[0083] The resulting ไลบรารี is sub

[0083] The resulting ไลบรารี is subsequently superinfected in liquid culture with an appropriate MB-helper ฟาจ หรือ ไฮเปอร์ฟาจ in order to produce functional ฟาจมิด. The recombinant ฟาจมิด ดิสเพลย์ the ไลโปคาลิน มิวทีน on its surface as a fusion with the coat protein pill หรือ a ชิ้นส่วนย่อยของมัน, while the N-terminal signal sequence of the fusion protein is normally cleaved off. On the other hand, it also bears one หรือ more copies of the native แคปซิด protein pIII supplied by the ฟาจผู้ช่วย and is thus capable of infecting a recipient, in general a bacterial strain carrying an F- หรือ F'-plasmid. In case of ไฮเปอร์ฟาจ display, the ไฮเปอร์ฟาจมิด display the ไลโปคาลิน มิวทีน on their surface as a fusion with the infective coat protein pIII but no native แคปซิด protein. During หรือ after infection with ฟาจผู้ช่วย หรือ ไฮเปอร์ฟาจ, gene expression of the fusion protein between the ไลโปคาลิน มิวทีน and the แคปซิด protein pill can be induced, for example by addition of anhydrotetracycline. The induction conditions are chosen such that a substantial fraction of the ฟาจมิด obtained ดิสเพลย์ at least one ไลโปคาลิน มิวทีน on their surface. In case ofไฮเปอร์ฟาจ display induction conditions result in a population of ไฮเปอร์ฟาจมิด carrying between three and five fusion proteins consisting of the ไลโปคาลิน มิวทีน and the แคปซิด protein pIII. Various methods are known for isolating the ฟาจมิด, such as precipitation with polyethylene glycol. Isolation typically occurs after an incubation period of 6-8 hours.

[0084] The isolated phasmids can then be เป้าหมายed to selection by incubation with the desired target, โดยที่ the target is presented in a form allowing at least temporary immobilization of those ฟาจมิด which carry มิวทีน with the desired binding activity as fusion proteins in their coat. Among the รุรุต่างๆ known to the person skilled in the art, the target can, for example, be conjugated with a carrier protein such as serum albumin and be bound via this carrier protein to a protein binding surface, for example polystyrene. Microtiter plates suitable for ELISA techniques หรือ so-called "immuno-sticks" can for instance be used for such an immobilization of the target. Alternatively, conjugates of the target with other binding groups, such as biotin, can be used. The target can then be immobilized on a surface which selectively ยึดเกาะ this group, for example microtiter plates หรือ paramagnetic particles coated with streptavidin, neutravidin หรือ avidin. If the target is fused to an Fe portion of an immunoglobulin, immobilization can also be achieved with surfaces, for example, microtiter plates หรือ paramagnetic particles, which are coated with protein A หรือ protein G.

[0085] Non-specific ฟาจมิด-binding ตำแหน่ง present on the surfaces can be saturated with blocking solutions as they are known for ELISA methods. The ฟาจมิด are then typically brought into contact with the target immobilized on the surface in the presence of a physiological buffer. Unbound ฟาจมิด are removed by multiple washings. The ฟาจมิด particles remaining on the surface are then eluted. For elution, several methods are possible. For example, the ฟาจมิด can be eluted by addition of proteases หรือ in the presence of acids, bases, detergents หรือ chaotropic salts หรือ under moderately denaturing conditions. One such method is the elution using buffers of pH 2.2, โดยที่ the eluate is subsequently neutralized. Alternatively, a solution of the free target can be added in order to compete with the immobilized target for binding to the ฟาจมิด หรือ target-specific ฟาจมิด can be eluted by competition with immunoglobulins หรือ natural ลิแกนด์ing proteins which specifically ยึดเกาะto the target of interest.

[0086] Afterwards, E. coli cells are infected with the eluted ฟาจมิด. Alternatively, the nucleic acid sequences can be extracted from the eluted ฟาจมิด and used for sequence analysis, amplification หรือ transformation of cells in another manner. Starting from the E. coli clones obtained in this way, fresh ฟาจมิด หรือ ไฮเปอร์ฟาจมิด are again produced by superinfection with M13 ฟาจผู้ช่วยs หรือ ไฮเปอร์ฟาจ according to the method described above and the ฟาจมิด amplified in this way are once again เป้าหมายed to a selection on the immobilized target. Multiple selection cycles are often necessary in order to obtain the ฟาจมิด with the ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย in optimized form. The number of selection cycles is in some embodiments chosen in such a way that in the subsequent functional analysis at least 0.1 % of the clones studied produce มิวทีน with detectable แอฟฟินิตี้ for the given target. Depending on the size, i.e. the complexity of the ไลบรารี
employed, 2 to 8 cycles are typically required to this end.


