/g), the temperature of water bath (50,
60, 70, 80, 90 C) and time of extraction (60, 90, 120, 150, 180 min),
were same at two different stages: the removal stage of capsaicinoids
or extraction stage of red pigments. But, the concentration
of ethanol aqueous was different at above two stages. For
removal of capsaicinoids, the concentration of ethanol was set as
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% (v/v). Meanwhile, it was set as
60%, 70%, 80%, 90%, 95% (v/v) for the stage of extraction of red
pigments.
Then, orthogonal experimental designs were used to optimize
the extractive conditions at both of extraction stages, respectively.
Four different parameters of extraction and three levels for each
were studied by the orthogonal array designs of L9(34) and nine
combinations of extraction conditions with different parameters
were established at both of extraction stages (Table 1).
Every extractive solution was collected and evaporated to dry at
40 C under reduced pressure with a rotary evaporator, respectively.
The residues obtained were dissolved with 20 mL solventand centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Each solution was
collected and diluted with homologous solvent to a constant volume
for analysis. The solvent used was methanol for capsaicinoids
analysis, while acetone for red pigments analysis. HPLC analysis
was used for capsaicinoids, while colorimetric analysis for red
pigments.
2.3. Stage extraction of capsaicinoids and red pigments,
respectively, from FRPs
2.3.1. Effect of extraction times on the yield of capsaicinoids and red
pigments
Ten grams of pepper sarcocarp with 40 mL of 50% ethanol
aqueous were refluxed at 90 C of water bath in 2 h. Then the
extracted solution was collected and the residues were again
extracted with the same conditions until the capsaicinoids were
exhausted. Each solution was used to analyze the content of capsaicinoids
by HPLC.
Then red pigments were further extracted from the residues
after extracting capsaicinoids from 10 g starting material with
40 mL of 95% ethanol for 2 h at 90 C of water bath. The extracted
solution was collected and the residues were again extracted with
the same conditions until the red pigments were exhausted. Each
solution was collected, respectively, and used to determine the
absorbance by spectrophotometric analysis.
2.3.2. Thrice replicates for extraction of capsaicinoids and red
pigments
Thrice replicates were carried out as same as the Section 2.3.1,
but the extraction times were twice for each stage.
2.4. Extraction process of capsaicinoids and red pigments from
DRPs
The dried red peppers (DRPs) were obtained by desiccating FRPs
(whole pods) under solar light (the temperature about 20e28 C,
8 h 10 days) or under 50 C (for 8 h 3 days) in an electrothermal
drying oven to constant weight. Then the pericarp were collected
and crushed to a homogeneous size in a mill, sieved through a
No.40 mesh.
The simulative industrial extraction process of red pigmentswas
carried out mainly according to the references (Bae, Jayaprakasha,
Jifon, & Patil, 2012; Sang, Jiang, & Yu, 2008). The detail methods
were as follows. An amount of 0.9 g powders of DRPs (equivalent to
10 g of FRPs) was loaded into a Soxhlet extractor and then was
extracted using hexane 150 mL for 6 h. The extracted solution was
collected and evaporated to dry under reduced pressure with a
rotary evaporator at 35 C. A oleoresin containing red pigments and
pungent substance was obtained.
2.5. Analysis
2.5.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The samples of capsaicinoids were analyzed by highperformance
liquid chromatography (HPLC) on Agilent 1200 HPLC
system composed of a quaternary pump with a degasser, a thermostatted
column compartment, a detector of a UV-detector (a
variable wavelength detector, VWD) and an autosampler and 1200
ChemStation software. The column used was an Agilent Eclipse
XDB-C18 column (250 mm 4.6 mm I.D., 5 mm), the mobile phase
was methanolewater (65:35, v/v) with flowrate at 0.8 mL/min. The
wavelength of UV detector was set at 280 nm and column temperaturewas
set at 35 C. All samples were filtered through 0.45 mm
membrane before HPLC analysis and the injection volume of sample
was 20 mL.Preparation of standard solution: An amount of 2.7 mg of
capsaicinwas accurately weighed and dissolved in 10 mL methanol.
The standard stock solution was diluted with methanol to appropriate
concentrations for the construction of calibration curves.
2.5.2. Quantification of red pigments
Test solution of pigment samples was determined by spectrophotometry
(National standards of People’s Republic of China,
2008; Tundis et al., 2012). The details were as follows: the
amount of 0.1 (0.0001) g samples was dissolved and diluted into
100 mL with acetone as a stock solution. Then the stock solution
was diluted into an appropriate concentration with acetone and the
absorbance of the diluted solutionwas measured against acetone at
460 nm by a spectrophotometer (Shimadzu UV1600). The content
of red pigments was expressed as the total content of carotenoids
using b-carotene equivalents in mg per g pericarp.
Standard solutionwas prepared as follows: An amount of 5.6 mg
of b-carotene was accurately weighed and dissolved in 50 mL
acetone. The standard stock solution was diluted with acetone to
appropriate concentrations for the construction of calibration
curves.
For determining the content of red colorant in FRP, the pericarp
after removal of seed and stalk were extracted with acetone until
the color was exhausted. The combined extracts were evaporated
to remove acetone and water (from FRP) under reduced pressure
with a rotary evaporator at 45 C. A residual cream was obtained.
Then it was dissolved with acetone into a determinate volume for
absorbance determination.
3. Results and discussion
3.1. Analysis
3.1.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The contents of capsaicinoids were analyzed by HPLC to evaluate
the extracted effect. The HPLC separation conditions including
the ratio of mobile phase (methanolewater) and flow rate were
firstly investigated and the satisfactory chromatographic conditions
were summarized in Section 2.5.1. The HPLC chromatograms
of standard compound (capsaicin) and the crude extract were
shown in Fig. 2, respectively.
2.1. Materials and reagents
Fresh red peppers (red ripe fruits of capsicum annuum L) were
purchased in September 25, 2012 from the local vegetable e market
located in Hunan Agricultural University. They were packaged in
polyethylene bags and stored in a refrigerator (4 C) prior to
extraction. Each 100 g pericarp (after removal of seeds and stalk) of
FRP contained 24.7 mg capsaicinoids and 439.2 mg carotenoids.
