Blood samples from 620 white muscov

Blood samples from 620 white muscovy ducks from
Putian Guangdong Wenshi Poultry Co. were collected and
stored at  20 ° C. Genomic DNA was extracted according
to the phenol – chloroform method ( SAMBROOK and RUSSEL
2002). DNA concentration and quality were determined
spectrophotometrically at 260 and 280 nm. Only genomic
DNA preparations with A 260 /A 280 ratios of 1.6 – 1.8 were
used.
Twenty nesting birds and 20 laying birds (40 weeks of
age) were selected from the second generation of white
muscovy ducks. Twelve different tissues were sampled
from each duck, including pituitary, hypothalamus, muscular
stomach, glandular stomach, ovary, kidney, liver,
heart, lung, duodenum, pancreas and spleen. All the tissues
harvested were stored in liquid nitrogen immediately
until total RNA extraction.
RNA extraction and cDNA synthesis
Briefl y, tissues were homogenized and a TRIZOL Reagent
kit (TaKaRa Biotechnology Co.) was used to extract
RNAs, according to the manufacturer ’ s protocol. cDNA
samples of tissues were generated from 2 μ g of total RNA
using a PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology
Co.), according to the manufacturer ’ s protocol.
SNP screening and genotyping
The GH gene comprises fi ve exons and four introns (our
laboratory previously cloned the full length cDNA of GH
gene). In this study, several pairs of primers were designed
according to DNA sequence of microsatellites in the 5 ′ -
fl anking region, 5 ′ regulatory region and exons 1 – 5 of the
GH gene. Apart from one SNP in intron 3, no other SNP
was found. Therefore, intron 3 of the GH gene was selected
for genotyping by the PCR single-strand-conformation
polymorphism (SSCP) method. Briefl y, a genomic fragment
of 348 bp representing intron 3 and containing polymorphic
sites of the GH gene was amplifi ed using a pair
of primers ( GH-F/GH-R ) (primers shown in Table 1). The
PCR reaction comprised a 20 μ l reaction volume consisting
of 100 ng muscovy duck genomic DNA, 1  buffer,
200 μ M of each dNTP, 0.5 μ M each primer, and 1 U of
Taq DNA polymerase. The thermal cycling program was
94 ° C for 5 min; 35 cycles of 94 ° C for 30 s, 58 ° C for 30 s,
and 72 ° C for 30 s, and 72 ° C for 10 min. The PCR product
was detected by electrophoresis through a 1.5% agarose
gel stained with ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างเลือดจาก 620 เป็ดมัสโกวีสีขาวจาก
Putian กวางตุ้ง Wenshi สัตว์ปีก จำกัด ถูกเก็บรวบรวมและ
เก็บไว้ที่? 20 องศาเซลเซียส DNA ของยีนถูกสกัดตาม
ไปฟีนอล - วิธีคลอโรฟอร์ม (SAMBROOK และ RUSSEL
2002) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่มีคุณภาพและได้รับการพิจารณา
spectrophotometrically ที่ 260 และ 280 นาโนเมตร เพียงจีโนม
การเตรียมดีเอ็นเอกับ 260/280 อัตราส่วน 1.6-1.8 ถูก
. ใช้
นกทำรังยี่สิบและ 20 นกวาง (40 สัปดาห์ของ
อายุ) ได้รับเลือกจากรุ่นที่สองของสีขาว
เป็ดเป็ดเทศ สิบสองเนื้อเยื่อที่แตกต่างกันตัวอย่าง
จากแต่ละเป็ดรวมทั้งต่อมใต้สมอง hypothalamus กล้ามเนื้อ
กระเพาะอาหารกระเพาะอาหารต่อมรังไข่, ไต, ตับ
หัวใจปอดลำไส้เล็กส่วนต้นตับอ่อนและม้าม เนื้อเยื่อทั้งหมด
เก็บเกี่ยวถูกเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวทันที
จนกว่าสกัด RNA ทั้งหมด.
สกัด RNA และสังเคราะห์ cDNA
Briefl Y เนื้อเยื่อถูกปั่นและ Trizol Reagent
Kit (Takara เทคโนโลยีชีวภาพ Co. ) ถูกนำมาใช้ในการสกัด
RNAs ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต . cDNA
ตัวอย่างของเนื้อเยื่อถูกสร้างขึ้นจาก 2 μกรัมของ RNA รวม
โดยใช้น้ำยาชุด PrimeScript RT (Takara เทคโนโลยีชีวภาพ
จำกัด ) ตามที่ผู้ผลิตโพรโทคอ.