[0087) For the functional analysis of the selected มิวทีน, an E. coli strain is infected with the ฟาจมิด obtained from the selection cycles and the corresponding double stranded phasmid DNA is isolated. Starting from this phasmid DNA, หรือ also from the single-stranded DNA extracted from the ฟาจมิด, the nucleic acid sequences of the selected มิวทีน of the การเปิดเผย can be determined by the methods known in the art and the amino acid sequence can be deduced therefrom. The mutated บริเวณ หรือ the sequence of the entire ไลโปคาลิน มิวทีน can be subcloned on another expression เวกเตอร์ and expressed in a suitable host organism. For example, the เวกเตอร์ pTLPC26 (as referred in the description of Figure 9), also called pTlc26, can be used for expression in E. coli strains such as E.coli TG 1. A ไลโปคาลิน มิวทีน thus produced can be purified by various biochemical methods. A ไลโปคาลิน มิวทีน produced, for example with pTlc26, may carry an แอฟฟินิตี้ peptide, a so called แอฟฟินิตี้ tag, for instance at its C-terminus and can therefore be purified by แอฟฟินิตี้ chromatography. Examples of an แอฟฟินิตี้ tag รวมถึง, but are not limited to biotin, the Strep-tag, Strep-tag II (Schmidt et al., ข้างต้น), oligohistidine, polyhistidine, an immunoglobulin domain, maltose-binding protein,
glutathione-S-transferase (GST) หรือ calmodulinbinding peptide (CBP).


[0088) Some แอฟฟินิตี้ tags are haptens, for example but not limited to, dinitrophenol and digoxigenin. Some แอฟฟินิตี้ tags are เอพิโทป tags, such as the FLAG®-peptide (Asp-Tyr• Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), the T7 เอพิโทป (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met• Gly), maltose binding protein (MBP), the HSV เอพิโทป of the sequence Gln-Pro-Glu-Leu-Ala•
Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp of herpes simplex virus glycoprotein D, the hemagglutinin (HA)

เอพิโทป of the sequence Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala, the VSV-G เอพิโทป of the Vesicular Stomatitis viral glycoprotein (Cys-Tyr-The-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys),the E เอพิโทป tag of the sequence Gly-Ala-Pro-Val~Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg,the E2 เอพิโทป tag of the sequence Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp-Phe-Arg-Asp-Arg, the Tag-
100 เอพิโทป tag of C-termini of mammalian MAPK/ERK kinases of the sequence Glu-Glu- Thr-Ala-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr-Arg-Ser, the S-tag of the sequence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala• Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser, the "myc" เอพิโทป of the transcription factor c• myc of the sequence Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu and the small VS เอพิโทป present on the P and V proteins of the paramyxovirus of Simian Virus 5 (Gly-Lys-Pro-Ile-Pro• Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr). In addition, but generally not as a single tag, a solubility-enhancing tag such as NusA, thioredoxin (TRX), small ubiquitin-like modifier (SUMO), and ubiquitin (Ub) may be used. Haptens and เอพิโทป tags may be used in combination with a corresponding antibody หรือ an antibody like proteinaceous molecule as binding partner. The S-peptide เอพิโทป of the sequence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe• Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser may be used as an เอพิโทป tag in connection with a respective antibody หรือ in combination with the S-protein as a binding partner (Hackbarth, JS, et al.,
BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839).


[0089] The selection can also be carried out by means of other methods. Many corresponding embodiments are known to the person skilled in the art หรือ are described in the literature. Moreover, a combination of methods can be applied. For example, clones selected หรือ at least enriched by "ฟาจ display" can additionally be เป้าหมายed to "colony screening". This procedure has the advantage that individual clones can directly be isolated with respect to the production of a ไลโปคาลิน มิวทีน with detectable binding แอฟฟินิตี้ for a target.

