Materials and methods2.1. Chemicals

Materials and methods
2.1. Chemicals and materials

Rhizomes of C. longa L. were obtained from the Ooty, Tamil Nadu, India. Sabouraud dextrose agar (SDA) and broth (SDB) were obtained from HiMedia (Mumbai, India). Zearalenone and other chemicals were purchased from Sigma–Aldrich (Bangalore, India).

2.2. Extraction essential oil from rhizomes of C. longa

Rhizomes of C. longa L. were dried under shade at room temperature for four weeks and ground into powder (500 g) and essential oil was extracted using Clevenger type apparatus followed by European Pharmacopeia (1997). Extracted oil (CLEO) was dried over sodium sulfate anhydrous to remove moisture and stored in amber glass vial at 4 °C. The percentage of the essential oil yield was calculated as the weight of the essential oil divided by the weight of the dry rhizomes.

2.3. Chemical profile of C. longa L. essential oil

2.3.1. GC-FID analysis

The chemical profile of CLEO was determined by GC-FID analysis using a PerkinElmer Clarus 600 C (Waltham, USA) equipped with flame-ionization detector (FID) and DB-5MS fused silica column (30 m × 0.25 mm; 0.25 μm film thickness) included with TurboMass software application. Working conditions were as follows: Helium was used as a carrier gas with a flow rate of 1 mL per min, and temperature of the injector at 250 °C and sensor at 280 °C were used. The column temperature was set at 40 °C for 3 min and linearly increased by 4 °C/min up to 280 °C. Mass spectra were operated in EI mode (70 eV) with scanning speed of 0.5 scans/sec in a range of m/z 40–450. CLEO was diluted in acetone (10 μL/mL) and 1 μL solution was injected in a split-mode of 1:30. Profiling of CLEO was determined by comparing their retention indices and mass spectra with respect to a homologous series of normal alkanes ( Adams, 2007) and mass spectra computer library of the NIST05.LIB/Wiley 8th Edition, respectively. Percentage composition of chemical compounds was computed from GC peak areas without devoid of FID response factor.

2.4. Antifungal activity of C. longa L. essential oil

2.4.1. Fungi and culture conditions

Antifungal activity of CLEO was carried out using F. graminearum (MTCC 1893) culture. Fungi was grown on SDA at 28 °C for one week and spores were collected using peptone water with 0.001% Tween 80. The spore number was counted using haemocytometer and adjusted to 1 × 106 spores per mL.

2.4.2. Micro-well dilution method

The Minimum inhibitory (MIC) and fungicidal concentrations (MFC) of CLEO were determined by micro-well dilution method in accordance with CLSI (2008). A volume of 10 μL spore suspension (1 × 106 spores per mL) was added to 96-well microtiter plate and mixed with various concentrations of CLEO (500–3500 μg/mL) and final volume was adjusted to 100 μL with SDB and incubated at 28 °C for 3 days. The wells without CLEO, and with nystatin and amphotericin B were as control and reference standards, respectively. MIC value was determined as the minimum concentration of CLEO at which no visible growth observed. After 3 days of incubation, 10 μL of sample from each well was inoculated into SDA plate and incubated for 3 days at 28 °C. MFC value was determined as the minimum concentration at which no detectable growth was observed.

2.4.3. Scanning electron microscopic observation

The effect of CLEO on fungi was analyzed by SEM method following the technique of Yamamoto-Ribeiro et al., (2013) with minor modifications. A mycelia was collected from a seven day old culture and transferred onto SDA slide prepared with MIC and MFC concentration of CLEO and incubated for 7 days at 28 °C. Following the incubation period, the mycelia was fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 6.5) and used for SEM analysis. The mycelial sample was fixed on dual carbon adhesive tape and dehydrated out in CO2 and sputter coated with gold, and observed under SEM (Quanta 200, FEI, USA) at 20.0 kV in environmental mode.

