Biosystems® by Life Technologies ,

Biosystems® by Life Technologies , USA). The total 25 μl
RT-qPCR mixture included 12.5 μl 2X RT-PCR Buffer,
1 μl 25X RT-PCR Enzyme Mix, 0.5 μl one-step RT-PCR
Master Mix (Qiagen), 0.5 μl(20μM ) of each primer,
0.3 μl(10 μM ) probe, 4.7 μl nuclease-free water and 5 μl
extracted RNA. The thermocycling parameters were: re-verse transcription (RT) at 45°C for 10 min, RT inactiva-tion at 95°C for 10 min and fluorescence detection for
40 cycles of 95°C for 15 s and annealing at 60°C for 45 s.
The RT-qPCR data was analyzed using the SDS software
provided by Applied Biosystems®. Amplification cur ves
were evaluated by the threshold line placed over the back-ground signal, and intersecting the initial exponential
phase of the cur ve. Amplification of DEN V was obser ved
at a quantification cycle (Cq) value of 28. The serological
tests for DEN V IgM provided in a commercial ELISA kit
(Panbio® Dengue IgM Capture ELISA , Sinnamon Park ,
Australia) were tested from disease day 0 to 18. The NS1
antigen colloidal gold test was carried out using the CIK
DEN V OnSite Rapid Test® (CTK Biotech, Inc, San Diego,
C A , U SA) . Th is t est w a s u sed first a s t he m ost ra pid
diagnost ic too l to identi fy dengue vir us. Howe ver, the
immunochromatographic card test usually has a low spe-cificity and sensitivity compared with molecular methods
and ELISAs. The results were consistent with the conclu-sions of previous studies that demonstrated the compared
clinical diagnostic methods [10-12]. The results of the
a ssays were p resented i n Table 2. The Q inhu an g dao En t ry-Exit Inspe ction and Q uarantine B ureau advised the patient
about f utur e tr avel in dengue hig h r isk regions before his
discharge f rom th e hospital on Ja n 15, 2013.
The viral RNA wa s re verse transcribe d usin g the re-verse prim er with A MV re verse transcripta se (Prom ega
Corpo ration, Madison , WI, USA ). The re verse transcrip-tion reactio n wa s carrie d out at 42°C for 1 h. Further
conven tional P CR amplificatio n cover ing the full gen-ome with 16 set s of DEN V spe cific primer s succeeded in
cDN A template . Amplifi ed product s were dete cted using
agarose gel ele ctrophore sis and seque nce identif ication.
The sequenc ing wa s performe d using an ABI PRISM
3730 DNA Sequencer. Overlapping sequencing fragments
were assembled to generate a contiguous full-genome se-quence (10723 bp) using L asergene (DNASTAR , Madison,
WI, USA). The complete DEN V genome was submitted
to GenBank (accession number KF479233).
The a ssembled seq uence isolat ed from the patien t’s
urine wa s aligned with N C BI BL A STn default parameter
agains t the non-redund ant nucle otide databa se (nr/nt).
An E-value of 0 wa s used a s the cutoff. The cuto ff of the
query cover age and the identi ty were >99% and >95%
above, respe ctively. The result indic ated that all query
hit s were dengue viru s type 2, but the hit s were variant
strains from differ ent South A sian countrie s.
A p hy lo genetic a nalysis o f t he DEN V envelope gene
(E gene ) codin g se qu ence ( 1485 bp ) w a s perf or med by
compa ring th e KF479 233 s train w it h 14 other E gene se-quence s i solated from fou r South A sian countrie s that
were ob tain ed from the N CBI G enB a nk databa se. The
codin g sequences were a nalyzed to make a n eig hbor-join in g tree with 1000 bo o t s trap re plications , which wa s
create d using M EGA 5 ( T e mp e, AZ U SA) software [13].
