The open reading frame lacking the

The open reading frame lacking the signal peptide from N. mirabilis
PR-1 was amplified by PCR using AccuPrime™ Taq DNA Polymerase
High Fidelity (Invitrogen, Darmstadt, Germany) and cDNA
as a template with the following primers: forward 50-TAAT
GCATGCAGAACGACAAACAAGAC TCCT-30 , containing SphI restriction
site (underlined) and reverse 50-ATTACCGCGGGTACGG
ATACTGTCCGACAATA-30 , containing SacII restriction site (underlined),
designed according to the conserved protein sequence of
PR-1 from N. mirabilis (Genbank Accession No. GQ337079); (PCRprotocol:
1 min at 95 C; 30 cycles of 15 s at 95 C, 30 s at 60 C,
1 min at 68 C; and 5 min at 68 C).
The NmPR-1 PCR product obtained was further cloned into
pMIB/V5-His vector B (Invitrogen) in order to provide a C-terminal
peptide that contains both a V5 epitope for immunoblot-based
detection, a His-tag for purification, and the feature that expressed
proteins are secreted into the medium. The correct insertion of the
PCR product was verified by DNA sequencing (Eurofins MWG Operon;
Ebersberg, Germany). Sf9 cells were transfected in 60-mm
diameter Petri dishes with 4 lg of plasmid DNA using Insect Gene
Juice (Novagen, Nottingham, UK) as transfection reagent. 48 h
post-transfection, cells were splitted 1:5 in a new 60-mm diameter
Petri dish and were selected with 80 lg/ml blasticidin until they
reached confluency. PR-1/Sf9 cell culture medium was harvested
after 4 days of culturing past splitting. Subsequently, 80 ml of PR-
1/Sf9 culture media were concentrated 10-fold using Pierce Concentrater
20 ml/9 K (MWCO: 9000), and subsequently dialyzed
using Slide-A-Lyzer 10 K (MWCO: 10,000) Dialysis Cassettes
(Thermo Scientific, Rockford, USA), following the manufacturer’s
protocol.
Protein biochemistry

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เปิดอ่านเฟรมขาดเพปไทด์สัญญาณจาก N. mirabilisประชาสัมพันธ์-1 ถูกขยาย โดย PCR โดยใช้ AccuPrime™ Taq DNA พอลิเมอเรสความเที่ยงตรงสูง (Invitrogen ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) และ cDNAเป็นแม่แบบกับไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: ส่งต่อ 50-TAATGCATGCAGAACGACAAACAAGAC TCCT-30 ประกอบด้วย SphI จำกัดไซต์ (ขีดเส้นใต้) และย้อนกลับ 50-ATTACCGCGGGTACGGATACTGTCCGACAATA-30 ประกอบด้วยไซต์จำกัด SacII (ขีดเส้นใต้),ออกแบบตามลำดับโปรตีนภัตประชาสัมพันธ์-1 จาก N. mirabilis (หมายเลข Genbank ภาคยานุวัติ GQ337079); (PCRprotocol:1 นาทีที่ 95 C รอบ 30 15 s ที่ 95 C, 30 วินาทีที่ 60 C1 นาทีที่ 68 C และ 5 นาทีที่ 68 C)ผลิตภัณฑ์ PCR NmPR-1 ที่ได้รับถูกโคลนลงในเพิ่มเติมpMIB V5-เขาเวกเตอร์ B (Invitrogen) เพื่อให้มีอาคารผู้โดยสาร Cเปปไทด์ที่ประกอบด้วยทั้ง epitope V5 สำหรับ immunoblot คะแนนตรวจจับ พระแท็กสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ และคุณลักษณะที่แสดงออกโปรตีนที่หลั่งเข้าไปในตัวกลาง แทรกถูกต้องของการผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการตรวจจากดีเอ็นเอ (Eurofins MWG Operon การจัดลำดับอันดับ เยอรมนี) เซลล์ Sf9 ถูก transfected ใน 60 มม.เส้นผ่าศูนย์กลางอาหารเพาะ มี lg 4 ของ plasmid DNA โดยใช้ยีนแมลงน้ำ (Novagen น็อตติงแฮม สหราชอาณาจักร) เป็นรีเอเจนต์ transfection 48 ชั่วโมงหลัง transfection เซลล์ถูก splitted 1:5 เส้นผ่านศูนย์กลาง 60 มม.ใหม่จานเพาะเชื้อ และเลือกกับ lg/ml 80 blasticidin จนถึง confluency สารประชาสัมพันธ์-1/Sf9 เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 4 วันของการนำไปเลี้ยงที่ผ่านมาแบ่ง ต่อมา 80 ml ของ PR-สื่อวัฒนธรรม 1/Sf9 ได้เข้มข้น 10-fold ใช้ Pierce Concentrater20 ml/9 K (MWCO: 9000), และ dialyzed ต่อมาใช้ภาพนิ่ง-A-Lyzer 10 K (MWCO: 10,000) ไตเทป(วิทยาศาสตร์เทอร์โม ร็อคฟอร์ด สหรัฐอเมริกา), ตามของผู้ผลิตโพรโทคอชีวเคมีของโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กรอบเปิดอ่านขาดเปปไทด์สัญญาณจาก N. mirabilis
PR-1 ได้รับการขยายโดยใช้วิธี PCR AccuPrime ™ Taq DNA Polymerase
ไฮไฟ (Invitrogen, Darmstadt, เยอรมนี) และยีน
เป็นแม่แบบที่มีไพรเมอร์ต่อไปนี้: ไปข้างหน้า 50 TAAT
GCATGCAGAACGACAAACAAGAC TCCT -30 ที่มีข้อ จำกัด SphI
เว็บไซต์ (ขีดเส้นใต้) และย้อนกลับ 50 ATTACCGCGGGTACGG
ATACTGTCCGACAATA-30 ที่มีข้อ จำกัด SacII เว็บไซต์ (ขีดเส้นใต้),
การออกแบบตามลำดับโปรตีนอนุรักษ์ของ
PR-1 จาก N. mirabilis (Genbank เลข GQ337079); (PCRprotocol:
? 1 นาทีที่ 95 C 30 รอบของ 15 วินาทีที่ 95 C, 30 วินาทีที่ 60 C,
? 1 นาทีที่ 68 C และ 5 นาทีที่ 68 C)
ผลิตภัณฑ์ NMPR-1 PCR ได้เป็นโคลนลงไปอีก
pMIB / V5 เขาเวกเตอร์ B (Invitrogen) เพื่อให้ C-terminal ของ
เปปไทด์ที่มีทั้ง epitope V5 สำหรับ immunoblot ตาม
การตรวจสอบของเขาแท็กสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และ คุณลักษณะที่แสดง
โปรตีนที่หลั่งเข้ากลาง แทรกที่ถูกต้องของ
สินค้า PCR ได้รับการตรวจสอบโดยลำดับดีเอ็นเอ (Eurofins MWG Operon;
Ebersberg, เยอรมนี) เซลล์ Sf9 ถูก transfected ใน 60 มิลลิเมตร
เส้นผ่าศูนย์กลางจานเลี้ยงเชื้อมี 4 LG พลาสมิดดีเอ็นเอโดยใช้ยีนแมลง
น้ำ (Novagen ?, น็อตติงแฮม, สหราชอาณาจักร) เป็นสาร transfection 48 ชั่วโมง