Capsaicin (98%, Sigma company, America). b-carotene (90%
(HPLC), Chengdu Mansite company, China). Ethanol, n-hexane,
acetone, ethyl acetate were of analytical grade and purchased from
local chemical company (Changsha, China). Re-distilled water was
used for the preparation of all solutions and dilutions.
2.2. Stage extraction process of capsaicinoids and red pigments
from FRPs
2.2.1. The total procedures
The pretreatment of FRPs was carried out as follows. The sarcocarp
was obtained by weeding out the stalk and seeds from FRPs.
Then the sarcocarp of peppers was cut up into small pieces of
2 2 mm approximately.
For optimizing the conditions of stage extraction, 10 g of FRPs
sarcocarp were put into a 100 mL glass flask and were immersed in
extractive solvent for 30 min. Then they were extracted by heat
refluxing extraction. The procedures of stage extraction were
shown in Fig. 1.
2.2.2. Optimizing extraction process
Effect of some extractive conditions on yield of capsaicinoids
and red colorants was firstly investigated by single-factor experiments,
respectively. These conditions, including the ratio of solvent
to material (2, 3, 4, 5, 6 mL/g), the temperature of water bath (50,
60, 70, 80, 90 C) and time of extraction (60, 90, 120, 150, 180 min),
were same at two different stages: the removal stage of capsaicinoids
or extraction stage of red pigments. But, the concentration
of ethanol aqueous was different at above two stages. For
removal of capsaicinoids, the concentration of ethanol was set as
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% (v/v). Meanwhile, it was set as
60%, 70%, 80%, 90%, 95% (v/v) for the stage of extraction of red
pigments.
Then, orthogonal experimental designs were used to optimize
the extractive conditions at both of extraction stages, respectively.
Four different parameters of extraction and three levels for each
were studied by the orthogonal array designs of L9(34) and nine
combinations of extraction conditions with different parameters
were established at both of extraction stages (Table 1).
Every extractive solution was collected and evaporated to dry at
40 C under reduced pressure with a rotary evaporator, respectively.
The residues obtained were dissolved with 20 mL solventand centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Each solution was
collected and diluted with homologous solvent to a constant volume
for analysis. The solvent used was methanol for capsaicinoids
analysis, while acetone for red pigments analysis. HPLC analysis
was used for capsaicinoids, while colorimetric analysis for red
pigments.
2.3. Stage extraction of capsaicinoids and red pigments,
respectively, from FRPs
2.3.1. Effect of extraction times on the yield of capsaicinoids and red
pigments
Ten grams of pepper sarcocarp with 40 mL of 50% ethanol
aqueous were refluxed at 90 C of water bath in 2 h. Then the
extracted solution was collected and the residues were again
extracted with the same conditions until the capsaicinoids were
exhausted. Each solution was used to analyze the content of capsaicinoids
by HPLC.
Then red pigments were further extracted from the residues
after extracting capsaicinoids from 10 g starting material with
40 mL of 95% ethanol for 2 h at 90 C of water bath. The extracted
solution was collected and the residues were again extracted with
the same conditions until the red pigments were exhausted. Each
solution was collected, respectively, and used to determine the
absorbance by spectrophotometric analysis.
2.3.2. Thrice replicates for extraction of capsaicinoids and red
pigments
Thrice replicates were carried out as same as the Section 2.3.1,
but the extraction times were twice for each stage.
2.4. Extraction process of capsaicinoids and red pigments from
DRPs
The dried red peppers (DRPs) were obtained by desiccating FRPs
(whole pods) under solar light (the temperature about 20e28 C,
8 h 10 days) or under 50 C (for 8 h 3 days) in an electrothermal
drying oven to constant weight. Then the pericarp were collected
and crushed to a homogeneous size in a mill, sieved through a
No.40 mesh.
The simulative industrial extraction process of red pigmentswas
carried out mainly according to the references (Bae, Jayaprakasha,
Jifon, & Patil, 2012; Sang, Jiang, & Yu, 2008). The detail methods
were as follows. An amount of 0.9 g powders of DRPs (equivalent to
10 g of FRPs) was loaded into a Soxhlet extractor and then was
extracted using hexane 150 mL for 6 h. The extracted solution was
collected and evaporated to dry under reduced pressure with a
rotary evaporator at 35 C. A oleoresin containing red pigments and
pungent substance was obtained.
2.5. Analysis
2.5.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The samples of capsaicinoids were analyzed by highperformance
liquid chromatography (HPLC) on Agilent 1200 HPLC
system composed of a quaternary pump with a degasser, a thermostatted
column compartment, a detector of a UV-detector (a
variable wavelength detector, VWD) and an autosampler and 1200
ChemStation software. The column used was an Agilent Eclipse
XDB-C18 column (250 mm 4.6 mm I.D., 5 mm), the mobile phase
was methanolewater (65:35, v/v) with flowrate at 0.8 mL/min. The
wavelength of UV detector was set at 280 nm and column temperaturewas
set at 35 C. All samples were filtered through 0.45 mm
membrane before HPLC analysis and the injection volume of sample
was 20 mL.Preparation of standard solution: An amount of 2.7 mg of
capsaicinwas accurately weighed and dissolved in 10 mL methanol.
The standard stock solution was diluted with methanol to appropriate
concentrations for the construction of calibration curves.
2.5.2. Quantification of red pigments
Test solution of pigment samples was determined by spectrophotometry
(National standards of People’s Republic of China,
2008; Tundis et al., 2012). The details were as follows: the
amount of 0.1 (0.0001) g samples was dissolved and diluted into
100 mL with acetone as a stock solution. Then the stock solution
was diluted into an appropriate concentration with acetone and the
absorbance of the diluted solutionwas measured against acetone at
460 nm by a spectrophotometer (Shimadzu UV1600). The content
of red pigments was expressed as the total content of carotenoids
using b-carotene equivalents in mg per g pericarp.