การตรวจคัดกรองและ SNP genotyping
ยีน GH ประกอบด้วย Fi ได้ exons และสี่ introns (ของเรา
ห้องปฏิบัติการก่อนหน้านี้โคลนยีนยาวเต็มรูปแบบของ GH
ยีน) ในการศึกษานี้หลายคู่ของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบ
ตามลำดับดีเอ็นเอของไมโครใน 5 '-
ฟลอริด้า anking ภูมิภาค 5' ภูมิภาคกฎระเบียบและ exons 1-5 ของ
ยีน GH นอกเหนือจากการเป็นหนึ่งใน SNP intron 3 ไม่มี SNP อื่น ๆ
ก็พบว่า ดังนั้น intron 3 ของยีน GH ได้รับเลือก
สำหรับ genotyping โดยวิธี PCR เดียวเส้นใยโครงสร้าง
polymorphism (SSCP) วิธีการ Briefl Y, ส่วนจีโนม
ของ 348 bp ตัวแทน intron ที่ 3 และมี polymorphic
เว็บไซต์ของยีน GH เอ็ด amplifi ใช้คู่
ไพรเมอร์ (GH-F / GH-R) (ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 1)
ปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วยปริมาณปฏิกิริยา 20 μ L ประกอบด้วย
100 NG เป็ดเทศเป็ดดีเอ็นเอ 1? บัฟเฟอร์
200 μ M ของแต่ละ dNTP, 0.5 M μแต่ละไพรเมอร์และ 1 U ของ
Taq DNA Polymerase โปรแกรมการขี่จักรยานเป็นความร้อน
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 35 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 58 ° C เป็นเวลา 30 วินาที
และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกตรวจพบโดย electrophoresis ผ่าน agarose 1.5%
เจลย้อมด้วย ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างเลือดจาก 620 สีขาวเป็ดเทศเป็ดจากPutian Guangdong wenshi สัตว์ปีก จำกัด จำนวนและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 ° C จีโนมดีเอ็นเอตามกับฟีนอลและคลอโรฟอร์มและวิธีการ ( sambrook รั ซล2002 ) ความเข้มข้นและคุณภาพวิเคราะห์ดีเอ็นเอนี้ที่ 260 และ 280 nm . แต่จีโนมการเตรียมดีเอ็นเอกับ 260 / 280 อัตราส่วน 1.6 - 1.8 คือใช้ยี่สิบ 20 วางซ้อนนกนก ( 40 สัปดาห์อายุ ) ได้รับเลือกจากรุ่นที่ 2 ของขาวเป็ดเทศเป็ด เนื้อเยื่อต่างๆ จำนวน 12 คนจากเป็ดแต่ละรวมถึงต่อมใต้สมอง hypothalamus , กล้ามเนื้อท้อง ต่อมในกระเพาะอาหาร ไต ตับ รังไข่หัวใจ , ปอด , ลำไส้ , ตับและม้าม เนื้อเยื่อทั้งหมดการเก็บเกี่ยวที่ถูกเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวทันทีจนกระทั่งการสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมดการสกัดอาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอสังเคราะห์ย่อ Y , เนื้อเยื่อเป็นโฮโม และ trizol รีเอเจนต์ชุด ( Takara เทคโนโลยีชีวภาพ Co . ) ถูกใช้เพื่อแยกRNAs ตามผู้ผลิต ' s โปรโตคอล ยีนตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกสร้างขึ้นจาก 2 μกรัมของ RNA ทั้งหมดใช้ primescript RT 3 ชุด ( ทาการะ เทคโนโลยีชีวภาพบริษัท ) ตามผู้ผลิต ' s โปรโตคอลการคัดกรองและส่งเสริม SNPการสร้างยีนประกอบด้วย Fi ได้โค และสี่ introns ( ของเราปฏิบัติการก่อนหน้านี้โคลน cDNA ของ GH เต็มความยาวยีน ) ในการศึกษานี้ หลายคู่ของไพรเมอร์ที่ออกแบบมาตามลําดับของไมโครแซทเทลไลท์ดีเอ็นเอในนั้น - 5FL anking ภูมิภาค 5 ภูมิภาคนั้นและกฎระเบียบที่มี 1 – 5 ของยีน GH . แยกจาก SNP ใน iNtRON SNP 3 ไม่มีอื่น ๆถูกพบ ดังนั้น iNtRON 3 ของ GH ยีนถูกเลือกสำหรับการอ่านโดยวิธี PCR เส้นเดียวโครงสร้างpolymorphism ( ยีน ) วิธี ย่อ Y ส่วนจีโนมของ 348 BP แทน iNtRON 3 ที่มีจำนวนเว็บไซต์ของ GH ของ amplifi เอ็ดใช้คู่ไพรเมอร์ ( gh-f / gh-r ( ไพรเมอร์ ) แสดงดังตารางที่ 1 ) ที่ปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 20 μ L ปฏิกิริยาปริมาณ ประกอบด้วยของ 100 ของเป็ดเทศ genomic DNA 1 บัฟเฟอร์200 μ M ของแต่ละ dntp 0.5 μ M แต่ละสี และ 1 u ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสได้ดี . โปรแกรมการขี่จักรยานการระบายความร้อนคือ94 ° C เป็นเวลา 5 นาที ; 35 รอบ 94 ° C เป็นเวลา 30 วินาที , 58 องศา C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที กับ 72 ° C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCRที่ตรวจพบโดยวิธีผ่าน 1.5 % ,เจลเปื้อนทิเดียมโบรไมด์