2.5. Malondialdehyde (MDA) content

2.5. Malondialdehyde (MDA) content and lipoxygenase (LOX) activity determination

MDA content was determined according to the method described by Li et al. (2006) with some modification. Fruit tissues (1 g) were extracted with 5 mL of 200 mmol L−1 sodium phosphate buffer (pH 6.8). Three milliliters of 0.5% thiobarbituric acid (TBA) were added to 1 mL of the extract. The solution was heated in a boiling water bath for 20 min, then immediately cooled, and finally centrifuged at 10,000 × g for 10 min to clarify the solution. Absorbance was measured at 450, 532 and 600 nm. MDA content was expressed as mmol kg−1 of fresh weight by the method of Li et al. (2006).

LOX activity was assayed by the method described as Tao et al. (2008). One unit of LOX activity was defined as 0.1 change of absorbance at 234 nm per min. Specific LOX activity was expressed as units per kilogram of fruit fresh weight.

2.6. Total anthocyanin and total phenolic contents determination

Two gram samples from each replicate were treated with liquid nitrogen, and then pulverized and extracted with 25 mL of pre-cooled 70% ethanol containing 1% hydrochloric acid (v/v) for 3 h, and centrifuged at 10,000 × g for 15 min (4 °C). The supernatant was adjusted to 25 mL for analysis.

Total anthocyanin content of mulberry extract was measured using the pH differential method (Yang et al., 2009). Absorbance was measured at 510 and 700 nm, respectively, in different buffers at pH 1.0 and 4.5, using A = [(A510 − A700)pH 1.0 − (A510 − A700)pH 4.5] with a molar extinction coefficient of cyaniding 3-glucoside of 29,600. Results were expressed as grams of cyaniding 3-glucoside (C 3-G) equivalents per kilogram of fresh weight. Total phenolic contents were estimated colourimetrically Folin–Ciocalteu method ( Zheng et al., 2003 and Yang et al., 2009). Gallic acid was used as a standard, and phenolic contents were expressed as grams of gallic acid equivalents (GAE) per kilogram of fresh weight.

2.7. Antioxidant enzyme measurements

Two grams of fruit tissues were homogenized in 10 mL of 100 mmol L−1 sodium phosphate buffer (pH 7.8) containing 5% polyvinylpyrrolidone and 5 mmol L−1 1,4-dithiothreitol at 4 °C. The homogenate was centrifuged at 10,000 × g for 15 min at 4 °C, and then the supernatant was collected for SOD activity assay as described by Yang et al. (2009) with some modification. The reaction medium contained 1.7 mL of 50 mmol L−1 sodium phosphate buffer (pH 7.8), 0.3 mL of 130 mmol L−1 methionine, 0.3 mL of 100 μmol L−1 EDTA-Na, 0.3 mL of 750 μmol L−1 nitroblue-tetrazolium (NBT), 0.3 mL of 20 μmol L−1 riboflavin, and 25 μL of enzyme extract. The reaction was initiated by switching on the light consisting of two 4000 lx fluorescent lamps; after 25 min, the light was turned off, and the absorbance at 560 nm was recorded. One unit of SOD activity was defined as the amount of enzyme that caused a 50% inhibition of NBT. Results were expressed as units of SOD per kilogram of fresh weight.

For CAT activity assay, two grams of fruit tissues were treated with liquid nitrogen, pulverized and extracted in 10 mL of 100 mmol L−1 Tris–HCl buffer (pH 7.8) containing 2 mmol L−1 EDTA-Na and 5 mmol L−1 1,4-dithiothreitol. The enzyme extract was obtained by centrifugation at 12,000 × g for 10 min (4 °C). CAT activity was determined according to the method of Hu et al. (2014) with slight modifications. The reaction mixture consisted of 3 mL of 100 mmol L−1 Tris–HCl buffer (pH 7.8), 0.1 mL of 0.75% H2O2 and 0.2 mL of crude enzyme extract. H2O2 decomposition was measured by the decline in absorbance at 240 nm. One unit of CAT activity was defined as 0.01 change of absorbance at 240 nm per minute. Specific CAT activity was expressed as units per kilogram of fresh fruit weight.

For POD activity assay, two grams of fruit tissues were treated with liquid nitrogen, pulverized and extracted in 10 mL of 200 mmol L−1 sodium phosphate buffer (pH 6.8) containing 8% polyvinylpyrrolidone. The crude enzyme extract was obtained by centrifugation at 8000 × g for 20 min (4 °C). POD activity was determined according to the method of Yang et al. (2009) with some modifications. The reaction mixture consisted of 0.3 mL of 6 mmol L−1 guaiacol, 1.7 mL of 5 mmol L−1 H2O2, and 1 mL of crude enzyme extract. Increases in absorbance at 470 nm at intervals of 30 s were recorded spectrophotometrically. One unit of POD activity was defined as 0.01 change of absorbance at 470 nm per min. Specific POD activity was expressed as units per kilogram of fresh fruit weight.

For As-POD activity assay, two grams of fruit tissues were treated with liquid nitrogen, pulverized and extracted in 10 mL of 50 mmol L−1 sodium phosphate buffer (pH 7.0). The crude enzyme extract was obtained by centrifugation at 12,000 × g for 15 min (4 °C). As-POD activity was determined according to the method of Yang et al. (2009) with slight modifications. The reaction mixture consisted of 1.5 mL of 0.1875 mmol L−1 EDTA-Na, 1 m

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 Malondialdehyde (MDA) เนื้อหาและ lipoxygenase (แซลมอนรมควัน) การกำหนดกิจกรรมเนื้อหาภาคตะวันออกเฉียงเหนือได้รับการพิจารณาตามวิธีการที่อธิบายโดย Li et al, (2006) กับการปรับเปลี่ยนบางอย่าง เนื้อเยื่อผลไม้ (1 กรัม) ถูกสกัดด้วยขนาด 5 ml 200 มิลลิโมลบัฟเฟอร์ L-1 โซเดียมฟอสเฟต (pH 6.8) สามมิลลิลิตรของกรด thiobarbituric 0.5% (TBA) ถูกเพิ่มเข้าไปใน 1 มิลลิลิตรของสารสกัด วิธีการแก้ปัญหาที่ถูกความร้อนในอ่างน้ำเดือด 20 นาทีแล้วระบายความร้อนได้ทันทีและในที่สุดก็หมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อชี้แจงการแก้ปัญหา การดูดกลืนแสงวัดที่ 450, 532 และ 600 นาโนเมตร เนื้อหาภาคตะวันออกเฉียงเหนือได้รับการแสดงเป็นมิลลิโมลต่อกิโลกรัม 1 ของน้ำหนักสดโดยวิธี Li et al, (2006). กิจกรรมแซลมอนรมควันได้รับการวิเคราะห์โดยวิธีการอธิบายเป็นเต่า, et al (2008) หนึ่งหน่วยของกิจกรรม LOX ถูกกำหนดเป็น 0.1 การเปลี่ยนแปลงของการดูดกลืนแสงที่ 234 นาโนเมตรต่อนาที กิจกรรมแซลมอนรมควันโดยเฉพาะได้รับการแสดงเป็นหน่วยต่อกิโลกรัมของน้ำหนักสดผลไม้. 2.6 รวม anthocyanin และเนื้อหาฟีนอลรวมความมุ่งมั่นสองตัวอย่างกรัมจากแต่ละซ้ำได้รับการรักษาด้วยไนโตรเจนเหลวและจากนั้นบดและสกัดด้วย 25 มลก่อนระบายความร้อนด้วย 70% เอทานอลที่มี 1% กรดไฮโดรคลอริก (v / v) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงและหมุนเหวี่ยง 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาที (4 ° C) ใสปรับถึง 25 มลสำหรับการวิเคราะห์. เนื้อหา anthocyanin รวมของสารสกัดจากใบหม่อนวัดโดยใช้วิธีการวัดค่า pH ค่า (Yang et al., 2009) การดูดกลืนแสงวัดที่ 510 และ 700 นาโนเมตรตามลำดับในบัฟเฟอร์ที่แตกต่างกันที่พีเอช 1.0 และ 4.5 โดยใช้ = [(A510 - A700) ค่า pH 1.0 - (A510 - A700) ค่า pH 4.5] ด้วยค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียฟันกรามของ cyaniding 3 glucoside ของ 29,600 ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นกรัมของ cyaniding 3 glucoside (C 3 G) เทียบเท่าต่อกิโลกรัมของน้ำหนักสด เนื้อหาฟีนอลรวมอยู่ที่ประมาณ colourimetrically วิธี Folin-Ciocalteu (เจิ้งเหอ et al., 2003 และยาง et al., 2009) กรดฝรั่งเศสถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานและเนื้อหาฟีนอลถูกแสดงเป็นกรัมเทียบเท่ากรดแกลลิ (GAE) ต่อกิโลกรัมของน้ำหนักสด. 2.7 การตรวจวัดสารต้านอนุมูลอิสระเอนไซม์สองกรัมของเนื้อเยื่อผลไม้ที่ถูกปั่นใน 10 มล 100 มิลลิโมลบัฟเฟอร์ L-1 โซเดียมฟอสเฟต (pH 7.8) ที่มี 5% polyvinylpyrrolidone และ 5 มิลลิโมล L-1 1,4-dithiothreitol ที่ 4 ° C homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสและจากนั้นใสที่ถูกเก็บไว้สำหรับการทดสอบกิจกรรม