Standard solutionwas prepared as follows: An amount of 5.6 mg
of b-carotene was accurately weighed and dissolved in 50 mL
acetone. The standard stock solution was diluted with acetone to
appropriate concentrations for the construction of calibration
curves.
For determining the content of red colorant in FRP, the pericarp
after removal of seed and stalk were extracted with acetone until
the color was exhausted. The combined extracts were evaporated
to remove acetone and water (from FRP) under reduced pressure
with a rotary evaporator at 45 C. A residual cream was obtained.
Then it was dissolved with acetone into a determinate volume for
absorbance determination.
3. Results and discussion
3.1. Analysis
3.1.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The contents of capsaicinoids were analyzed by HPLC to evaluate
the extracted effect. The HPLC separation conditions including
the ratio of mobile phase (methanolewater) and flow rate were
firstly investigated and the satisfactory chromatographic conditions
were summarized in Section 2.5.1. The HPLC chromatograms
of standard compound (capsaicin) and the crude extract were
shown in Fig. 2, respectively.
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1. วัสดุและ reagentsพริกแดงสด (แดงสุกผลไม้ของ annuum พริกหวาน L) ได้ซื้อจากตลาดอีผักท้องถิ่นในวันที่ 25 กันยายน 2012ตั้งอยู่ในมหาวิทยาลัยเกษตรมณฑลหูหนาน พวกเขาได้บรรจุในถุงพลาสติก และเก็บในตู้เย็น (4 C) ก่อนสกัด Pericarp ละ 100 กรัม (หลังจากเอาเมล็ดและสาย) ของFRP ประกอบด้วย capsaicinoids 24.7 มิลลิกรัมและ carotenoids 439.2 มิลลิกรัมแคปไซซิน (98% บริษัทซิก อเมริกา) b-แคโรทีน (90%(HPLC), บริษัท Mansite เฉิงตู จีน) เอทานอล เอ็นเฮกเซนอะซิโตน เอทิล acetate ได้เกรดวิเคราะห์ และซื้อจากท้องถิ่นสารเคมีบริษัท (ฉางซา จีน) น้ำกลั่นอีกครั้งใช้สำหรับการจัดทำโซลูชั่นและ dilutions2.2 กระบวนการสกัดขั้น capsaicinoids และสีแดงจาก FRPs2.2.1.ขั้นตอนทั้งหมดPretreatment ของ FRPs ถูกดำเนินการดังนี้ Sarcocarpกล่าว โดย weeding สายและเมล็ดจาก FRPsแล้ว ถูกตัดค่า sarcocarp ของพริกเป็นชิ้นเล็ก ๆ2 2 มม.โดยประมาณเหมาะสมของขั้นตอนสกัด 10 กรัมของ FRPssarcocarp ใส่ไปเป็น 100 มลแก้วหนาว และได้สัมผัสตัวทำละลาย extractive สำหรับ 30 นาที จากนั้น จะถูกสกัด ด้วยความร้อนrefluxing สกัด ขั้นตอนในการแยกขั้นตอนแสดงใน Fig. 12.2.2 การเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการแยกผลของเงื่อนไขบาง extractive ผลตอบแทนของ capsaicinoidsและ colorants แดงถูกตรวจสอบ โดยการทดลองปัจจัยเดียว ประการแรกตามลำดับ เงื่อนไขเหล่านี้ รวมทั้งอัตราส่วนของตัวทำละลายกับวัสดุ (2, 3, 4, 5, 6 mL/g), อุณหภูมิของห้องน้ำ (5060, 70, 80, 90 C) และเวลาสกัด (60, 90, 120, 150, 180 นาที),มีเหมือนกันในขั้นตอนที่แตกต่างกันสอง: ขั้นตอนการเอาออกของ capsaicinoidsหรือแยกระยะของสีแดง แต่ ความเข้มข้นของเอทานอลสเอาท์แตกต่างกันที่เหนือขั้นที่สอง สำหรับเอา capsaicinoids ความเข้มข้นของเอทานอลถูกตั้งค่าเป็น10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% (v/v) ในขณะเดียวกัน ถูกตั้งค่าเป็น60%, 70%, 80%, 90%, 95% (v/v) ในขั้นตอนของการสกัดสีแดงเม็ดสีแล้ว แบบ orthogonal ทดลองใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพextractive เงื่อนไขที่ทั้งสองขั้นตอนสกัด ตามลำดับพารามิเตอร์ต่าง ๆ สี่แยกและสามระดับสำหรับแต่ละได้ศึกษา โดยออกแบบ orthogonal เรย์ของ L9(34) และเก้าชุดสกัดเงื่อนไขกับพารามิเตอร์ต่าง ๆได้ก่อตั้งขึ้นในทั้งสองขั้นตอนสกัด (ตาราง 1)รวบรวม และหายไปแห้งในทุกโซลูชั่น extractive40 C ภายใต้ลดความดันกับ evaporator โรตารี่ ตามลำดับตกได้ถูกส่วนยุบกับ solventand 20 mL centrifuged ใน 10 นาทีที่ 3000 รอบต่อนาที แต่ละวิธีรวบรวม และแตกออก ด้วยตัวทำละลาย homologous กับปริมาตรคงสำหรับการวิเคราะห์ ตัวทำละลายที่ใช้คือ เมทานอลสำหรับ capsaicinoidsการวิเคราะห์ ในขณะที่อะซีโตนสำหรับการวิเคราะห์สีแดง วิเคราะห์ HPLCใช้สำหรับ capsaicinoids ขณะวิเคราะห์เทียบเคียงสำหรับสีแดงเม็ดสี2.3. ระยะสกัด capsaicinoids และเม็ดสีแดงตามลำดับ จาก FRPs2.3.1. ผลของเวลาสกัดจากผลตอบแทนของ capsaicinoids และสีแดงเม็ดสีกรัม 10 ของ sarcocarp พริกไทย มี 40 mL ของเอทานอล 50%อควีถูก refluxed ที่ C 90 ของน้ำน้ำ 2 h นั้นโซลูชั่นแยกถูกรวบรวม และการตกค้างได้อีกสกัด ด้วยเงื่อนไขเดียวกันจนกว่า capsaicinoids ถูกหมด ใช้การวิเคราะห์เนื้อหาของ capsaicinoids แต่ละโซลูชั่นโดย HPLCแล้ว สีแดงถูกเพิ่มเติมแยกจากการตกค้างหลังจากแยก capsaicinoids จาก 10 กรัมวัสดุกับการเริ่มต้นมล.