2.5. Effects of CLEO on fungal biomass and ZEA production

2.5.1. Liquid broth culture

The final aim of the present study was to know the inhibitory activity of CLEO on ZEA production in F. graminearum. Various concentrations of CLEO and 10 μL of spore suspension (1 × 106 spores per mL) were inoculated into 100 mL SDB in 250 mL of Erlenmeyer flask and the flask with spore suspension and without CLEO was referred as a control, and flasks were incubated under shaking condition (140–160 rpm) for 14 days at 28 °C. Following incubation, the mycelia was collected in a pre-weighed Whatman no.1 filter paper and dried at 60 °C for 24 h and fungal biomass was determined (Denver instruments, India). ZEA was extracted from liquid broth followed by Ibáñez-Vea et al., (2011) with minor modifications. The broth was blended with equal volume of acetonitrile (1:1, v/v) at 145 rpm and 15 mL was passed through ZEA specific immunoaffinity column (Vicam, Milford, USA), pre-conditioned with 10 mL of phosphate-buffered saline pH 7

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีภัณฑ์และวัสดุเหง้าของลองกา C. L. ได้รับจากการอูตี้ ทมิฬนาฑู อินเดีย อาหารเป็น Sabouraud (SDA) และน้ำซุป (SDB) ได้รับจาก HiMedia (มุมไบ อินเดีย) ซีราลีโนนและสารเคมีสั่งซื้อจาก Sigma-Aldrich (บังกาลอร์ อินเดีย)2.2. การสกัดน้ำมันจากเหง้าของลองกา C.เหง้าของลองกา C. L. ได้แห้งใต้ร่มอุณหภูมิห้องสี่สัปดาห์และพื้นดินเป็นผง (500 กรัม) และน้ำมันหอมระเหยถูกแยกโดยใช้เครื่องมือชนิด Clevenger ตามตำรายายุโรป (1997) สกัดน้ำมัน (คลีโอ) แห้งมากกว่าโซเดียมซัลเฟตไดเพื่อเอาความชื้น และเก็บไว้ในขวดแก้วสีชาที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส มีคำนวณเปอร์เซ็นต์ของผลผลิตน้ำมันเป็นน้ำหนักของน้ำมันหาร ด้วยน้ำหนักของเหง้าแห้ง2.3. เคมีโปรไฟล์ของลองกา C. L. น้ำมัน2.3.1. GC-FID วิเคราะห์มีกำหนดค่าทางเคมีของคลีโอ โดยวิเคราะห์ GC-FID ใช้ PerkinElmer Clarus 600 C (นีซ สหรัฐอเมริกา) มีเครื่องตรวจจับเปลวไฟไอออไนซ์ (FID) และ DB 5MS ซิครอบฟันด้วยคอลัมน์ (30 m × 0.25 mm ความหนา 0.25 ไมครอนฟิล์ม) มาพร้อมกับโปรแกรม TurboMass สภาพการทำงานมีดังนี้: ใช้ฮีเลียมเป็นก๊าซผู้ขนส่งมีอัตราการไหล 1 มิลลิลิตรต่อนาที และใช้อุณหภูมิของหัวฉีดที่ 250 ° C และเซ็นเซอร์ที่ 280 ° C ชุดที่ 40 ° C 3 นาทีอุณหภูมิของคอลัมน์ และเชิงเส้นเพิ่มขึ้น 4 องศาเซลเซียส/นาทีถึง 280 องศาเซลเซียส สเป็คโดยรวมที่ดำเนินการในโหมด EI (70 eV) ด้วยการสแกนความเร็ว 0.5 สแกน/วินาทีในช่วงของ 40-450 m/z คลีโอถูกเจือจางในอะซีโตน (10 μL มิลลิลิตร) และโซลูชั่น μL 1 ถูกส่งในโหมดแยก 1:30 รวบรวมสถานะของคลีโอกำหนด โดยการเปรียบเทียบการเก็บข้อมูลดัชนีและสเป็คโดยรวมเกี่ยวกับชุดเซทจะมีโครโมโซมปกติ alkanes (Adams, 2007) และไลบรารีคอมพิวเตอร์สเป็คโดยรวม NIST05 LIB/แนะ นำรุ่น 8 ตามลำดับ เปอร์เซ็นต์องค์ประกอบของสารประกอบทางเคมีถูกคำนวณจากพื้นที่สูงสุดที่ GC ไม่มีไร้ปัจจัยตอบสนอง FID2.4 กิจกรรมเชื้อราของน้ำมันลองกา