[0090] In addition to the use of E. coli as host organism in the "ฟาจ display" technique หรือ the "colony screening" method, other bacterial strains, yeast หรือ also insect cells หรือ mammalian cells can be used for this purpose. Further to the selection of a ไลโปคาลิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[0083] ไลบรารีผลลัพธ์เป็น superinfected ต่อมาในวัฒนธรรมของเหลวมีการไฮเปอร์ฟาจหรือฟาจ MB-ผู้ช่วยเหลือที่เหมาะสมเพื่อผลิตฟาจมิดที่ทำงาน ดิสเพลย์ recombinant ฟาจมิดมิวทีนไลโปคาลินบนพื้นผิวความเป็นฟิวชั่นกับตราโปรตีนยาหรือชิ้นส่วนย่อยของมันการ ในขณะที่ลำดับสัญญาณ N-เทอร์มินัลโปรตีนฟิวชั่นเป็นปกติแหวกออก บนมืออื่น ๆ มันยังหมีหนึ่งหรือสำเนาเพิ่มเติมของ pIII โปรตีนแคปซิดพื้นเมืองที่จัดทำ โดยฟาจผู้ช่วย และดังนั้นสามารถติดรับ โดยทั่วไปต้องใช้แบคทีเรียแบกเป็น F F หรือ'-plasmid ในกรณีที่แสดงไฮเปอร์ฟาจ ไฮเปอร์ฟาจมิดแสดงไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของพวกเขาเป็นฟิวชั่นกับ pIII โปรตีน infective ตราแต่ไม่แคปซิดเป็นโปรตีน ในระหว่างหรือหลังจากการติดเชื้อด้วยฟาจผู้ช่วยหรือไฮเปอร์ฟาจ ยีนของโปรตีนฟิวชั่นระหว่างไลโปคาลินมิวทีนยาแคปซิดโปรตีนสามารถจะเกิดจาก เช่นเพิ่ม anhydrotetracycline เงื่อนไขการเหนี่ยวนำจะถูกเลือกให้ดิสเพลย์ได้รับเศษของฟาจมิดพบน้อยไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของพวกเขา ในกรณีที่ ofไฮเปอร์ฟาจ แสดง ผลเหนี่ยวนำเงื่อนไขในประชากรถือครองระหว่างสาม และห้าอาหารโปรตีนประกอบด้วยไลโปคาลินมิวทีนและ pIII โปรตีนแคปซิดไฮเปอร์ฟาจมิด วิธีการต่าง ๆ เป็นที่รู้จักสำหรับแยกฟาจมิด เช่นฝนกับ polyethylene glycol แยกเกิดขึ้นหลังจากระยะการฟักตัว 6-8 ชั่วโมงโดยทั่วไป[0084] The isolated phasmids can then be เป้าหมายed to selection by incubation with the desired target, โดยที่ the target is presented in a form allowing at least temporary immobilization of those ฟาจมิด which carry มิวทีน with the desired binding activity as fusion proteins in their coat. Among the รุรุต่างๆ known to the person skilled in the art, the target can, for example, be conjugated with a carrier protein such as serum albumin and be bound via this carrier protein to a protein binding surface, for example polystyrene. Microtiter plates suitable for ELISA techniques หรือ so-called "immuno-sticks" can for instance be used for such an immobilization of the target. Alternatively, conjugates of the target with other binding groups, such as biotin, can be used. The target can then be immobilized on a surface which selectively ยึดเกาะ this group, for example microtiter plates หรือ paramagnetic particles coated with streptavidin, neutravidin หรือ avidin. If the target is fused to an Fe portion of an immunoglobulin, immobilization can also be achieved with surfaces, for example, microtiter plates หรือ paramagnetic particles, which are coated with protein A หรือ protein G.[0085] Non-specific ฟาจมิด-binding ตำแหน่ง present on the surfaces can be saturated with blocking solutions as they are known for ELISA methods. The ฟาจมิด are then typically brought into contact with the target immobilized on the surface in the presence of a physiological buffer. Unbound ฟาจมิด are removed by multiple washings. The ฟาจมิด particles remaining on the surface are then eluted. For elution, several methods are possible. For example, the ฟาจมิด can be eluted by addition of proteases หรือ in the presence of acids, bases, detergents หรือ chaotropic salts หรือ under moderately denaturing conditions. One such method is the elution using buffers of pH 2.2, โดยที่ the eluate is subsequently neutralized. Alternatively, a solution of the free target can be added in order to compete with the immobilized target for binding to the ฟาจมิด หรือ target-specific ฟาจมิด can be eluted by competition with immunoglobulins หรือ natural ลิแกนด์ing proteins which specifically ยึดเกาะto the target of interest.
[0086] Afterwards, E. coli cells are infected with the eluted ฟาจมิด. Alternatively, the nucleic acid sequences can be extracted from the eluted ฟาจมิด and used for sequence analysis, amplification หรือ transformation of cells in another manner. Starting from the E. coli clones obtained in this way, fresh ฟาจมิด หรือ ไฮเปอร์ฟาจมิด are again produced by superinfection with M13 ฟาจผู้ช่วยs หรือ ไฮเปอร์ฟาจ according to the method described above and the ฟาจมิด amplified in this way are once again เป้าหมายed to a selection on the immobilized target. Multiple selection cycles are often necessary in order to obtain the ฟาจมิด with the ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย in optimized form. The number of selection cycles is in some embodiments chosen in such a way that in the subsequent functional analysis at least 0.1 % of the clones studied produce มิวทีน with detectable แอฟฟินิตี้ for the given target. Depending on the size, i.e. the complexity of the ไลบรารี
employed, 2 to 8 cycles are typically required to this end.


