Plasmid constructs containing speci

Plasmid constructs containing specific viral target fragments were used as templates for optimisation of multiplex PCR and to measure the limit of detection for each virus by single and multiplex PCR. First round amplification products (Table
1) were separately cloned using the pGEM-T Easy Vector System II (Promega) and constructs were extracted using the Rapid Plasmid Daily-Prep Kit (V-Gene). The constructs were verified by PCR and DNA sequencing (Sangon). The DNA concentrations of the constructs were determined spectrophotometrically (Molecular Devices).The limit of detection for each target was defined as the highest dilution detected of a series of serially diluted (1:10) plasmid constructs of the target sequence. The multiplex PCR was optimised and standardised using various concentrations of MgCl2 (1–2 mM) and primers (0.2–1 mM), annealing temperatures (50–62 C) and numbers of cycles (30, 35, 40, 45) using the positive control plasmid constructs (data not shown). The optimum product yield was achieved with 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM primer for PCV-2, PPV and PRRSV and 0.25 mM primer for CSFV,an annealing temperature of 55 C and 35 cycles.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โครงสร้าง plasmid ที่ประกอบด้วยเป้าหมายเฉพาะไวรัสบางส่วนถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพ ของ multiplex PCR และ การวัดขีดจำกัดของการตรวจสอบสำหรับไวรัสแต่ละ โดยเดี่ยว และ multiplex PCR รอบแรก ขยายผลิตภัณฑ์ (ตาราง1) ถูกแยกโคลนใช้ T pGEM ง่ายเวกเตอร์ระบบ II (Promega) และโครงสร้างที่ถูกสกัดโดยใช้ Plasmid อย่างรวดเร็วทุกวันเตรียมชุด (V-ยีน) ของโครงสร้างถูกตรวจสอบ โดย PCR และดีเอ็นเอ (Sangon) การจัดลำดับ กำหนดความเข้มข้นของดีเอ็นเอของของโครงสร้าง spectrophotometrically (โมเลกุลอุปกรณ์) ขีดจำกัดของการตรวจสอบสำหรับแต่ละเป้าหมายถูกกำหนดเป็นการเจือจางสูงสุดที่ตรวจพบชุดของ serially เจือจาง (1:10) โครงสร้าง plasmid ของลำดับเป้าหมาย การ multiplex PCR ถูกเหมาะ และมาตรฐานโดยใช้ความเข้มข้นต่าง ๆ ของ MgCl2 (1-2 มิลลิเมตร) และไพรเมอร์ (0.2 – 1 มม.), หลอมอุณหภูมิ (C 50-62) และจำนวนรอบ (30, 35, 40, 45) โดยใช้โครงสร้าง plasmid ควบคุมบวก (ไม่แสดงข้อมูล) ผลตอบแทนที่เหมาะสมผลิตภัณฑ์สำเร็จกับ 1.5 mM มี MgCl2 รองพื้น 0.5 mM สำหรับ PCV-2, PPV และ PRRSV 0.25 มม.รองพื้นสำหรับ CSFV มีอุณหภูมิหลอม 55 C และ 35 รอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พลาสมิดที่มีโครงสร้างเฉพาะชิ้นส่วนเป้าหมายของไวรัสที่ใช้เป็นแม่แบบสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ multiplex PCR และการวัดขีด จำกัด ของการตรวจสอบสำหรับแต่ละไวรัสโดยเดี่ยวและ multiplex PCR ผลิตภัณฑ์แรกที่ขยายรอบ (ตารางที่
1) ถูกโคลนแยกโดยใช้ pGEM-T ใช้ง่ายเวกเตอร์ระบบ ii (Promega) และโครงสร้างที่ถูกสกัดโดยใช้ชุดอย่างรวดเร็วพลาสมิดเดลี่เตรียม (V-Gene) โครงสร้างถูกตรวจสอบโดยวิธี PCR และลำดับดีเอ็นเอ (Sangon) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอของโครงสร้างได้รับการพิจารณา spectrophotometrically (อุปกรณ์โมเลกุล) ขีด จำกัด ของการตรวจสอบสำหรับแต่ละเป้าหมายได้โดยเริ่มต้นถูกกำหนดเป็นเจือจางสูงสุดตรวจพบชุดของลำดับเจือจางโครงสร้าง (01:10) พลาสมิดของลำดับเป้าหมาย multiplex PCR ถูกปรับให้เหมาะสมและได้มาตรฐานโดยใช้ความเข้มข้นต่างๆของ MgCl2 (1-2 มิลลิเมตร) และไพรเมอร์ (0.2-1 มิลลิเมตร) อุณหภูมิการหลอม (50-62 องศาเซลเซียส) และหมายเลขโทรศัพท์ของรอบ (30 35, 40, 45) โดยใช้ ควบคุมบวกสร้างพลาสมิด (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ผลผลิตสินค้าที่ดีที่สุดก็ประสบความสำเร็จกับ 1.5 มิลลิ MgCl2, 0.5 มิลลิไพรเมอร์สำหรับ PCV-2, PPV และ PRRSV และ 0.25 มิลลิไพรเมอร์สำหรับ CSFV, อุณหภูมิการอบ 55 องศาเซลเซียสและ 35 รอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สร้างพลาสมิดที่มีเฉพาะไวรัสเป้าหมายเศษถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ multiplex PCR และวัดขีด จำกัด ของการตรวจหาไวรัสแต่ละโดยเดี่ยวและ multiplex PCR ผลิตภัณฑ์ขยายรอบแรก ( ตาราง1 ) ถูกแยกมาใช้ pgem-t ง่ายระบบเวกเตอร์ II ( promega ) และโครงสร้างที่ใช้พลาสมิดทุกวันอย่างรวดเร็วเตรียมชุด ( v-gene ) โครงสร้างที่ถูกตรวจสอบโดยวิธี PCR และดีเอ็นเอ ( แสงอ่อน ) ดีเอ็นเอ ความเข้มข้นของสารละลาย ( อุปกรณ์นี้โครงสร้างโมเลกุล ) ขีด จำกัด ของการตรวจสอบสำหรับแต่ละเป้าหมายที่กำหนดไว้สูงสุดที่ตรวจพบของชุดของการเจือจาง ( 1 : 10 ) เป็นโครงสร้างของดีเอ็นเอลำดับเป้าหมาย ส่วนเทคนิค multoplex PCR คือการปรับปรุงมาตรฐานความเข้มข้นต่าง ๆและใช้ไอโซโทป ( 1 – 2 มม. ) และไพรเมอร์ ( 0.2 - 1 มม. ) อุณหภูมิอบ ( 50 - 62 c ) และจำนวนรอบ ( 30 , 35 , 40 , 45 ) ใช้ควบคุมบวกสร้างพลาสมิด ( ข้อมูลไม่แสดง ) ผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมให้ผลสําเร็จ ด้วยชุด 1.5 มม. 0.5 มม. รองพื้นสำหรับ pcv-2 PPV และไวรัส , และ 0.25 มม. และไพรเมอร์สำหรับการ annealing อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสและ 35 รอบ