C. L.2.4.1. เชื้อราและสภาพวัฒนธรรมดำเนินการกิจกรรมต้านเชื้อราของคลีโอออกใช้ F. graminearum (MTCC 1893) วัฒนธรรม เชื้อราถูกปลูกใน SDA ที่ 28 ° C สำหรับหนึ่งสัปดาห์ และราถูกเก็บรวบรวมด้วยน้ำ peptone 0.001% 80 แต่ จำนวนสปอร์ถูกนับใช้ haemocytometer และปรับเป็น 1 × 106 ราต่อมิลลิลิตร2.4.2. วิธีการเจือจางไมโครดีInhibitory ต่ำสุด (MIC) และคลีโอเชื้อราความเข้มข้น (MFC) ถูกกำหนด โดยวิธีไมโครดีเจือจางตาม CLSI (2008) เพิ่มแผ่น microtiter 96 หลุมระดับ 10 μL สปอร์ระงับ (1 × 106 ราต่อมิลลิลิตร) และผสมกับความเข้มข้นต่าง ๆ ของคลีโอ (500-3500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และสุดท้ายเสียงปรับ μL 100 กับ SDB และได้รับการกกที่ 28 ° C 3 วัน เวลล์คลีโอ และไม่ มี nystatin และ amphotericin B ที่เป็นมาตรฐาน การควบคุมและการอ้างอิงตามลำดับ ค่า MIC ที่ถูกกำหนดเป็นความเข้มข้นต่ำสุดของคลีโอที่ซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้โตสังเกต หลังจาก 3 วันบ่ม μL 10 ตัวอย่างจากแต่ละดี inoculated เป็น SDA แผ่น และได้รับการกก 3 วันที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส MFC ค่าถูกกำหนดเป็นความเข้มข้นต่ำสุดที่สังเกตการเจริญเติบโตหรือไม่ซึ่ง2.4.3. สแกนกล้องจุลทรรศน์ผลของคลีโอราถูกวิเคราะห์ โดยวิธี SEM ตามเทคนิคของยามาโมโตะ Ribeiro et al., (2013) ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย Mycelia ถูกรวบรวมจากวัฒนธรรมเก่าเจ็ดวัน และโอนย้ายไปยังภาพนิ่ง SDA พร้อมไมโครโฟนและ MFC ความเข้มข้นของคลีโอ และได้รับการกก 7 วันที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส ต่อระยะเวลากกไข่ mycelia ถูกแก้ไขกับ 2.5% glutaraldehyde ใน 0.1 M โซเดียม cacodylate บัฟเฟอร์ (pH 6.5) และใช้สำหรับวิเคราะห์ SEM อย่าง mycelial ถาวรบนเทปกาวคาร์บอนคู่ และอบแห้งออกใน CO2 และ sputter เคลือบทอง และสังเกตใต้ SEM (Quanta 200 เฟย สหรัฐอเมริกา) ที่ 20.0 kV ในโหมดสิ่งแวดล้อม2.5. Effects of CLEO on fungal biomass and ZEA production2.5.1. Liquid broth cultureThe final aim of the present study was to know the inhibitory activity of CLEO on ZEA production in F. graminearum. Various concentrations of CLEO and 10 μL of spore suspension (1 × 106 spores per mL) were inoculated into 100 mL SDB in 250 mL of Erlenmeyer flask and the flask with spore suspension and without CLEO was referred as a control, and flasks were incubated under shaking condition (140–160 rpm) for 14 days at 28 °C. Following incubation, the mycelia was collected in a pre-weighed Whatman no.1 filter paper and dried at 60 °C for 24 h and fungal biomass was determined (Denver instruments, India). ZEA was extracted from liquid broth followed by Ibáñez-Vea et al., (2011) with minor modifications. The broth was blended with equal volume of acetonitrile (1:1, v/v) at 145 rpm and 15 mL was passed through ZEA specific immunoaffinity column (Vicam, Milford, USA), pre-conditioned with 10 mL of phosphate-buffered saline pH 7