[0087) For the functional analysis of the selected มิวทีน, an E. coli strain is infected with the ฟาจมิด obtained from the selection cycles and the corresponding double stranded phasmid DNA is isolated. Starting from this phasmid DNA, หรือ also from the single-stranded DNA extracted from the ฟาจมิด, the nucleic acid sequences of the selected มิวทีน of the การเปิดเผย can be determined by the methods known in the art and the amino acid sequence can be deduced therefrom. The mutated บริเวณ หรือ the sequence of the entire ไลโปคาลิน มิวทีน can be subcloned on another expression เวกเตอร์ and expressed in a suitable host organism. For example, the เวกเตอร์ pTLPC26 (as referred in the description of Figure 9), also called pTlc26, can be used for expression in E. coli strains such as E.coli TG 1. A ไลโปคาลิน มิวทีน thus produced can be purified by various biochemical methods. A ไลโปคาลิน มิวทีน produced, for example with pTlc26, may carry an แอฟฟินิตี้ peptide, a so called แอฟฟินิตี้ tag, for instance at its C-terminus and can therefore be purified by แอฟฟินิตี้ chromatography. Examples of an แอฟฟินิตี้ tag รวมถึง, but are not limited to biotin, the Strep-tag, Strep-tag II (Schmidt et al., ข้างต้น), oligohistidine, polyhistidine, an immunoglobulin domain, maltose-binding protein,
glutathione-S-transferase (GST) หรือ calmodulinbinding peptide (CBP).


[0088) Some แอฟฟินิตี้ tags are haptens, for example but not limited to, dinitrophenol and digoxigenin. Some แอฟฟินิตี้ tags are เอพิโทป tags, such as the FLAG®-peptide (Asp-Tyr• Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), the T7 เอพิโทป (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met• Gly), maltose binding protein (MBP), the HSV เอพิโทป of the sequence Gln-Pro-Glu-Leu-Ala•
Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp of herpes simplex virus glycoprotein D, the hemagglutinin (HA)

เอพิโทป of the sequence Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala, the VSV-G เอพิโทป of the Vesicular Stomatitis viral glycoprotein (Cys-Tyr-The-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys),the E เอพิโทป tag of the sequence Gly-Ala-Pro-Val~Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg,the E2 เอพิโทป tag of the sequence Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp-Phe-Arg-Asp-Arg, the Tag-
100 เอพิโทป tag of C-termini of mammalian MAPK/ERK kinases of the sequence Glu-Glu- Thr-Ala-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr-Arg-Ser, the S-tag of the sequence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala• Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser, the "myc" เอพิโทป of the transcription factor c• myc of the sequence Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu and the small VS เอพิโทป present on the P and V proteins of the paramyxovirus of Simian Virus 5 (Gly-Lys-Pro-Ile-Pro• Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr). In addition, but generally not as a single tag, a solubility-enhancing tag such as NusA, thioredoxin (TRX), small ubiquitin-like modifier (SUMO), and ubiquitin (Ub) may be used. Haptens and เอพิโทป tags may be used in combination with a corresponding antibody หรือ an antibody like proteinaceous molecule as binding partner. The S-peptide เอพิโทป of the sequence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe• Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser may be used as an เอพิโทป tag in connection with a respective antibody หรือ in combination with the S-protein as a binding partner (Hackbarth, JS, et al.,
BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839).


[0089] The selection can also be carried out by means of other methods. Many corresponding embodiments are known to the person skilled in the art หรือ are described in the literature. Moreover, a combination of methods can be applied. For example, clones selected หรือ at least enriched by "ฟาจ display" can additionally be เป้าหมายed to "colony screening". This procedure has the advantage that individual clones can directly be isolated with respect to the production of a ไลโปคาลิน มิวทีน with detectable binding แอฟฟินิตี้ for a target.