After the phylogenetic analysis , DEN V-2 strains were sep-arated from the DEN V-1, DEN V-3, and DEN V-4 clades
(Figure 2). The KF479233 strain was strongly located
within the DEN V-2 group, as indicated a high bootstrap
value (100%)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Biosystems ® ด้วยเทคโนโลยีชีวิต สหรัฐอเมริกา) Μl 25 รวมRT-qPCR ผสมรวม 12.5 μl 2 X RT-PCR บัฟเฟอร์1 μl 25 X RT-PCR เอนไซม์ผสม 0.5 μl ขั้นตอนเดียว RT-PCRหลักการผสม (Qiagen), μl (20μM) 0.5 แต่ละพื้นโพรบ μl (10 μM) 0.3 น้ำฟรี nuclease μl 4.7 และ 5 μlอาร์เอ็นเอที่แยก มีพารามิเตอร์ thermocycling: อีกข้อ transcription (RT) ที่ 45 ° C สำหรับ 10 นาที RT inactiva-สเตรชันที่ 95 ° C 10 นาทีและ fluorescence ตรวจสำหรับรอบ 40 95 องศาเซลเซียส 15 s และการอบเหนียวที่ 60° C สำหรับ 45 sข้อมูล RT qPCR ถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์องค์กรโดย® Biosystems ใช้ Ves ปัจจุบันขยายถูกประเมิน โดยเส้นขีดจำกัดวางสัญญาณพื้นหลัง และ intersecting เริ่มต้นเนนระยะของ ve ปัจจุบัน ขยายของเดน V ถูก obser เว็ดในการนับรอบค่า (ซี) 28 ที่สภาวะสำหรับการระบาดของโรควีเดนให้ในชุดแบบ ELISA ในเชิงพาณิชย์(Panbio ®ไข้เลือดออกระบาดของโรคจับ ELISA, Sinnamon พาร์คออสเตรเลีย) ทดสอบจากโรควัน 0-18 NS1ตรวจหา colloidal gold ทดสอบทำออกใช้ CIKเดน V อย่างรวดเร็วสิ่งทดสอบ® (CTK เทคโนโลยีชีวภาพ Inc, San DiegoC A, U SA) Th เป็น t est w ถูก u s ตัวแรก s t ra ost m เขาเรียกdiagnost ic เกิน l ให้ identi ไตรป่วย vir เรา ฮาวหนอน การอิมมูบัตรทดสอบมักมี spe cificity ต่ำและความไวที่เมื่อเทียบกับวิธีการระดับโมเลกุลและ ELISAs ผลได้สอดคล้องกับ sions conclu ศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงการเปรียบเทียบทางคลินิกการวินิจฉัยวิธี [10-12] ผลของการssays ได้ p resented ฉัน n ตาราง 2 Q inhu มี g ดาว t น้ำแห้งออก Inspe รบางแอคชันและ Q uarantine B ureau แนะนำให้ผู้ป่วยเกี่ยวกับ f utur e tr โรงแรมเพอร์อาเวลในไข้เลือดออกของภูมิภาค isk h r ก่อนของเขาถ่าย f รอม th e โรงพยาบาลบน n Ja 15, 2013S wa อาร์เอ็นเอไวรัสกลับข้อจำลอง g สแตน d usin พริมอีกข้อเอ้อ มี A MV re ข้อ transcripta se (ega พรหมสอาหาร เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) ใน re ข้อ s wa n reactio สเตรชัน transcrip carrie d ออกที่ 42° C สำหรับ h. 1 เพิ่มเติมconven tional P CR n amplificatio ปก ing gen-ome เต็ม ด้วย s 16 ชุดของวีเดน spe cific พื้น s สำเร็จแล้วcDN แบบ Amplifi ed ผลิตภัณฑ์ s ถูก dete cted ใช้agarose เจเอเล ctrophore sis และ seque nce identif icationSequenc กำลังหว้า s performe d ใช้ปริซึมเป็นลักชัวรี่3730 DNA Sequencer การ บางส่วนของการจัดลำดับการซ้อนทับกันถูกรวบรวมเพื่อสร้างอยู่ติดกันทั้งกลุ่ม se-quence (10723 bp) ใช้ L asergene (DNASTAR เมดิสันอินเตอร์ สหรัฐอเมริกา) ส่งกลุ่มเดน V สมบูรณ์การ GenBank (เลขทะเบียน KF479233)การเป็น ssembled ลำดับ uence isolat