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ2.1 . สารเคมีและวัสดุเหง้าของขมิ้นชัน . . . ได้มาจาก Ooty , ทมิฬนาฑู , อินเดีย sabouraud dextrose agar ( SDA ) และน้ำซุป ( เอสดีบี ) ที่ได้รับจาก himedia ( มุมไบอินเดีย ) ซีราลีโนนและสารเคมีอื่น ๆซื้อมาจาก Sigma –ดิช ( บังกาลอร์ , อินเดีย )2.2 . การสกัดน้ำมันหอมระเหยจากเหง้าของขมิ้นชัน .เหง้าของขมิ้นชัน L C แห้งในร่ม อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 สัปดาห์และบดให้เป็นผง ( 500 กรัม ) และน้ำมันหอมระเหยสกัดโดยใช้เครื่องมือตามมาตรฐานยุโรปเคลวินเจอร์กรุ๊ป ( 1997 ) น้ำมันที่สกัดได้ ( คลีโอ ) ก็แห้งกว่าโซเดียมซัลเฟตที่จะลบความชื้น และเก็บไว้ในขวดแก้วสีเหลืองอำพันที่อุณหภูมิ 4 องศา ค่าร้อยละของผลผลิตน้ำมันถูกคำนวณเป็นน้ำหนักของน้ำมัน หารด้วยน้ำหนักของเหง้าแห้ง2.3 ประวัติทางเคมีของน้ำมันขมิ้นชัน L . ที่จำเป็น .2.3.1 . การวิเคราะห์ gc-fidชื่อโปรไฟล์ของคลีโอ ถูกกำหนดจากการวิเคราะห์ gc-fid ใช้ Perkinelmer clarus 600 C ( วอลแทม , สหรัฐอเมริกา ) อุปกรณ์ตรวจจับเปลวไฟไอออไนเซชัน ( FID ) และ db-5ms ผสมคอลัมน์ซิลิกา ( 30 m × 0.25 มม. ความหนาฟิล์ม 3 M ; μ ) รวมกับโปรแกรมซอฟต์แวร์ turbomass . สภาพการทำงาน ได้แก่ ฮีเลียมถูกใช้เป็นแก๊สที่ขนส่งด้วยอัตราการไหล 1 มิลลิลิตรต่อนาทีและอุณหภูมิของหัวฉีดที่ 250 องศา C และเซ็นเซอร์ที่ 280 องศา C มาใช้ คอลัมน์ อุณหภูมิตั้งไว้ที่ 40 องศา C เป็นเวลา 3 นาที และเพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงโดย 4 ° C / นาทีถึง 280 องศา มวลแสงดำเนินการในโหมด EI ( 70 eV ) ด้วยการสแกนความเร็ว 0.5 สแกน / วินาทีในช่วงของ M / Z 40 – 450 คลีโอเจือจาง ) ( 10 μ L / มิลลิลิตร ) และ โซลูชั่น ชั้น 1 μถูกฉีดในโหมดแยกของ 1 : 30 . โปรไฟล์ของคลีโอถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบความคงทนของดัชนีมวลสเปกตรัม และด้วยความเคารพต่ออนุกรมฟังก์ชันปกติของอัลเคน ( อดัมส์ , 2007 ) และมวลสเปกตรัมคอมพิวเตอร์ห้องสมุดของ nist05.lib/wiley 8 ฉบับ ตามลำดับ องค์ประกอบร้อยละของสารประกอบทางเคมีที่ได้จากการคำนวณ GC ยอดพื้นที่โดยไร้ปัจจัยการตอบสนองฟิต .2.4 . ฤทธิ์ต้านราของน้ำมันขมิ้นชัน L . ที่จำเป็น .เครื่องมือกำจัดเพื่อย้าย . เชื้อราและสภาพวัฒนธรรมฤทธิ์ต้านราของคลีโอ มีการใช้เอฟ graminearum ( mtcc 1893 ) วัฒนธรรม ราโตบนในปีที่ 28 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 สัปดาห์ และสามารถเก็บรวบรวมข้อมูลโดยใช้เปปโตนน้ำกับทวี 0.001 % 80 การสร้างสปอร์จำนวนนับและการปรับใช้ haemocytometer 1 × 106 สปอร์ต่อมิลลิลิตร2.4.2 . ไมโครดีวิธีเจือจางต่ำสุดที่ยับยั้ง ( MIC ) และความเข้มข้น fungicidal ( MFC ) คลีโอเป็นไมโครดีเจือจางโดยวิธีการตามต่างๆ ( 2008 ) ปริมาณ 10 μ l สปอร์แขวนลอย ( 1 × 106 สปอร์ต่อมิลลิลิตร ) คือเพิ่ม 96 ดีไมโครจานและผสมความเข้มข้นต่าง ๆ ของคลีโอ ( 500 - 3500 μกรัม / มิลลิลิตร ) และหมวดสุดท้ายคือ ปรับ 100 μ L กับซอดันบิบ่มที่ 28 ° C เป็นเวลา 3 วัน บ่อไม่มีคลีโอ และด้วยนัยสะแตติน amphotericin B และมีการควบคุมและมาตรฐานอ้างอิงตามลำดับ ไมค์ถูกกำหนดเป็นค่าความเข้มข้นต่ำสุดของคลีโอที่มองเห็นได้ไม่มีการเจริญเติบโต ) หลังจาก 3 วัน ระยะเวลา 10 μ l ตัวอย่างจากแต่ละคนก็เป็นเชื้อบ่ม SDA จาน 3 วันที่ 28 องศา ซึ่งถูกกำหนดเป็นค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่ตรวจพบไม่มีการเติบโตมากนัก2.4.3 . กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน การสังเกตผลของ Cleo เชื้อราโดยใช้วิธี SEM ตามเทคนิคของยามาโมโตะ Ribeiro et al . , ( 2013 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เป็นเส้นใยถูกรวบรวมจากเจ็ดวันแก่วัฒนธรรม และโอนไปยัง sda สไลด์เตรียมเปิดไมค์และความเข้มข้นของ Cleo และบ่มเป็นเวลา 7 วัน ที่ 28 องศา ตามระยะเวลาที่เหมาะสมต่อการเป็นแก้ไขด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% ใน 0.1 โมลาร์โซเดียมจากนั้นนำบัฟเฟอร์ pH 6.5 ) และใช้สำหรับวิเคราะห์ SEM ตัวอย่างการเจริญคงที่บนเทปกาวคาร์บอนคู่และแห้งออกใน CO2 และละล่ำละลักเคลือบด้วยทองคำ และสังเกตได้ที่ SEM ( Quanta 200 , เฟย , USA ) 20.0 KV ในโหมดสิ่งแวดล้อม2.5 ผลของเชื้อราและการผลิตมวลชีวภาพ Cleo ในซีดาวน์โหลด . น้ำซุปวัฒนธรรมจุดมุ่งหมายสุดท้ายของการศึกษาครั้งนี้เพื่อทราบกิจกรรมการยับยั้งของ Cleo ในซีผลิตในต่างประเทศ graminearum . ความเข้มข้นต่าง ๆ ของคลีโอ และ 10 μลิตรช่วงล่างสปอร์ ( 1 × 106 สปอร์ต่อมิลลิลิตรเชื้อ 100 ml ในขวด 250 มิลลิลิตร ซอดันบิเออร์เลนเมเยอร์และขวดเหล้ากับการระงับสปอร์และไม่มีคลีโอถูกเรียกว่าการควบคุมและ flasks ถูกบ่มภายใต้เครื่องเขย่า ( 140 และ 160 รอบต่อนาที ) สำหรับ 14 วัน ที่ 28 องศา ตามระยะเวลาที่เหมาะสมต่อการรวบรวมในก่อนชั่งน้ำหนัก whatman กรอง 1 กระดาษและอบแห้งที่อุณหภูมิ 60 องศา C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและมวลชีวภาพเชื้อราตั้งใจ ( เดนเวอร์เครื่องมือ , อินเดีย ) ซี สกัดจากน้ำซุปตามด้วย IB áñ EZ แว่ et al . ( 2554 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย น้ำซุปผสมที่มีปริมาณเท่ากันของไน ( 1 : 1 v / v ) 145 รอบต่อนาที 15 ml ผ่านผ่านซีเฉพาะ immunoaffinity คอลัมน์ ( vicam Milford , USA ) , pre ปรับอากาศที่มี 10 มิลลิลิตร ฟอสเฟต