[0090] In addition to the use of E. coli as host organism in the "ฟาจ display" technique หรือ the "colony screening" method, other bacterial strains, yeast หรือ also insect cells หรือ mammalian cells can be used for this purpose. Further to the selection of a ไลโปคาลิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[0083] ที่ไลบรารีที่เกิด superinfected ต่อมาในวัฒนธรรมที่มีของเหลวที่เหมาะสม MB-ผู้ช่วยฟาจหรือไฮเปอร์ฟาจในการสั่งซื้อการผลิตการทำงานฟาจมิด recombinant ฟาจมิดดิสเพลย์ไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของมันเป็นฟิวชั่นกับยาโปรตีนเสื้อหรือชิ้นส่วนย่อยของมันในขณะที่ลำดับสัญญาณ n- ขั้วของโปรตีนฟิวชั่นที่มีการตัดปกติออก . ในทางกลับกันก็ยังหมีหนึ่งหรือสำเนาของพื้นเมืองแคปซิดโปรตีน PIII จัดทำโดยฟาจผู้ช่วยและดังนั้นจึงเป็นความสามารถในการติดไวรัสผู้รับโดยทั่วไปสายพันธุ์แบคทีเรียถือ F- หรือ F'- พลาสมิด ในกรณีที่มีไฮเปอร์ฟาจจอแสดงผลที่ไฮเปอร์ฟาจมิดแสดงไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของพวกเขาเป็นฟิวชั่นกับ PIII โปรตีนเสื้อติดเชื้อ แต่ไม่มีพื้นเมืองแคปซิดโปรตีน ในระหว่างหรือหลังจากการติดเชื้อฟาจผู้ช่วยหรือไฮเปอร์ฟาจ, การแสดงออกของยีนของโปรตีนฟิวชั่นระหว่างไลโปคาลินมิวทีนและแคปซิดยาโปรตีนสามารถชักนำเช่นโดยการเพิ่มขึ้นของ anhydrotetracycline . เงื่อนไขการเหนี่ยวนำได้รับการแต่งตั้งดังกล่าวว่าเป็นส่วนหนึ่งที่สำคัญของฟาจมิดดิสเพลย์ได้รับอย่างน้อยหนึ่งไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของพวกเขา ในกรณีที่มีไฮเปอร์ฟาจจอแสดงผลสภาพการเหนี่ยวนำส่งผลให้ประชากรของไฮเปอร์ฟาจมิดดำเนินการระหว่างสามและห้าโปรตีนประกอบด้วยไลโปคาลินมิวทีนและแคปซิดโปรตีน PIII วิธีการต่างๆที่เป็นที่รู้จักสำหรับการแยกฟาจมิดเช่นการเร่งรัดกับเอทิลีนไกลคอล แยกมักจะเกิดขึ้นหลังจากระยะฟักตัวประมาณ 6-8 ชั่วโมง. [0084] ที่ phasmids แยกนั้นจะสามารถเอ็ดเป้าหมายการเลือกโดยการบ่มด้วยเป้าหมายที่ต้องการโดยที่เป้าหมายจะถูกนำเสนอในรูปแบบที่ช่วยให้อย่างน้อยตรึงชั่วคราวของฟาเหล่านั้น จมิดที่ดำเนินมิวทีนกับกิจกรรมที่มีผลผูกพันที่ต้องการโปรตีนฟิวชั่นในเสื้อของพวกเขา ท่ามกลางรุรุต่างๆที่รู้จักกันกับคนที่มีฝีมือในงานศิลปะเป้าหมายสามารถยกตัวอย่างเช่นจะผันกับโปรตีนที่ให้บริการเช่นเซรั่มอัลบูมิและจะผูกพันผ่านเพชรรัตน์นี้ให้โปรตีนพื้นผิวที่มีผลผูกพันเช่นสไตรีน แผ่นไมโครเหมาะสำหรับเทคนิควิธี ELISA หรือที่เรียกว่า "อิมมูโนแท่ง" ตัวอย่างเช่นสามารถนำมาใช้สำหรับการดังกล่าวตรึงเป้าหมายที่ อีกทางเลือกหนึ่งของ conjugates กับกลุ่มเป้าหมายที่มีผลผูกพันอื่น ๆ เช่นไบโอตินที่สามารถนำมาใช้ เป้าหมายนั้นจะสามารถตรึงบนพื้นผิวซึ่งคัดเลือกยึดเกาะกลุ่มนี้เช่นแผ่นไมโครหรืออนุภาค paramagnetic เคลือบด้วย streptavidin, neutravidin หรือ avidin ถ้าเป้าหมายคือการหลอมรวมกับส่วนของอิมมูโนเฟการตรึงยังสามารถประสบความสำเร็จกับพื้นผิวเช่นแผ่นไมโครหรืออนุภาค paramagnetic ซึ่งเคลือบด้วยโปรตีนหรือโปรตีนกรัม[0085] ฟาไม่เฉพาะจมิด - มีผลผูกพันตำแหน่งปัจจุบันบนพื้นผิวที่สามารถอิ่มตัวกับการปิดกั้นการแก้ปัญหาที่พวกเขาเป็นที่รู้จักกันสำหรับวิธี ELISA ฟาจมิดแล้วมักจะนำเข้ามาติดต่อกับเป้าหมายตรึงบนพื้นผิวในการปรากฏตัวของบัฟเฟอร์ทางสรีรวิทยา หลุดฟาจมิดจะถูกลบออกโดยการซักหลาย ๆ ฟาจมิดอนุภาคที่เหลืออยู่บนพื้นผิวแล้วชะ สำหรับชะ, วิธีการหลายวิธีที่เป็นไปได้ ยกตัวอย่างเช่นฟาจมิดสามารถชะโดยนอกเหนือจากโปรตีเอสหรือในการปรากฏตัวของกรด, เบส, ผงซักฟอกหรือเกลือ chaotropic หรือภายใต้เงื่อนไข denaturing ปานกลาง วิธีการหนึ่งที่ดังกล่าวเป็นชะใช้บัฟเฟอร์ค่า pH 2.2 ที่โดยที่ eluate เป็นธรรมชาติต่อมา อีกวิธีหนึ่งคือการแก้ปัญหาของเป้าหมายฟรีสามารถเพิ่มเพื่อที่จะแข่งขันกับเป้าหมายตรึงสำหรับการผูกกับฟาจมิดหรือฟาเป้าหมายเฉพาะจมิดสามารถชะจากการแข่งขันที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องลิธรรมชาติหรือแกนด์ไอเอ็นจีโปรตีนที่เฉพาะยึด เกาะไปยังเป้าหมายที่น่าสนใจ. [0086] หลังจากนั้นเซล E.coli มีการติดเชื้อที่มีชะฟาจมิด อีกทางเลือกหนึ่งลำดับกรดนิวคลีสามารถสกัดได้จากชะฟาจมิดและใช้ในการวิเคราะห์ลำดับการขยายหรือการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ในลักษณะอื่น เริ่มต้นจากอีโคไลโคลนที่ได้รับในวิธีนี้สดฟาจมิดหรือไฮเปอร์ฟาจมิดที่มีการผลิตอีกครั้งโดย superinfection กับ M13 ฟาจผู้ช่วย s หรือไฮเปอร์ฟาจตามวิธีการที่อธิบายข้างต้นและฟาจมิด ขยายในลักษณะนี้เป็นอีกครั้งหนึ่งที่เอ็ดเป้าหมายการเลือกบนเป้าหมายตรึง รอบการเลือกหลายมักจะมีความจำเป็นในการที่จะได้รับฟาจมิดกับไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยในรูปแบบที่ดีที่สุด จำนวนรอบของการเลือกที่อยู่ในบาง embodiments ได้รับการแต่งตั้งในลักษณะที่ว่าในการวิเคราะห์การทำงานที่ตามมาอย่างน้อย 0.1% ของโคลนศึกษาการผลิตมิวทีนที่มีการตรวจพบแอฟฟินิตี้สำหรับเป้าหมายที่กำหนด ขึ้นอยู่กับขนาดคือความซับซ้อนของไลบรารีที่ลูกจ้าง 2-8 รอบโดยทั่วไปจะต้องเพื่อการนี้. [0087) สำหรับการวิเคราะห์การทำงานของที่เลือกมิวทีน, สายพันธุ์เชื้อ E. coli ติดฟาจ มิดที่ได้รับจากรอบคัดเลือกและดีเอ็นเอ phasmid ควั่นคู่ที่สอดคล้องกันจะแยก เริ่มต้นจากดีเอ็นเอ phasmid นี้หรือยังมาจากดีเอ็นเอเดียวควั่นสกัดจากฟาจมิดที่ลำดับกรดนิวคลีอิกของที่เลือกมิวทีนของการเปิดเผยจะถูกกำหนดโดยวิธีการที่เป็นที่รู้จักกันในงานศิลปะและกรดอะมิโน