2. Materials and method2.1 MTT (2 3

2. Materials and method
2.1 MTT (2 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) assay to determine the IC50 value of Mn
on Acanthamoeba sp.
Acanthamoeba sp. (environmental isolate) was used in all experiments. The trophozoites were maintained in
axenic conditions in 4% protease-yeast-glucose medium and were subcultured every 4 days. MTT assay by
Mossman [8] was used in this study to determine the IC50 value of Mn on Acanthamoeba sp.
2.2 Morphological observation of Acanthamoeba treated with Mn by light and scanning electron microscopy.
For morphological observation of Acanthamoeba after exposure to Mn, the amoeba were first seeded in a sixwell
plate and incubated at 37qC in the absence and presence of Mn at their IC50 concentration. After 24h of
incubation, the morphological changes of Acanthamoeba were observed under light microscopy. Scanning electron
microscopy observation was carried out following the method by Fatimah et al. [9].
2.3 Mode of cell death determination by fluorescence microscopy - Acridine orange/ propidium iodide (AO/PI)
staining.
For AO/PI staining, the Mn-treated and untreated Acanthamoeba cells were harvested and washed with PBS and
then incubated with 5μl of acridine orange (10μg/ml) and propidium iodide (10μg/ml) at a ratio of 1:1 in 1 ml of
cells and centrifuged at 1000 rpm/15 min. After centrifuge, supernatant was removed leaving 50 μl of residual
supernatant with pellet. The pellet was resuspended and 10 μl was pipetted on the slide before putting on the cover
slip. Within 30 min, the slide was analyzed using fluorescence microscope (Leica, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 ทดสอบที่ MTT (ฟีนิลได 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 2 tetrazolium โบรไมด์) กำหนดค่า IC50 ของ Mnบน Acanthamoeba spAcanthamoeba sp.ที่ (แยกสิ่งแวดล้อม) ถูกใช้ในการทดลองทั้งหมด Trophozoites ถูกเก็บรักษาไว้ในเงื่อนไข axenic ในรติเอสยีสต์กลูโคส 4% และมี subcultured ทุกวัน 4 MTT assay โดยมอสส์แมน [8] ถูกใช้ในการศึกษานี้เพื่อกำหนดค่า IC50 ของ Mn ใน Acanthamoeba sp2.2 สังเกตสัณฐานของ Acanthamoeba รับ Mn โดยแสงและสแกน microscopy อิเล็กตรอนสำหรับสังเกตสัณฐานของ Acanthamoeba หลังจากสัมผัสกับ Mn อะมีบาถูกแรก seeded ในการ sixwellแผ่น และ incubated ที่ 37qC ในการขาดงานและสถานะของ Mn ที่ความเข้มข้นของ IC50 หลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ การเปลี่ยนแปลงสัณฐานของ Acanthamoeba ที่สังเกตภายใต้แสง microscopy อิเล็กตรอนสแกนสังเกต microscopy ถูกดำเนินการตามวิธีการโดยฟาฏิมะฮ์ et al. [9]2.3 วิธีการเซลล์ตายกำหนดโดย fluorescence microscopy - Acridine ส้ม / propidium ไอโอไดด์ (อ่าว/PI)ย้อมสีสำหรับ อ่าว/PI ย้อมสี เซลล์ Acanthamoeba ถือ ว่า Mn และไม่ถูกรักษาเก็บเกี่ยว และล้าง ด้วย PBS และแล้ว incubated กับ 5μl acridine orange (10μg/ml) และ propidium ไอโอไดด์ (มล 10μg) ที่อัตราส่วน 1:1 ใน 1 มิลลิลิตรของเซลล์ และ centrifuged ที่ 1000 รอบต่อ นาที/15 min หลังจากเครื่องหมุนเหวี่ยง supernatant ถูกเอาออกจาก 50 μl ของส่วนที่เหลือจากsupernatant with pellet. The pellet was resuspended and 10 μl was pipetted on the slide before putting on the coverslip. Within 30 min, the slide was analyzed using fluorescence microscope (Leica, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 MTT (2 3 [4,5-dimethylthiazol-2-YL] -2,5 diphenyl tetrazolium โบรไมด์) ทดสอบเพื่อตรวจสอบค่า IC50 ของ Mn
ใน Acanthamoeba Sp.
Acanthamoeba SP (แยกสิ่งแวดล้อม) ถูกนำมาใช้ในการทดลองทั้งหมด trophozoites
ถูกเก็บรักษาไว้ในสภาพaxenic ในสื่อน้ำย่อยยีสต์กลูโคส 4% และได้รับการเลี้ยงทุก 4 วัน ทดสอบ MTT โดย
Mossman [8] ถูกนำมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้เพื่อกำหนดค่า IC50 ของ Mn ใน Acanthamoeba Sp.
2.2 การสังเกตทางสัณฐานวิทยาของ Acanthamoeba รับการรักษาด้วย Mn ด้วยแสงและการสแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน.
สำหรับการสังเกตลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ Acanthamoeba หลังจากที่สัมผัสกับ Mn, อะมีบา เมล็ดแรกใน sixwell
แผ่นและบ่มที่ 37qC ในกรณีที่ไม่มีและการปรากฏตัวของแมงกานีสที่มีความเข้มข้น IC50 ของพวกเขา หลังจาก 24
ชั่วโมงของการบ่มการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของAcanthamoeba ถูกตั้งข้อสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ อิเล็กตรอนแบบส่องกราดกล้องจุลทรรศน์สังเกตได้ดำเนินการดังต่อไปนี้โดยวิธีการ Fatimah et al,
. [9]
2.3 โหมดของการกำหนดการตายของเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง - acridine ส้ม / ไอโอไดด์ propidium (AO / PI)
การย้อมสี.
สำหรับ AO / ย้อมสี PI ที่ Mn รับการรักษาและเซลล์ Acanthamoeba
ได้รับการรักษาที่ถูกเก็บเกี่ยวและล้างด้วยพีบีเอสและบ่มแล้วด้วย5μlส้ม acridine (10μg / ml) และไอโอไดด์ propidium (10μg / ml) ในอัตราส่วน 1: 1 ใน 1
มิลลิลิตรของเซลล์และหมุนเหวี่ยงที่1,000 รอบต่อนาที / 15 นาที หลังจากเหวี่ยง, ใสถูกลบออกออกจาก 50
เหลือไมโครลิตรของสารละลายที่มีเม็ด เม็ดถูก resuspended และ 10
ไมโครลิตรถูกปิเปตบนภาพนิ่งก่อนที่จะวางบนหน้าปกใบ ภายใน 30 นาที, สไลด์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Leica, เยอรมนี)