SOD ตามที่อธิบายยาง, et al (2009) กับการปรับเปลี่ยนบางอย่าง กลางปฏิกิริยาที่มีอยู่ 1.7 มิลลิลิตร 50 มิลลิโมล L-1 บัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต (pH 7.8) 0.3 มล 130 มิลลิโมล L-1 methionine, 0.3 มล 100 ไมโครโมล L-1 EDTA-Na, 0.3 มล L-1 750 ไมโครโมล nitroblue-tetrazolium (NBT) 0.3 มล 20 ไมโครโมล L-1 riboflavin, และ 25 ไมโครลิตรของสารสกัดจากเอนไซม์ ปฏิกิริยาที่ได้ริเริ่มขึ้นโดยการเปลี่ยนไฟประกอบด้วยสอง 4000 โคมไฟเรืองแสง LX; หลังจาก 25 นาทีไฟถูกปิดและการดูดกลืนแสงที่ 560 นาโนเมตรได้รับการบันทึก หนึ่งหน่วยของกิจกรรม SOD ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ก่อให้เกิดการยับยั้ง 50% ของ NBT ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นหน่วยของสดต่อกิโลกรัมของน้ำหนักสด. สำหรับการทดสอบกิจกรรม CAT สองกรัมของเนื้อเยื่อผลไม้ที่ได้รับการรักษาด้วยไนโตรเจนเหลวแหลกลาญและสกัด 10 มล 100 มิลลิโมล L-1 Tris-HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.8) ที่มี 2 มิลลิโมล L-1 EDTA นาและ 5 มิลลิโมล L-1 1,4-dithiothreitol สารสกัดเอนไซม์ที่ได้รับจากการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาที (4 ° C) กิจกรรม CAT ถูกกำหนดตามวิธีการของ Hu et al, (2014) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 3 มล 100 มิลลิโมล L-1 Tris-HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.8) 0.1 มล 0.75% H2O2 และ 0.2 มิลลิลิตรของสารสกัดจากเอนไซม์ การสลายตัว H2O2 โดยวัดจากการลดลงของการดูดกลืนแสงที่ 240 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของกิจกรรม CAT ถูกกำหนดเป็น 0.01 การเปลี่ยนแปลงของการดูดกลืนแสงที่ 240 นาโนเมตรต่อนาที กิจกรรม CAT เฉพาะได้รับการแสดงเป็นหน่วยต่อกิโลกรัมของน้ำหนักผลไม้สด. สำหรับการทดสอบกิจกรรม POD สองกรัมของเนื้อเยื่อผลไม้ที่ได้รับการรักษาด้วยไนโตรเจนเหลวแหลกลาญและสกัด 10 มล 200 มิลลิโมล L-1 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.8) ที่มี 8% polyvinylpyrrolidone สารสกัดเอนไซม์ที่ได้รับจากการหมุนเหวี่ยงที่ 8000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาที (4 ° C) กิจกรรม POD ถูกกำหนดตามวิธีการของยาง et al, (2009) มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 0.3 มล 6 มิลลิโมล L-1 guaiacol 1.7 มล 5 มิลลิโมล L-1 H2O2 และ 1 มิลลิลิตรของสารสกัดจากเอนไซม์ การเพิ่มขึ้นของการดูดกลืนแสงที่ 470 นาโนเมตรในช่วงเวลา 30 วินาทีที่ถูกบันทึกไว้ spectrophotometrically หนึ่งหน่วยของกิจกรรม POD ถูกกำหนดเป็น 0.01 การเปลี่ยนแปลงของการดูดกลืนแสงที่ 470 นาโนเมตรต่อนาที กิจกรรม POD เฉพาะได้รับการแสดงเป็นหน่วยต่อกิโลกรัมของน้ำหนักผลไม้สด. สำหรับ ณ รุนกิจกรรมการทดสอบสองกรัมของเนื้อเยื่อผลไม้ที่ได้รับการรักษาด้วยไนโตรเจนเหลวแหลกลาญและสกัด 10 มล 50 มิลลิโมลบัฟเฟอร์ L-1 โซเดียมฟอสเฟต (pH 7.0 ) สารสกัดเอนไซม์ที่ได้รับจากการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาที (4 ° C) As-POD กิจกรรมที่ถูกกำหนดตามวิธีการของยาง et al, (2009) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 1.5 มล 0.1875 มิลลิโมล L-1 EDTA-Na, 1 เมตร