ที่ 40 ของเอทานอล 95% สำหรับ h 2 ที่ 90 C ของอ่างน้ำ การแยกโซลูชั่นรวบรวม และตกถูกสกัดอีกครั้งด้วยเงื่อนไขเดียวกันจนกว่าเม็ดสีแดงได้หมด แต่ละโซลูชันที่ถูกรวบรวม ตามลำดับ และใช้ในการกำหนดabsorbance โดยวิเคราะห์ spectrophotometric2.3.2. เลยเหมือนกับการสกัด capsaicinoids และสีแดงเม็ดสีเลยเหมือนกับถูกดำเนินการเช่นเดียวกับส่วน 2.3.1แต่เวลาแยกได้สองครั้งในแต่ละขั้นตอน2.4 กระบวนการสกัด capsaicinoids และสีแดงจากDRPsพริกแดงแห้ง (DRPs) ได้รับมา โดย desiccating FRPs(ทั้งฝัก) ภายใต้แสงอาทิตย์แสง (อุณหภูมิ 20e28 C เกี่ยวกับh 8 10 วัน) หรือต่ำกว่า 50 C (สำหรับวันที่ 3 h 8) ในการ electrothermalเตาอบแห้งน้ำหนักคง แล้ว pericarp ถูกเก็บรวบรวมและบดให้มีขนาดเหมือนในโรงสี sieved ผ่านการNo.40 ตาข่ายกระบวนการสกัดอุตสาหกรรม simulative pigmentswas สีแดงดำเนินการตามหลักการอ้างอิง (แบ้ JayaprakashaJifon, & ภา 2012 สังข์ เจียง & Yu, 2008) รายละเอียดวิธีการมีดังนี้ จำนวน 0.9 g ผงของ DRPs (เทียบเท่ากับ10 กรัมของ FRPs) ถูกโหลดเป็นระบาย Soxhlet และถูกแล้วสกัดโดยใช้เฮกเซน 150 mL สำหรับ 6 h วิธีแยกรวบรวม และหายไปแห้งภายใต้ลดความดันด้วยการevaporator โรตารี่ที่ 35 เซลเซียส Oleoresin ประกอบด้วยสีแดง และสารหอมฉุนถูกรับ2.5 การวิเคราะห์2.5.1 วิเคราะห์ HPLC capsaicinoidsตัวอย่างของ capsaicinoids ถูกวิเคราะห์ โดย highperformanceเหลว chromatography (HPLC) บน Agilent 1200 HPLCประกอบด้วยระบบปั๊ม quaternary กับ degasser, thermostatted เป็นคอลัมน์ช่อง จับของเป็น UV-เครื่องตรวจจับ (aตรวจจับความยาวคลื่นตัวแปร VWD) และ autosampler การและ 1200ChemStation ซอฟต์แวร์ คอลัมน์ที่ใช้ถูกคราส Agilentคอลัมน์ XDB C18 (250 mm ประชาชน 4.6 mm, 5 mm) ระยะเคลื่อนมี methanolewater (65:35, v/v) มี flowrate ที่ 0.8 mL/นาทีมีการตั้งค่าความยาวคลื่นของเครื่องตรวจจับ UV ที่ 280 nm และคอลัมน์ temperaturewasตั้ง 35 เซลเซียส ตัวอย่างทั้งหมดที่ถูกกรองผ่าน 0.45 มม.เมมเบรนก่อนวิเคราะห์ HPLC และปริมาณการฉีดตัวอย่างมี mL.Preparation ของสารละลายมาตรฐาน 20: จำนวน 2.7 มก.capsaicinwas อย่างหนัก และละลายในเมทานอล 10 มิลลิลิตรการแก้ปัญหาสินค้าคงคลังมาตรฐานถูกผสมกับเมทานอลเพื่อความเหมาะสมความเข้มข้นสร้างเทียบเส้นโค้ง2.5.2 การนับของสีแดงทดสอบการแก้ปัญหาของตัวอย่างผงถูกกำหนด โดย spectrophotometry(มาตรฐานของสาธารณรัฐประชาชนจีน2008 Tundis et al., 2012) รายละเอียดมีดังนี้: การจำนวน 0.1 (มาก 0.0001) ตัวอย่าง g ส่วนยุบ และทำให้เจือจางลงด้วยอะซิโตนเป็นโซลูชันหุ้น 100 มล การแก้ปัญหาสินค้าคงคลังแล้วถูกทำให้เจือจางในความเข้มข้นที่เหมาะสมด้วยอะซีโตนและวัด absorbance ของ solutionwas แตกออกกับอะซีโตนที่460 nm โดยเครื่องทดสอบกรดด่าง (Shimadzu UV1600) เนื้อหาของสีแดงถูกแสดงเป็นเนื้อหาทั้งหมดของ carotenoidsใช้เทียบเท่าบีแคโรทีนในมิลลิกรัมต่อกรัม pericarpSolutionwas มาตรฐานเตรียมพร้อมดังนี้: จำนวน 5.6 มิลลิกรัมของแคโรทีนบีอย่างหนัก และละลายใน 50 mLอะซิโตน การแก้ปัญหาสินค้าคงคลังมาตรฐานถูกผสมกับอะซีโตนเพื่อความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการก่อสร้างการปรับเทียบเส้นโค้งในการกำหนดเนื้อหาของ colorant แดงใน FRP, pericarpหลังจากเอาเมล็ดและสายถูกสกัด ด้วยอะซิโตนจนสีที่หมด สารสกัดรวมได้หายไปจะออกอะซีโตนและน้ำ (FRP) ภายใต้ความดันที่ลดลงกับ evaporator โรตารี่ที่ค. 45 ครีมส่วนที่เหลือได้รับแล้ว มันถูกส่วนยุบ ด้วยอะซีโตนในปริมาณ determinate สำหรับการวัด absorbance3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1 การวิเคราะห์3.1.1 วิเคราะห์ HPLC capsaicinoidsเนื้อหาของ capsaicinoids ถูกวิเคราะห์ ด้วย HPLC เพื่อประเมินผลแยก HPLC แยกเงื่อนไขรวมถึงอัตราส่วนของเฟสเคลื่อนที่ (methanolewater) และอัตราการไหลได้ก่อน สอบสวน และเงื่อนไข chromatographic น่าพอใจได้สรุปในส่วน 2.5.1 HPLC chromatogramsมาตรฐานทบ (แคปไซซิน) และสารสกัดหยาบได้แสดงใน Fig. 2 ตามลำดับ
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. Materials and methods
2.1. Materials and reagents
Fresh red peppers (red ripe fruits of capsicum annuum L) were
purchased in September 25, 2012 from the local vegetable e market
located in Hunan Agricultural University. They were packaged in
polyethylene bags and stored in a refrigerator (4 C) prior to
extraction. Each 100 g pericarp (after removal of seeds and stalk) of
FRP contained 24.7 mg capsaicinoids and 439.2 mg carotenoids.