ลำดับสามารถสรุปนั้น กลายพันธุ์บริเวณหรือลำดับของทั้งไลโปคาลินมิวทีนสามารถ subcloned การแสดงออกอีกเวกเตอร์และแสดงออกในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ที่เหมาะสม ยกตัวอย่างเช่นเวกเตอร์ pTLPC26 (ตามที่กล่าวในรายละเอียดของรูปที่ 9) เรียกว่า pTlc26 สามารถนำมาใช้สำหรับการแสดงออกใน E. coli สายพันธุ์เช่น E.coli TG 1. ไลโปคาลินมิวทีน ผลิตสามารถทำให้บริสุทธิ์โดยวิธีทางชีวเคมีต่างๆ ไลโปคาลินมิวทีนผลิตเช่นกับ pTlc26 อาจนำแอฟฟินิตี้เปปไทด์ที่เรียกว่าแอฟฟินิตี้แท็กเช่นที่ C-ปลายทางและดังนั้นจึงสามารถนำมาทำให้บริสุทธิ์ด้วย แอฟฟินิตี้โค ตัวอย่างของแอฟฟินิตี้แท็กรวมถึง แต่ไม่ จำกัด เฉพาะไบโอตินที่ Strep แท็ก Strep แท็กครั้งที่สอง (Schmidt et al., ข้างต้น) oligohistidine, polyhistidine, โดเมนอิมมูโนโปรตีนมอลโตสที่มีผลผูกพัน , กลูตาไธโอน-S-transferase (GST) หรือ calmodulinbinding เปปไทด์ (CBP). [0088) บางแอฟฟินิตี้แท็ก haptens เช่น แต่ไม่ จำกัด เฉพาะการ dinitrophenol และ digoxigenin บางแอฟฟินิตี้แท็กเอพิโทปแท็กเช่นFLAG®เปปไทด์ (ASP-เทอร์ลิซ•-ASP-ASP-ASP-ASP-Lys-Gly) ที่ T7 เอพิโทป (Ala- Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met • Gly), มอลโตโปรตีน (MBP) ที่ HSV เอพิโทปลำดับ Gln-Pro-Glu-Leu-Ala • Pro-Glu-งูเห่า -Pro-Glu-งูเห่าของเชื้อไวรัสเริม D ไกลโคโปรตีนที่ hemagglutinin (HA) เอพิโทปของลำดับเทอร์-Pro-เทอร์-Asp-Val-Pro-ASP-เทอร์-Ala ที่ VSV-G เอพิโท ปของไกลโคโปรตีนไวรัส Vesicular Stomatitis (Cys-เทอร์-The-ASP-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys), อีเอพิโทปแท็กของลำดับ Gly-Ala-Pro-Val ~ Pro -Tyr-Pro-ASP-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg ที่ E2 เอพิโทปแท็กของลำดับ Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-งูเห่าเพ-Arg-ASP-หาเรื่อง ที่ Tag- 100 เอพิโทปแท็ก C-ปลายทางของการเลี้ยงลูกด้วยนม MAPK / ERK ไคเนสส์ของลำดับ Glu-Glu- Thr-Ala-Arg เพ-Gln-Pro-Gly-เทอร์-Arg-Ser ที่ S- แท็กของลำดับ Lys-Glu-Thr-Ala-Ala • Ala-Lys เพ-Glu-Arg-Gln พระองค์-Met-ASP-Ser ที่ "myc" เอพิโทปของถอดความปัจจัยค• myc ของ ลำดับ Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-ASP-Leu และขนาดเล็ก VS เอพิโทปอยู่บนโปรตีน P และ V ของ paramyxovirus ไวรัสเหมือนลิงที่ 5 (Gly-Lys-โปร Ile-Pro • Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-ASP-Ser-Thr) นอกจากนี้ แต่โดยทั่วไปไม่เป็นแท็กเดียวแท็กสามารถในการละลายเพิ่มเช่น Nusa, Thioredoxin (TRX) ขนาดเล็กปรับปรุง ubiquitin เหมือน (SUMO) และ ubiquitin (Ub) อาจจะใช้ Haptens และเอพิโทปแท็กอาจจะใช้ร่วมกับแอนติบอดี้ที่สอดคล้องกันหรือแอนติบอดีเช่นโมเลกุลโปรตีนเป็นพันธมิตรผูกพัน S-เปปไทด์เอพิโทปของลำดับ Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys เพ• Glu-Arg-Gln พระองค์-Met-ASP-Ser อาจจะนำมาใช้เป็นเอพิโทปแท็ก ในการเชื่อมต่อกับแอนติบอดี้ที่เกี่ยวข้องหรือร่วมกับ S-โปรตีนเป็นพันธมิตรที่มีผลผูกพัน (Hackbarth, JS, et al., BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839). [0089] เลือกนอกจากนี้ยังสามารถดำเนินการได้ โดยวิธีการของวิธีการอื่น ๆ embodiments ที่สอดคล้องกันหลายคนเป็นที่รู้จักกันคนที่มีทักษะในงานศิลปะหรือที่อธิบายไว้ในวรรณคดี นอกจากนี้การรวมกันของวิธีสามารถนำมาใช้ ยกตัวอย่างเช่นโคลนหรือเลือกอย่างน้อยอุดมไปด้วย "ฟาจจอแสดงผล" นอกจากนี้ยังสามารถเป็นเป้าหมายเอ็ด "การตรวจคัดกรองอาณานิคม" ขั้นตอนนี้จะมีประโยชน์ที่โคลนแต่ละโดยตรงสามารถแยกส่วนที่เกี่ยวกับการผลิตของไลโปคาลินมิวทีนที่มีการตรวจพบการผูกแอฟฟินิตี้สำหรับเป้าหมายที่. [0090] นอกเหนือไปจากการใช้อี . โคไลเป็นสิ่งมีชีวิตที่เป็นเจ้าภาพใน "ฟาจจอแสดงผล" เทคนิคหรือ "การตรวจคัดกรองอาณานิคม" วิธีการสายพันธุ์แบคทีเรียอื่น ๆ ยีสต์หรือยังเซลล์แมลงหรือเซลล์สัตว์สามารถนำมาใช้เพื่อการนี้ นอกจากนี้การเลือกของไลโปคาลิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ ] ไลบรารี 0083 ที่เกิดเป็นต่อมา superinfected ในของเหลววัฒนธรรมที่มีความเหมาะสมบางครั้งผู้ช่วยฟาจค็อคไฮเปอร์ฟาจเพื่อผลิตงานฟาจมิด . การใช้ฟาจมิดดิสเพลย์ที่ไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของมันเป็นฟิวชั่นกับโปรตีนหุ้มเม็ดเป็นชิ้นส่วนย่อยของมันค็อค ,ในขณะที่สัญญาณลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนเป็นปกติของการปิด บนมืออื่น ๆ , นอกจากนี้ยังหมีหนึ่งค็อคเพิ่มเติมฉบับพื้นเมืองแคปซิดโปรตีน piii จัดโดยฟาจผู้ช่วยและจึงสามารถติดต่อผู้รับ โดยทั่วไปแบคทีเรียสายพันธุ์ที่ถือ F - ค็อค F ' - พลาสมิด ในกรณีของไฮเปอร์ฟาจแสดงการไฮเปอร์ฟาจมิดแสดงมิวทีนไลโปคาลินบนพื้นผิวของพวกเขาเป็นฟิวชั่นกับไม่มีโปรตีนห่อหุ้ม piii แต่ไม่มีพื้นเมืองแคปซิดโปรตีน ระหว่างค็อคหลังจากการติดเชื้อกับฟาจผู้ช่วยค็อคไฮเปอร์ฟาจ , การแสดงออกของยีนในส่วนของโปรตีนระหว่างไลโปคาลินมิวทีนและแคปซิดโปรตีนสามารถนำยา ,ตัวอย่างเช่นโดยการ anhydrotetracycline . เงื่อนไขการเลือกดังกล่าวว่าส่วนมากของฟาจมิดได้รับดิสเพลย์อย่างน้อยหนึ่งไลโปคาลินมิวทีนบนพื้นผิวของพวกเขาในกรณีของการไฮเปอร์ฟาจแสดงเงื่อนไขผลในประชากรไฮเปอร์ฟาจมิดแบกระหว่างสามและห้าฟิวชันโปรตีนประกอบด้วยไลโปคาลินมิวทีนและแคปซิดโปรตีน piii . วิธีการต่าง ๆเป็นที่รู้จักกันสำหรับการแยกฟาจมิดเช่นการตกตะกอนด้วย polyethylene glycol .การแยกมักจะเกิดขึ้นผ่านระยะฟักตัว 6-8 ชม.