ed จาก patien t'sปัสสาวะ wa s กับ N C BI BL A STn พารามิเตอร์ค่าเริ่มต้นagains t ไม่ใช่ redund มด nucle otide databa se (nr/nt)E-ค่าของ 0 wa s s ตัดกัน Ff cuto ของการแบบสอบถามครอบคลุมอายุและ identi ty > 99% และ > 95%ข้างต้น respe ctively เส้นดิกผลว่า ทั้งหมดสอบถามs ตีได้ป่วย viru s ชนิด 2 แต่ s ตีถูกแปรสายพันธุ์จากต่างเอนท์ใต้ A sian countrie sฮี p หล่อ พันธุเป็น nalysis o f t เขาวีเดนซองยีน(ยีนอี) codin g se โต๊ะ ence (ค.ศ. 1485 bp) w s perf หรือเม็ดโดยค่าจ้างแหวน th e s KF479 233 รถไฟ w มัน h 14 อื่น ๆ อียีนเซ quence s ฉัน solated จาก fou r s countrie เซียนใต้ A ที่มี ob tain ed จาก enB N CBI G nk databa secodin g ลำดับถูก nalyzed การทำ n eig hbor-รวมใน g กับ 1000 บ่อดัก s t o กลับ plications, s ที่ waสร้าง d ใช้ M 5 EGA (T e mp e, AZ U SA) ซอฟต์แวร์ [13]หลังจากวิเคราะห์ phylogenetic สายพันธุ์ V-2 เดนได้ sep-arated จาก V-1 เดน เดน V-3 และ clades เดน V-4(รูปที่ 2) พันธุ์ KF479233 เป็นอย่างยิ่งอยู่ภายในกลุ่มเดน V-2 ตามที่ระบุ bootstrap สูงค่า (100%)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Biosystems®โดยไลฟ์เทคโนโลยีส์, สหรัฐอเมริกา) รวม 25 ไมโครลิตร
RT-qPCR ส่วนผสมรวม 12.5 ไมโครลิตร 2X RT-PCR บัฟเฟอร์,
1 ไมโครลิตร 25X RT-PCR เอนไซม์ผสม, 0.5 ไมโครลิตรขั้นตอนเดียว RT-PCR
โทผสม (Qiagen), 0.5 ไมโครลิตร (20μM) ของแต่ละไพรเมอร์
0.3 ไมโครลิตร (10 ไมครอน) สอบสวนน้ำ Nuclease ฟรี 4.7 ไมโครลิตรและ 5
ไมโครลิตรสกัดอาร์เอ็นเอ พารามิเตอร์ thermocycling คือการถอดความใหม่กลอน (RT) ที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที, RT inactiva-การที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและการตรวจสอบการเรืองแสงสำหรับ
40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 15 วินาทีและการอบที่ 60 ° C 45 s.
ข้อมูล RT-qPCR ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ระบบ SDS
ให้โดยประยุกต์Biosystems® ขยาย Ves เลวได้รับการประเมินโดยสายเกณฑ์วางอยู่เหนือสัญญาณกลับพื้นดินและตัดชี้แจงเริ่มต้นขั้นตอนของเลววันชนะ การขยายของ DEN วีของนักเรียนระดับ ved ที่วงจรปริมาณ (ที่ Cq) ค่าของ 28 ทางภูมิคุ้มกันทดสอบDEN V IgM ให้มาในชุด ELISA เชิงพาณิชย์(Panbio®ไข้เลือดออก IgM จับ ELISA, Sinnamon Park, ออสเตรเลีย) ได้รับการทดสอบจากโรควันที่ 0 ไป 18 NS1 ทดสอบทองคอลลอยด์แอนติเจนได้ดำเนินการโดยใช้ CIK DEN V OnSite อย่างรวดเร็วTest® (CTK ไบโอเทค, Inc, San Diego, CA, U SA) th คือคือเสื้อวสุ sed แรก AST เขา ost เมตรรา pid DIAGNOST ไอซีเกินไปลิตรระบุ fy ไข้เลือดออก vir เรา ไม่ว่าเวอร์ชั่นที่ทดสอบบัตร immunochromatographic มักจะมีเอสพีอี-cificity ต่ำและความไวเทียบกับวิธีโมเลกุลและELISAs ผลการวิจัยที่สอดคล้องกับ conclu sions ของการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นถึงการเปรียบเทียบวิธีการวินิจฉัยทางคลินิก[10-12] ผลของการssays เป็นพีไม่พอใจในตารางที่ 2 Q inhu กรัม dao เสื้อ En-ry ที่ออกจาก ction Inspe และ Q uarantine B ureau ให้คำแนะนำผู้ป่วยเกี่ยวกับอีเอฟทีอาร์Utur Avel ในภูมิภาคไข้เลือดออก hig ISK ชั่วโมงก่อนที่เขาฉปล่อยรอม ณ โรงพยาบาลในจจา n 15, 2013 อาร์เอ็นเอไวรัสวา s ใหม่กลอนอัดเสียงงใช้กลอนใหม่เรียบร้อยเอ้อด้วยกลอนใหม่ MV transcripta SE (EGA พรหมCorpo ปันส่วนแมดิสัน, WI, สหรัฐอเมริกา) กลอนใหม่ transcrip-การ reactio n วา s carrie d ออกมาที่ 42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง นอกจากสะดวก tional P CR ปก amplificatio n ไอเอ็นจี GEN-โอมเต็มกับ 16 ชุดของไพรเมอร์ cific DEN วีเอสพีอี s ประสบความสำเร็จใน CDN แม่แบบ amplifi เอ็ด s สินค้าที่ถูก dete cted ใช้เอเลเจลagarose SIS ctrophore และ seque nce identif ication. sequenc ไอเอ็นจีวา s performe d ใช้ ABI PRISM 3730 ซีเควนดีเอ็นเอ ชิ้นส่วนลำดับที่ทับซ้อนกันถูกประกอบในการสร้างที่อยู่ติดกันอย่างเต็มรูปแบบจีโนม SE-quence (10,723 bp) โดยใช้ L asergene (DNASTAR เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) จีโนม DEN V สมบูรณ์ถูกส่งไปGenBank (เข้าจำนวน KF479233). ก ssembled หมายเลข uence isolat เอ็ดจากทีผู้รับและผู้ที่ปัสสาวะวาs สอดคล้องกับ NC BI BL พารามิเตอร์เริ่มต้น STN agains ทีไม่ใช่ redund มด nucle otide databa SE ( NR / เอ็นที). E-ค่าเป็น 0 วา s ใช้เป็นทางลัด ฉฉ Cuto ของอายุปกแบบสอบถามและไทระบุเป็น> 99% และ> 95% ข้างต้น respe ctively ผลสันสกฤต ated ว่าแบบสอบถามทั้งหมดตีs เป็นไข้เลือดออก Viru s ชนิดที่ 2 แต่ตี s เป็นตัวแปรสายพันธุ์จากที่แตกต่างกันกิจการใต้เซียนcountrie เอส. พี HY แท้จริงทางพันธุกรรม nalysis ผู้ทรงนั้นเขาก็ยีนซอง V (ยีน E) codin กรัม SE คู ence (1485 bp) เป็น perf หรือ med โดยแหวนcompa ณ จ KF479 233 s รถไฟกว้างมัน 14 อื่น ๆ ชั่วโมงยีน E SE-quence si solated จากคล r ใต้ countrie s เซียนที่มีอบTain เอ็ดจากไม่มี CBI G ENB NK databa SE codin กรัมลำดับเป็น nalyzed ที่จะทำให้ EIG hbor เข้าร่วมในต้นไม้กรัม 1000 bo โอทีเอกับดักอีกพลิเคซึ่งวา s สร้าง d ใช้ M EGA 5 (T อีอี MP, AZ U SA) ซอฟแวร์ [13]. หลังจากที่ การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ, DEN V-2 สายพันธุ์ที่มีกันยายน-arated จาก DEN V-1, DEN V-3 และ DEN V-4 clades (รูปที่ 2) ความเครียด KF479233 ตั้งอยู่อย่างรุนแรงภายในDEN กลุ่ม V-2 ในขณะที่ระบุบูตสูงค่า(100%)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ซึ่ง®โดยเทคโนโลยีชีวิต สหรัฐอเมริกา ) รวม 25 μ L
RT qpcr ผสมรวม 12.5 μชั้น 2x ต่อบัฟเฟอร์ ,
1 L μ 25x RT-PCR เอนไซม์ผสม 0.5 μ Real-Time RT-PCR
l Master Mix ( เพิ่ม ) , 0.5 μ L ( 20 μ m ) ของแต่ละμไพรเมอร์
0.3 L ( 10 μ M ) 4.7 μ L ด้วย นิวเคลียสฟรีน้ำและ 5 μ L
สกัด RNA มีผื่นแดงค่า : Re . การถอดรหัส ( RT ) 45 ° C เป็นเวลา 10 นาทีRT inactiva tion ที่ 95 องศา C นาน 10 นาที และจากการตรวจสอบ
40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและอบอ่อนที่อุณหภูมิ 60 องศา C เป็นเวลา 45 S .
