Experimental OverviewThe real-time

Experimental Overview
The real-time PCR antibiogram utilizes antimicrobial exposure, preanalytic removal of heme and human background DNA, and colony PCR to assess pathogen susceptibility [20], [21]. The optimized protocol is described below in the Materials and Methods Section. Briefly, 1 mL of spiked blood (∼100 CFU/mL) is added to 9 mL of growth medium and incubated for 9 hours in various antibiotic environments. The sample is fractionated to separate red blood cells that contain heme, a PCR inhibitor. The supernatant, which consists of bacteria and mammalian cells, is pelleted and decanted. The pellet is then resuspended in mammalian lysis buffer and treated with DNase. This technique removes human DNA found in white blood cells from the sample, thus enhancing the sensitivity of detection. This is an essential part of this protocol as excess background human DNA can saturate the PCR amplification curves when using intercalating fluorophores. The sample is spun-down and the unseen bacterial cell pellet is washed in reticulocyte saline (RS) buffer. Preparation concludes by adding 2 µL of the sample directly to the PCR plate as template. This bacterial isolation method takes approximately 2–3 hours of manual labor, but could be automated to decrease sample preparation time and multiplexed for high-throughput testing in a clinical diagnostic laboratory setting.
A target pathogen concentration of ∼100 CFU/mL was chosen to emulate levels found clinically in sepsis cases [22]–[24]. For bacteremia, greater than 50% of cases are low-grade (100 CFU/mL), thus necessitating a detection sensitivity of at least 100 CFU/mL.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Experimental OverviewThe real-time PCR antibiogram utilizes antimicrobial exposure, preanalytic removal of heme and human background DNA, and colony PCR to assess pathogen susceptibility [20], [21]. The optimized protocol is described below in the Materials and Methods Section. Briefly, 1 mL of spiked blood (∼100 CFU/mL) is added to 9 mL of growth medium and incubated for 9 hours in various antibiotic environments. The sample is fractionated to separate red blood cells that contain heme, a PCR inhibitor. The supernatant, which consists of bacteria and mammalian cells, is pelleted and decanted. The pellet is then resuspended in mammalian lysis buffer and treated with DNase. This technique removes human DNA found in white blood cells from the sample, thus enhancing the sensitivity of detection. This is an essential part of this protocol as excess background human DNA can saturate the PCR amplification curves when using intercalating fluorophores. The sample is spun-down and the unseen bacterial cell pellet is washed in reticulocyte saline (RS) buffer. Preparation concludes by adding 2 µL of the sample directly to the PCR plate as template. This bacterial isolation method takes approximately 2–3 hours of manual labor, but could be automated to decrease sample preparation time and multiplexed for high-throughput testing in a clinical diagnostic laboratory setting.A target pathogen concentration of ∼100 CFU/mL was chosen to emulate levels found clinically in sepsis cases [22]–[24]. For bacteremia, greater than 50% of cases are low-grade (<10 CFU/mL) and ∼25% of cases are high-grade bacteremia (>100 CFU/mL), thus necessitating a detection sensitivity of at least 100 CFU/mL.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทดลองภาพรวมจริงเวลา antibiogram PCR ใช้การสัมผัสยาต้านจุลชีพกำจัด preanalytic ของ heme พื้นหลังและ DNA ของมนุษย์และอาณานิคม PCR ในการประเมินความไวต่อการติดเชื้อ [20] [21]
โปรโตคอลที่ดีที่สุดอธิบายไว้ด้านล่างในวัสดุและวิธีการมาตรา สั้น ๆ 1 มิลลิลิตรของเลือดถูกแทง (~100 โคโลนี / มิลลิลิตร) จะถูกเพิ่ม 9 มิลลิลิตรของสื่อการเจริญเติบโตและบ่มเป็นเวลา 9 ชั่วโมงในสภาพแวดล้อมที่ยาปฏิชีวนะต่างๆ กลุ่มตัวอย่างเป็น fractionated ที่จะแยกเซลล์เม็ดเลือดแดงที่มี heme, ยับยั้ง PCR สารละลายซึ่งประกอบด้วยเชื้อแบคทีเรียและเซลล์สัตว์เป็นเม็ดและ decanted เม็ดเป็น resuspended แล้วในบัฟเฟอร์สลายเลี้ยงลูกด้วยนมและรับการรักษาด้วย DNase เทคนิคนี้จะเอาดีเอ็นเอของมนุษย์ที่พบในเซลล์เม็ดเลือดขาวจากตัวอย่างจึงเพิ่มความไวของการตรวจสอบ นี้เป็นส่วนที่สำคัญของโปรโตคอลนี้เป็นดีเอ็นเอของมนุษย์พื้นหลังส่วนเกินสามารถเปียกโชกโค้งขยาย PCR เมื่อใช้ intercalating fluorophores กลุ่มตัวอย่างที่จะปั่นลงและเม็ดเซลล์ของแบคทีเรียที่มองไม่เห็นจะถูกล้างในน้ำเกลือ reticulocyte (RS) บัฟเฟอร์ เตรียมสรุปโดยการเพิ่ม 2 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างโดยตรงกับแผ่น PCR เป็นแม่แบบ วิธีการแยกเชื้อแบคทีเรียนี้จะใช้เวลาประมาณ 2-3 ชั่วโมงของการใช้แรงงาน แต่อาจจะเป็นไปโดยอัตโนมัติเพื่อลดเวลาในการเตรียมตัวอย่างและ multiplexed สำหรับการทดสอบสูง throughput ในการตั้งค่าการวินิจฉัยในห้องปฏิบัติการทางคลินิก.