[ กระดาษ ] แยก phasmids จากนั้นจะสามารถเป้าหมายเอ็ดเลือกโดยการบ่มด้วยเป้าหมายที่ต้องการโดยที่ , เป้าหมายที่แสดงในฟอร์มให้อย่างน้อยชั่วคราวการตรึงที่ฟาจมิดซึ่งถือมิวทีนกับที่ต้องการผูกกิจกรรมเป็นฟิวชันโปรตีนในเสื้อของพวกเขาระหว่างรุรุต่างๆรู้จักคนที่มีความสามารถในศิลปะ เป้าหมายได้ ตัวอย่างเช่น เป็นคอนจูเกตกับผู้ให้บริการเช่นโปรตีนอัลบูมินต้องผ่านทางนี้เพื่อขนส่งโปรตีนโปรตีนผิว เช่น โฟมแผ่นเหมาะสำหรับ ELISA เทคนิคไมโครค็อคที่เรียกว่า " มมูโน sticks " สามารถยกตัวอย่างเช่นใช้เช่นการตรึงเป้าหมาย หรือสารประกอบของเป้าหมาย ด้วยกลุ่มอื่น ๆ รวม เช่น biotin , สามารถใช้ เป้าหมายจากนั้นจะสามารถตรึงบนพื้นผิวที่เลือกยึดเกาะกลุ่มนี้ตัวอย่างเช่น แผ่นไมโครค็อคพาราแมกเนติก อนุภาคที่เคลือบด้วย streptavidin neutravidin ค็อค , วิดิน . ถ้าเป้าหมายคือผสมกับเหล็กส่วนของอิมมูโนโกลบุลินยังสามารถทำได้ด้วยการตรึง , พื้นผิว เช่น แผ่นไมโครค็อคอนุภาคพาราแมกเนติกซึ่งเคลือบด้วยโปรตีนโปรตีน G .