Capsaicin (98%, Sigma company, America). b-carotene (90%
(HPLC), Chengdu Mansite company, China). Ethanol, n-hexane,
acetone, ethyl acetate were of analytical grade and purchased from
local chemical company (Changsha, China). Re-distilled water was
used for the preparation of all solutions and dilutions.
2.2. Stage extraction process of capsaicinoids and red pigments
from FRPs
2.2.1. The total procedures
The pretreatment of FRPs was carried out as follows. The sarcocarp
was obtained by weeding out the stalk and seeds from FRPs.
Then the sarcocarp of peppers was cut up into small pieces of
2 2 mm approximately.
For optimizing the conditions of stage extraction, 10 g of FRPs
sarcocarp were put into a 100 mL glass flask and were immersed in
extractive solvent for 30 min. Then they were extracted by heat
refluxing extraction. The procedures of stage extraction were
shown in Fig. 1.
2.2.2. Optimizing extraction process
Effect of some extractive conditions on yield of capsaicinoids
and red colorants was firstly investigated by single-factor experiments,
respectively. These conditions, including the ratio of solvent
to material (2, 3, 4, 5, 6 mL/g), the temperature of water bath (50,
60, 70, 80, 90 C) and time of extraction (60, 90, 120, 150, 180 min),
were same at two different stages: the removal stage of capsaicinoids
or extraction stage of red pigments. But, the concentration
of ethanol aqueous was different at above two stages. For
removal of capsaicinoids, the concentration of ethanol was set as
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% (v/v). Meanwhile, it was set as
60%, 70%, 80%, 90%, 95% (v/v) for the stage of extraction of red
pigments.
Then, orthogonal experimental designs were used to optimize
the extractive conditions at both of extraction stages, respectively.
Four different parameters of extraction and three levels for each
were studied by the orthogonal array designs of L9(34) and nine
combinations of extraction conditions with different parameters
were established at both of extraction stages (Table 1).
Every extractive solution was collected and evaporated to dry at
40 C under reduced pressure with a rotary evaporator, respectively.
The residues obtained were dissolved with 20 mL solventand centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Each solution was
collected and diluted with homologous solvent to a constant volume
for analysis. The solvent used was methanol for capsaicinoids
analysis, while acetone for red pigments analysis. HPLC analysis
was used for capsaicinoids, while colorimetric analysis for red
pigments.
2.3. Stage extraction of capsaicinoids and red pigments,
respectively, from FRPs
2.3.1. Effect of extraction times on the yield of capsaicinoids and red
pigments
Ten grams of pepper sarcocarp with 40 mL of 50% ethanol
aqueous were refluxed at 90 C of water bath in 2 h. Then the
extracted solution was collected and the residues were again
extracted with the same conditions until the capsaicinoids were
exhausted. Each solution was used to analyze the content of capsaicinoids
by HPLC.
Then red pigments were further extracted from the residues
after extracting capsaicinoids from 10 g starting material with
40 mL of 95% ethanol for 2 h at 90 C of water bath. The extracted
solution was collected and the residues were again extracted with
the same conditions until the red pigments were exhausted. Each
solution was collected, respectively, and used to determine the
absorbance by spectrophotometric analysis.
2.3.2. Thrice replicates for extraction of capsaicinoids and red
pigments
Thrice replicates were carried out as same as the Section 2.3.1,
but the extraction times were twice for each stage.
2.4. Extraction process of capsaicinoids and red pigments from
DRPs
The dried red peppers (DRPs) were obtained by desiccating FRPs
(whole pods) under solar light (the temperature about 20e28 C,
8 h 10 days) or under 50 C (for 8 h 3 days) in an electrothermal
drying oven to constant weight. Then the pericarp were collected
and crushed to a homogeneous size in a mill, sieved through a
No.40 mesh.
The simulative industrial extraction process of red pigmentswas
carried out mainly according to the references (Bae, Jayaprakasha,
Jifon, & Patil, 2012; Sang, Jiang, & Yu, 2008). The detail methods
were as follows. An amount of 0.9 g powders of DRPs (equivalent to
10 g of FRPs) was loaded into a Soxhlet extractor and then was
extracted using hexane 150 mL for 6 h. The extracted solution was
collected and evaporated to dry under reduced pressure with a
rotary evaporator at 35 C. A oleoresin containing red pigments and
pungent substance was obtained.