ความเข้มข้นเชื้อโรคเป้าหมายของการ ~100 โคโลนี / มิลลิลิตรได้รับเลือกให้ เลียนแบบระดับพบทางการแพทย์ในกรณีการติดเชื้อ [22] - [24] สำหรับเชื้อมากกว่า 50% ของผู้ป่วยที่มีเกรดต่ำ (<10 โคโลนี / มิลลิลิตร) และ ~25% ของกรณีที่มีเชื้อเกรดสูง (> 100 โคโลนี / มิลลิลิตร) จึงทั้งนี้ความไวของการตรวจสอบอย่างน้อย 100 CFU / มิลลิลิตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

-
antibiogram PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้ทดลองการต้านจุลชีพ , การกำจัด preanalytic ของฮีมและดีเอ็นเอพื้นมนุษย์ และอาณานิคม PCR เพื่อประเมินเชื้อไว [ 20 ] , [ 21 ] การเพิ่มประสิทธิภาพวิธีการอธิบายไว้ด้านล่างในวัสดุและวิธีการ ส่วน สั้น ๆ1 มิลลิลิตรของเลือดถูกแทง ( ∼ 100 CFU / ml ) เพิ่ม 9 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อบ่มเป็นเวลา 9 ชั่วโมงในสภาพแวดล้อมที่ยาปฏิชีวนะต่าง ๆ ตัวอย่างลำดับการแยกเซลล์เม็ดเลือดแดงที่มีฮีม , ซึ่งยับยั้ง . และน่าน ซึ่งประกอบด้วย แบคทีเรีย และเซลล์เม็ด ) , และ ริน . เม็ดเป็นแล้ว resuspended ในการควบคุมการสลายบัฟเฟอร์ และการตรวจหา ADNase .เทคนิคนี้เอาของมนุษย์ดีเอ็นเอที่พบในเม็ดเลือดขาวจากตัวอย่าง จึง เพิ่มความไวของการตรวจหา นี้เป็นส่วนสําคัญของโปรโตคอลนี้เป็นพื้นหลัง DNA PCR แบบเกินมนุษย์สามารถแช่โค้งเมื่อใช้ intercalating fluorophores . ตัวอย่างจะปั่นลง และมองไม่เห็นเม็ดเซลล์แบคทีเรียล้างในน้ำเกลือเรติคิวโลไซต์ ( RS ) กันชนการเตรียมการสรุปโดยการเพิ่ม 2 µ l ตัวอย่างโดยตรงไปยังแผ่นซึ่งเป็นแม่แบบ การแยกแบคทีเรีย วิธีนี้ใช้เวลาประมาณ 2 – 3 ชั่วโมงของการใช้แรงงาน แต่อาจเป็นแบบอัตโนมัติเพื่อลดเวลาการเตรียมการและทดสอบตัวอย่างมัลติเพลกซ์ช่วยในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ
คลินิกการตั้งค่าเป้าหมายของ∼เชื้อโรคความเข้มข้น 100 cfu / ml ก็เลือกที่จะเลียนแบบระดับที่พบทางการแพทย์ในกรณีการติดเชื้อ [ 22 ] - [ 24 ] สำหรับแบคทีเรียมากกว่า 50% ของกรณีที่มีคุณภาพต่ำ ( < 10 CFU / มิลลิลิตร ) และ∼ 25% กรณีเป็นแบคทีเรียสูง ( > 100 cfu / ml ) จึงถูกการตรวจสอบความไวของอย่างน้อย 100 CFU / มล.