ค็อค[ 0085 ] ไม่เฉพาะเจาะจงฟาจมิด - ผูกตำแหน่งปัจจุบันบนพื้นผิวสามารถอิ่มตัวกับบล็อกโซลูชั่นตามที่พวกเขาเป็นที่รู้จักกันสำหรับวิธี ELISA การฟาจมิดแล้วมักจะเข้ามาติดต่อกับเป้าหมายที่ถูกตรึงบนพื้นผิวในการปรากฏตัวของบัฟเฟอร์ทางสรีรวิทยา หลุดฟาจมิดจะถูกลบออกโดยหลาย washings .การฟาจมิดอนุภาคที่เหลืออยู่บนผิว จากนั้นตัวอย่าง . ให้ใช้วิธีการหลายที่เป็นไปได้ ตัวอย่างเช่น ฟาจมิดสามารถตัวอย่างโดยนอกเหนือจากทางค็อคในการแสดงตนของกรด เบส เกลือ ผงซักฟอก ค็อค chaotropic ปานกลางี่ค็อค ภายใต้เงื่อนไข เช่น วิธีหนึ่งคือการใช้บัฟเฟอร์ pH 2.2 ,โดยที่ในสารละลาย ( eluate ) คือภายหลังแล้ว อีกวิธีหนึ่งคือ โซลูชันของเป้าหมายฟรีสามารถเพิ่มเพื่อที่จะแข่งขันกับตรึงเป้าหมายสำหรับผูกกับเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงฟาจมิดค็อคฟาจมิดสามารถตัวอย่าง โดยการแข่งขันกับมมูโนโกลบูลินค็อคลิแกนด์ธรรมชาติไอเอ็นจีโปรตีนโดยเฉพาะยึดเกาะไปยังเป้าหมายที่น่าสนใจ