2.5. Analysis
2.5.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The samples of capsaicinoids were analyzed by highperformance
liquid chromatography (HPLC) on Agilent 1200 HPLC
system composed of a quaternary pump with a degasser, a thermostatted
column compartment, a detector of a UV-detector (a
variable wavelength detector, VWD) and an autosampler and 1200
ChemStation software. The column used was an Agilent Eclipse
XDB-C18 column (250 mm 4.6 mm I.D., 5 mm), the mobile phase
was methanolewater (65:35, v/v) with flowrate at 0.8 mL/min. The
wavelength of UV detector was set at 280 nm and column temperaturewas
set at 35 C. All samples were filtered through 0.45 mm
membrane before HPLC analysis and the injection volume of sample
was 20 mL.Preparation of standard solution: An amount of 2.7 mg of
capsaicinwas accurately weighed and dissolved in 10 mL methanol.
The standard stock solution was diluted with methanol to appropriate
concentrations for the construction of calibration curves.
2.5.2. Quantification of red pigments
Test solution of pigment samples was determined by spectrophotometry
(National standards of People’s Republic of China,
2008; Tundis et al., 2012). The details were as follows: the
amount of 0.1 (0.0001) g samples was dissolved and diluted into
100 mL with acetone as a stock solution. Then the stock solution
was diluted into an appropriate concentration with acetone and the
absorbance of the diluted solutionwas measured against acetone at
460 nm by a spectrophotometer (Shimadzu UV1600). The content
of red pigments was expressed as the total content of carotenoids
using b-carotene equivalents in mg per g pericarp.
Standard solutionwas prepared as follows: An amount of 5.6 mg
of b-carotene was accurately weighed and dissolved in 50 mL
acetone. The standard stock solution was diluted with acetone to
appropriate concentrations for the construction of calibration
curves.
For determining the content of red colorant in FRP, the pericarp
after removal of seed and stalk were extracted with acetone until
the color was exhausted. The combined extracts were evaporated
to remove acetone and water (from FRP) under reduced pressure
with a rotary evaporator at 45 C. A residual cream was obtained.
Then it was dissolved with acetone into a determinate volume for
absorbance determination.
3. Results and discussion
3.1. Analysis
3.1.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The contents of capsaicinoids were analyzed by HPLC to evaluate
the extracted effect. The HPLC separation conditions including
the ratio of mobile phase (methanolewater) and flow rate were
firstly investigated and the satisfactory chromatographic conditions
were summarized in Section 2.5.1. The HPLC chromatograms
of standard compound (capsaicin) and the crude extract were
shown in Fig. 2, respectively.
2.1. Materials and reagents
Fresh red peppers (red ripe fruits of capsicum annuum L) were
purchased in September 25, 2012 from the local vegetable e market
located in Hunan Agricultural University. They were packaged in
polyethylene bags and stored in a refrigerator (4 C) prior to
extraction. Each 100 g pericarp (after removal of seeds and stalk) of
FRP contained 24.7 mg capsaicinoids and 439.2 mg carotenoids.
Capsaicin (98%, Sigma company, America). b-carotene (90%
(HPLC), Chengdu Mansite company, China). Ethanol, n-hexane,
acetone, ethyl acetate were of analytical grade and purchased from
local chemical company (Changsha, China). Re-distilled water was
used for the preparation of all solutions and dilutions.
2.2. Stage extraction process of capsaicinoids and red pigments
from FRPs
2.2.1. The total procedures
The pretreatment of FRPs was carried out as follows. The sarcocarp
was obtained by weeding out the stalk and seeds from FRPs.
Then the sarcocarp of peppers was cut up into small pieces of
2 2 mm approximately.
For optimizing the conditions of stage extraction, 10 g of FRPs
sarcocarp were put into a 100 mL glass flask and were immersed in
extractive solvent for 30 min. Then they were extracted by heat
refluxing extraction. The procedures of stage extraction were
shown in Fig. 1.
2.2.2. Optimizing extraction process
Effect of some extractive conditions on yield of capsaicinoids
and red colorants was firstly investigated by single-factor experiments,
respectively. These conditions, including the ratio of solvent
to material (2, 3, 4, 5, 6 mL/g), the temperature of water bath (50,
60, 70, 80, 90 C) and time of extraction (60, 90, 120, 150, 180 min),
were same at two different stages: the removal stage of capsaicinoids
or extraction stage of red pigments. But, the concentration
of ethanol aqueous was different at above two stages. For
removal of capsaicinoids, the concentration of ethanol was set as
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% (v/v). Meanwhile, it was set as
60%, 70%, 80%, 90%, 95% (v/v) for the stage of extraction of red
pigments.
Then, orthogonal experimental designs were used to optimize
the extractive conditions at both of extraction stages, respectively.
Four different parameters of extraction and three levels for each
were studied by the orthogonal array designs of L9(34) and nine
combinations of extraction conditions with different parameters
were established at both of extraction stages (Table 1).
Every extractive solution was collected and evaporated to dry at
40 C under reduced pressure with a rotary evaporator, respectively.
The residues obtained were dissolved with 20 mL solventand centrifuged for 10 min at 3000 rpm. Each solution was
collected and diluted with homologous solvent to a constant volume
for analysis. The solvent used was methanol for capsaicinoids
analysis, while acetone for red pigments analysis. HPLC analysis
was used for capsaicinoids, while colorimetric analysis for red
pigments.
2.3. Stage extraction of capsaicinoids and red pigments,
respectively, from FRPs
2.3.1. Effect of extraction times on the yield of capsaicinoids and red
pigments
Ten grams of pepper sarcocarp with 40 mL of 50% ethanol
aqueous were refluxed at 90 C of water bath in 2 h. Then the
extracted solution was collected and the residues were again
extracted with the same conditions until the capsaicinoids were
exhausted. Each solution was used to analyze the content of capsaicinoids
by HPLC.
Then red pigments were further extracted from the residues
after extracting capsaicinoids from 10 g starting material with
40 mL of 95% ethanol for 2 h at 90 C of water bath. The extracted
solution was collected and the residues were again extracted with
the same conditions until the red pigments were exhausted. Each
solution was collected, respectively, and used to determine the
absorbance by spectrophotometric analysis.