RT qpcr วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ SDS ซอฟแวร์
โดย®ซึ่งใช้ ( CUR รั
จำนวนเกณฑ์เส้นวางอยู่เหนือสัญญาณกลับ และตัดระยะ exponential
ครั้งแรกของสุนัขได้แบบที่ 5 มี obser เดน
ที่ปริมาณวงจร ( CQ ) เท่ากับ 28 การทดสอบทางซีรั่มวิทยา
สำหรับ Den V ให้ 1 ใน
ชุด ELISA พาณิชย์ ( panbio ®ไข้เลือดออกชนิด IgM จับ Elisa , sinnamon Park
ออสเตรเลีย ) ถูกทดสอบจากวันโรค 0 18 นครสวรรค์ 1
แอนติเจน Colloidal Gold ทดสอบใช้ในการทดสอบวีเจ๊ะ
เดนอย่างรวดเร็ว® ( ctk Biotech , Inc , San Diego ,
c , U SA )th คือ t W A S และ u sed แรก S t เขา m OST ราผิด
diagnost IC ด้วย L identi ของไข้เลือดออกสําหรับเรา ฮาว ?
การ์ดทดสอบ immunochromatographic มักจะมีต่ำ เมื่อเทียบกับสารไว cificity
วิธีโมเลกุลและ elisas . ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกับ conclu sions ของการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงเปรียบเทียบ
คลินิกวินิจฉัยวิธีการ [ เปิด ] ผลของ
เป็น ssays คือ p ไม่พอใจฉัน n ตาราง 2 . Q inhu เป็น G ดาวและพยายามออก ction Inspe และ Q uarantine B ureau แนะนำผู้ป่วยเกี่ยวกับ utur
F E TR avel ในไข้เลือดออก hig h r isk ภูมิภาคของเขาก่อนที่
ปล่อยรอม F E TH โรงพยาบาลจา n 15 , 2013 .
ไวรัส RNA wa S อีกข้อคัดลอก D G จะใช้ กลอนพริมเอ้อกับ MV อีกข้อ transcripta เซ ( พรหม เอกา
คาร์โป ปันส่วน , Madison , WI , USA )เรื่องกลอน transcrip tion reactio N wa S แครี่ D ที่ 42 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง conven ต่อไป
tional P CR amplificatio N ครอบคลุมไอเอ็นจีโอม Gen เต็มกับ 16 ชุดของ The วีเอสพี cific รองพื้น S สำเร็จ
CDN แม่แบบ amplifi เอ็ดผลิตภัณฑ์เป็นเครื่องที่ใช้เจลลี่
ctrophore น้องสาวและ seque nce identif ication .
sequenc ไอเอ็นจี wa S ทำการแสดง D ใช้ abi ปริซึม
940 DNA sequencer ได้ซ้อนลำดับเศษ
ถูกประกอบสร้างติดกันเต็มจีโนม เซ quence ( 10723 BP ) ใช้ผม asergene ( dnastar เมดิสัน
WI , USA ) สมบูรณ์ Den V (
( การส่งจะพบหมายเลข kf479233 )
ssembled seq เป็น uence isolat เอ็ดจาก patien T
ปัสสาวะ wa S ชิดกับเอ็นซีบี BL เป็นตำแหน่งเริ่มต้นของพารามิเตอร์
ไร T ไม่ redund มด nucle otide databa เซ ( NR / NT )
0 วาเป็นประโยชน์ใช้เป็นทางลัด การ cuto FF ของ
แบบสอบถามครอบคลุมอายุและ identi ไท ( > 99% > 95 %
ข้างบน respe ctively . ผล อินเดีย จากที่สอบถามทั้งหมดของไข้เลือดออก
ตี viru S 2 ชนิด แต่ตี 2 ตัวแปร
สายพันธุ์แตกต่างกันเอนท์ใต้เซียน countrie s
P HY โลพันธุเป็น nalysis o f t เขาถ้ำซองยีน
V