หลัง transfection เซลล์ถูก splitted 1: 5 ใน 60 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลางใหม่
จานเลี้ยงเชื้อและได้รับการคัดเลือก 80 LG / ml blasticidin จนกว่าพวกเขาจะ
มาถึง confluency
PR-1 / Sf9 กลางการเพาะเลี้ยงเซลล์เก็บเกี่ยว หลังจาก 4 วันของการเพาะเลี้ยงแยกที่ผ่านมา ต่อจากนั้น 80 มล PR-
สื่อวัฒนธรรม 1 / Sf9 มีความเข้มข้น 10 เท่าโดยใช้เพียร์ซ? Concentrater
20 มล. / 9 K (MWCO: 9000) และต่อมา dialyzed
ใช้สไลด์-A-lyzer? 10 K (MWCO: 10,000) ไตเทป
(Thermo Scientific, ฟอร์ด, USA) ดังต่อไปนี้ผู้ผลิต
โพรโทคอ
ชีวเคมีโปรตีน ต่อไปนี้ผู้ผลิต โพรโทคอ ชีวเคมีโปรตีน ต่อไปนี้ผู้ผลิต โพรโทคอ ชีวเคมีโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เปิดอ่านกรอบขาดสัญญาณเปปไทด์จาก N . มิราบิลิสpr-1 ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ DNA polymerase accuprime ™ทัคความจงรักภักดีสูง ( Invitrogen ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) และยีนเป็นแม่แบบด้วยไพรเมอร์ 50-taat ต่อไปนี้ : ไปข้างหน้าgcatgcagaacgacaaacaagac sphi tcct-30 ที่มีข้อ จำกัดเว็บไซต์ ( ขีดเส้นใต้ ) และย้อนกลับ 50-attaccgcgggtacggatactgtccgacaata-30 ที่มีข้อ จำกัด sacii เว็บไซต์ ( ขีดเส้นใต้ )ออกแบบตามการรักษาลำดับของโปรตีนpr-1 จาก N . มิราบิลิส ( ขนาดหนังสือไม่ gq337079 ) ; ( pcrprotocol :1 นาทีที่ 95 C ; 30 รอบ 15 s 95 องศาเซลเซียส 30 วินาทีที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส1 นาทีที่ 68 องศาเซลเซียส และ 5 นาทีที่ 68 องศาเซลเซียส )การ nmpr-1 ได้รับเพิ่มเติมโคลนเข้าดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์pmib / V5 ของเขาเวกเตอร์ B ( Invitrogen ) เพื่อให้ซึ่งเปปไทด์ที่ประกอบด้วยทั้ง V5 สำหรับมมูโนบล็ไวรัสจากการตรวจสอบ , แท็กของเขาบริสุทธิ์และคุณลักษณะที่แสดงโปรตีนที่หลั่งลงในสื่อ การแทรกที่ถูกต้องของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ ( eurofins mwg โอเปอรอน ;ebersberg , เยอรมัน ) ต่างๆ ในเซลล์มี transfected 60 มม.เส้นผ่าศูนย์กลางจานเลี้ยงเชื้อที่มีพลาสมิดดีเอ็นเอยีน 4 LG ใช้แมลงน้ำผลไม้ ( novagen , น็อตติงแฮม , UK ) สำหรับใช้เป็น 48 ชม.กระทู้สำหรับเซลล์ คือ 1 : 5 ในวลีใหม่ขนาด 60 มม.จานเพาะเชื้อและเลือก blasticidin 80 LG / ml จนกว่าพวกเขาถึง confluency . pr-1 / ต่างๆ ) เก็บเกี่ยวเซลล์วัฒนธรรมหลังจาก 4 วันของการเพาะเลี้ยง ผ่านแยก จำนวน 80 มิลลิลิตร - ประชาสัมพันธ์1 วัฒนธรรมสื่อต่างๆมีความเข้มข้น 10 เท่าใช้ concentrater เพียซ20 ml / 9 K ( mwco : 9000 ) และต่อมาซิการใช้ slide-a-lyzer 10 K ( mwco : 10 ) และแบบ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Rockford , USA ) , ต่อไปนี้ของผู้ผลิตโปรโตคอลชีวเคมีทางโปรตีน