2.3.2. Thrice replicates for extraction of capsaicinoids and red
pigments
Thrice replicates were carried out as same as the Section 2.3.1,
but the extraction times were twice for each stage.
2.4. Extraction process of capsaicinoids and red pigments from
DRPs
The dried red peppers (DRPs) were obtained by desiccating FRPs
(whole pods) under solar light (the temperature about 20e28 C,
8 h 10 days) or under 50 C (for 8 h 3 days) in an electrothermal
drying oven to constant weight. Then the pericarp were collected
and crushed to a homogeneous size in a mill, sieved through a
No.40 mesh.
The simulative industrial extraction process of red pigmentswas
carried out mainly according to the references (Bae, Jayaprakasha,
Jifon, & Patil, 2012; Sang, Jiang, & Yu, 2008). The detail methods
were as follows. An amount of 0.9 g powders of DRPs (equivalent to
10 g of FRPs) was loaded into a Soxhlet extractor and then was
extracted using hexane 150 mL for 6 h. The extracted solution was
collected and evaporated to dry under reduced pressure with a
rotary evaporator at 35 C. A oleoresin containing red pigments and
pungent substance was obtained.
2.5. Analysis
2.5.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The samples of capsaicinoids were analyzed by highperformance
liquid chromatography (HPLC) on Agilent 1200 HPLC
system composed of a quaternary pump with a degasser, a thermostatted
column compartment, a detector of a UV-detector (a
variable wavelength detector, VWD) and an autosampler and 1200
ChemStation software. The column used was an Agilent Eclipse
XDB-C18 column (250 mm 4.6 mm I.D., 5 mm), the mobile phase
was methanolewater (65:35, v/v) with flowrate at 0.8 mL/min. The
wavelength of UV detector was set at 280 nm and column temperaturewas
set at 35 C. All samples were filtered through 0.45 mm
membrane before HPLC analysis and the injection volume of sample
was 20 mL.Preparation of standard solution: An amount of 2.7 mg of
capsaicinwas accurately weighed and dissolved in 10 mL methanol.
The standard stock solution was diluted with methanol to appropriate
concentrations for the construction of calibration curves.
2.5.2. Quantification of red pigments
Test solution of pigment samples was determined by spectrophotometry
(National standards of People’s Republic of China,
2008; Tundis et al., 2012). The details were as follows: the
amount of 0.1 (0.0001) g samples was dissolved and diluted into
100 mL with acetone as a stock solution. Then the stock solution
was diluted into an appropriate concentration with acetone and the
absorbance of the diluted solutionwas measured against acetone at
460 nm by a spectrophotometer (Shimadzu UV1600). The content
of red pigments was expressed as the total content of carotenoids
using b-carotene equivalents in mg per g pericarp.
Standard solutionwas prepared as follows: An amount of 5.6 mg
of b-carotene was accurately weighed and dissolved in 50 mL
acetone. The standard stock solution was diluted with acetone to
appropriate concentrations for the construction of calibration
curves.
For determining the content of red colorant in FRP, the pericarp
after removal of seed and stalk were extracted with acetone until
the color was exhausted. The combined extracts were evaporated
to remove acetone and water (from FRP) under reduced pressure
with a rotary evaporator at 45 C. A residual cream was obtained.
Then it was dissolved with acetone into a determinate volume for
absorbance determination.
3. Results and discussion
3.1. Analysis
3.1.1. HPLC analysis of capsaicinoids
The contents of capsaicinoids were analyzed by HPLC to evaluate
the extracted effect. The HPLC separation conditions including
the ratio of mobile phase (methanolewater) and flow rate were
firstly investigated and the satisfactory chromatographic conditions
were summarized in Section 2.5.1. The HPLC chromatograms
of standard compound (capsaicin) and the crude extract were
shown in Fig. 2, respectively.
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุและสารเคมี
พริกแดงสด ( ผลไม้สีแดงสุกพริก annuum L )
ซื้อในวันที่ 25 กันยายน 2012 จาก ตลาดผักพื้นบ้าน E
ตั้งอยู่ในมหาวิทยาลัยการเกษตรมณฑลหูหนาน . พวกเขาถูกบรรจุในถุงโพลีเอทธิลีน
และเก็บไว้ในตู้เย็น ( 4 C ) ก่อน
การสกัด แต่ละ 100 กรัม ( หลังจากที่เอาเปลือกของเมล็ดและลำต้น )
FRP ประกอบด้วย 24และ 7 มิลลิกรัมแคปไซซินอยด์ 439.2 มก. แคโรทีน .
แคปไซซิน ( 98% , บริษัท , Sigma อเมริกา ) เบต้าแคโรทีน ( 90 %
( HPLC ) บริษัท mansite เฉิงตู , จีน ) เอทานอล , บีบ
, อะซิโตน , เอทิลอะซิเตท และวิเคราะห์เกรดและซื้อจาก
เคมี บริษัทท้องถิ่น ( ฉางชา , จีน ) เรื่องน้ำกลั่น
ใช้สำหรับการเตรียมการของโซลูชั่นทั้งหมดและเจือจาง .
2.2 .ขั้นตอนของกระบวนการสกัดแคปไซซินอยด์และสีแดง
จาก frps 2.2.1 . ขั้นตอนทั้งหมด
frps ได้ดําเนินการดังนี้ การ sarcocarp
โดยนำวัชพืชออกก้านและเมล็ดจาก frps .
แล้ว sarcocarp ของพริกก็หั่นเป็นชิ้นเล็ก ๆประมาณ 2 mm
2 .
สำหรับปรับสภาพของการสกัดขั้น frps
10 กรัมsarcocarp ถูกใส่ลงไปในแก้วขวด 100 มล. และแช่ในตัวทำละลายการสกัด
เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นนำไปสกัดด้วยความร้อน
กรดสกัด ขั้นตอนของการสกัดระยะที่แสดงในรูปที่ 1
.
2.2.2 . การเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการและผลกระทบของเงื่อนไข
การสกัดการสกัดผลผลิตของแคปไซซินอยด์
สีแดงและเป็นครั้งแรก โดยปัจจัยเดียว (
)เงื่อนไขเหล่านี้ ได้แก่ อัตราส่วนของตัวทำละลาย
วัสดุ ( 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ml / g ) , อุณหภูมิของน้ำที่อาบ (
50 , 60 , 70 , 80 , 90 C ) และเวลาในการสกัด ( 60 , 90 , 120 , 150 , 180 นาที )
) เดียวกันสองขั้นตอนที่แตกต่างกัน : การกำจัดขั้นตอนของการสกัดแคปไซซินอยด์
หรือเวทีสีแดง แต่ความเข้มข้นของสารละลายเอทานอลแตกต่างกัน
ในข้างต้นสองขั้นตอน สำหรับ
การกำจัดของแคปไซซินอยด์ ความเข้มข้นของเอทานอลถูกตั้งค่าเป็น
10% , 20% , 30% , 40% , 50% , 60% , 70% ( v / v ) ขณะเดียวกัน ก็ตั้งเป็น
60% , 70% , 80% , 90% , 95% ( v / v ) สำหรับขั้นตอนการสกัดสารสีแดง
.
แล้ว การวางแผนการทดลอง ซึ่งถูกใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการสกัด
เงื่อนไขที่ทั้งสองขั้นตอนการสกัด
, ตามลำดับ
2.1 . วัสดุและสารเคมี
พริกแดงสด ( ผลไม้สีแดงสุกพริก annuum L )
ซื้อในวันที่ 25 กันยายน 2012 จาก ตลาดผักพื้นบ้าน E
ตั้งอยู่ในมหาวิทยาลัยการเกษตรมณฑลหูหนาน . พวกเขาถูกบรรจุในถุงโพลีเอทธิลีน
และเก็บไว้ในตู้เย็น ( 4 C ) ก่อน
การสกัด แต่ละ 100 กรัม ( หลังจากที่เอาเปลือกของเมล็ดและลำต้น )
FRP ประกอบด้วย 24และ 7 มิลลิกรัมแคปไซซินอยด์ 439.2 มก. แคโรทีน .
แคปไซซิน ( 98% , บริษัท , Sigma อเมริกา ) เบต้าแคโรทีน ( 90 %
( HPLC ) บริษัท mansite เฉิงตู , จีน ) เอทานอล , บีบ
, อะซิโตน , เอทิลอะซิเตท และวิเคราะห์เกรดและซื้อจาก
เคมี บริษัทท้องถิ่น ( ฉางชา , จีน ) เรื่องน้ำกลั่น
ใช้สำหรับการเตรียมการของโซลูชั่นทั้งหมดและเจือจาง .
2.2 .ขั้นตอนของกระบวนการสกัดแคปไซซินอยด์และสีแดง
จาก frps 2.2.1 . ขั้นตอนทั้งหมด
frps ได้ดําเนินการดังนี้ การ sarcocarp
โดยนำวัชพืชออกก้านและเมล็ดจาก frps .
แล้ว sarcocarp ของพริกก็หั่นเป็นชิ้นเล็ก ๆประมาณ 2 mm
2 .
สำหรับปรับสภาพของการสกัดขั้น frps
10 กรัมsarcocarp ถูกใส่ลงไปในแก้วขวด 100 มล. และแช่ในตัวทำละลายการสกัด
เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นนำไปสกัดด้วยความร้อน
กรดสกัด ขั้นตอนของการสกัดระยะที่แสดงในรูปที่ 1
.
2.2.2 . การเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการและผลกระทบของเงื่อนไข
การสกัดการสกัดผลผลิตของแคปไซซินอยด์
สีแดงและเป็นครั้งแรก โดยปัจจัยเดียว (
)เงื่อนไขเหล่านี้ ได้แก่ อัตราส่วนของตัวทำละลาย
วัสดุ ( 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ml / g ) , อุณหภูมิของน้ำที่อาบ (
50 , 60 , 70 , 80 , 90 C ) และเวลาในการสกัด ( 60 , 90 , 120 , 150 , 180 นาที )
) เดียวกันสองขั้นตอนที่แตกต่างกัน : การกำจัดขั้นตอนของการสกัดแคปไซซินอยด์
หรือเวทีสีแดง แต่ความเข้มข้นของสารละลายเอทานอลแตกต่างกัน
ในข้างต้นสองขั้นตอน สำหรับ
การกำจัดของแคปไซซินอยด์ ความเข้มข้นของเอทานอลถูกตั้งค่าเป็น
10% , 20% , 30% , 40% , 50% , 60% , 70% ( v / v ) ขณะเดียวกัน ก็ตั้งเป็น
60% , 70% , 80% , 90% , 95% ( v / v ) สำหรับขั้นตอนการสกัดสารสีแดง
.
แล้ว การวางแผนการทดลอง ซึ่งถูกใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการสกัด
เงื่อนไขที่ทั้งสองขั้นตอนการสกัด
, ตามลำดับ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- the initial hyper excitability observed
- The following message to was undelivera
- B. Sortation—When it becomes necessary t
- ช่วยกันปลูกป่าเพื่อทดแทน
- I've gotta pee
- ฉันใส่รองเท้าผิด
- เกิด
- you do not believe
- What are the primary sources and uses of
- Who are these men?
- เป็นคนดีใช่ไหม
- 由于此下载
- ผูคนมากมายต่างต้องพึ่ง
- ฉันต้องการให้เรารู้จักกันมากกว่านี้
- I see you do not like me
- I mean, I understand that you come here,
- ทำให้เธอต้องพบกับความเดียวดายอีกครั้ง
- ประหยัดไฟฟ้า
- lost Stars,Trying to light up in dark
- What will you do tonight?Relax?
- constellation is a group of stars with a
- The following message to was undelivera
- You are my best one
- คิดสิ่งใดขอให้สมปราถนา
