In vitro HCV infectionDe novo infec

In vitro HCV infection
De novo infection of lymphoid cells with HCV was carried out following the method reported before, including monocyte depletion to enhance viral replication in lymphocytes [7]. Briefly, monocyte depletion was carried out by plastic adherence for 4 h. This led to a three-fold decrease in CD14+ monocytes, as measured by flow cytometry (Additional file 1: Figure S1). Previously, we have shown that intermittent stimulation of PBMC exposed to HCV ex vivo with phytohemagglutinin (PHA) in the presence of human recombinant interleukin-2 (IL-2) leads to HCV propagation [7]. However, these conditions also augmented lymphocyte proliferation and led to a relatively high rate of lymphocyte apoptosis (data not shown). These outcomes were likely related to the repeated stimulation with PHA. To minimize this effect, which potentially masked the influence of HCV on cell proliferation and apoptosis, we stimulated lymphoid cells with PHA only once prior to infection in the current study. Thus, monocyte-depleted lymphoid cells from a healthy donor were treated with 5 μg/mL PHA (Sigma-Aldrich, Mississauga, Ontario, Canada) for 48 h [7]. Following stimulation, 1 × 10 7 cells were exposed to 2.7 × 10 5 vge from CHC-1 or CHC-3 or to 500 μL (1 × 10 4 vge) of plasma from CHC-2 in 9.5 mL of culture medium. In addition, the same number of target cells was exposed to three 500-μL samples of normal healthy plasma (NHP) from 3 different healthy donors (mock infections). As another control, target cells were cultured with 9.5 mL of medium alone (NP, no plasma). In all cases, inocula or NHP were removed after 24 h and the cells washed thoroughly prior to suspension in 9.5 mL of medium, as described [7]. Cells were cryopreserved for analysis prior to and after PHA stimulation (time 0) and at 1, 4, 7 and 10 d.p.i., unless otherwise indicated. In addition, cells were collected at each of the above time points to determine cell phenotype and apoptosis (see below).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การติดเชื้อไวรัสตับอักเสบซีในหลอดทดลอง
De โนโวติดเชื้อของเซลล์ต่อมน้ำเหลืองที่มีไวรัสตับอักเสบซีได้ดำเนินการดังต่อไปนี้วิธีการรายงานมาก่อนรวมทั้งการสูญเสีย monocyte เพื่อเพิ่มการจำลองแบบของไวรัสในเซลล์เม็ดเลือดขาว [7] สั้น ๆ , การสูญเสีย monocyte ได้ดำเนินการโดยยึดมั่นพลาสติกสำหรับ 4 ชั่วโมง นี้นำไปสู่การลดลงสามเท่าใน CD14 + monocytes เป็นวัดโดยโฟ (แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นต่อเนื่องของ PBMC สัมผัสกับไวรัสตับอักเสบซี ex vivo กับ phytohemagglutinin (PHA) ในการปรากฏตัวของมนุษย์ recombinant interleukin-2 (IL-2) นำไปสู่การขยายพันธุ์ไวรัสตับอักเสบซี [7] อย่างไรก็ตามเงื่อนไขเหล่านี้ยังเพิ่มการขยายเม็ดเลือดขาวและนำไปสู่อัตราที่ค่อนข้างสูงของการตายของเซลล์เม็ดเลือดขาว (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ผลลัพธ์เหล่านี้มีแนวโน้มที่มีความสัมพันธ์กับการกระตุ้นซ้ำกับ PHA เพื่อลดผลกระทบนี้ซึ่งสวมหน้ากากอาจอิทธิพลของไวรัสตับอักเสบซีในการเพิ่มจำนวนเซลล์และการตายของเซลล์เรากระตุ้นเซลล์ต่อมน้ำเหลืองกับ PHA เพียงครั้งเดียวก่อนที่จะมีการติดเชื้อในการศึกษาในปัจจุบัน ดังนั้น monocyte หมดเซลล์ต่อมน้ำเหลืองจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีได้รับการรักษาด้วย 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร PHA (Sigma-Aldrich, Mississauga, Ontario, แคนาดา) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง [7] ต่อไปนี้การกระตุ้น 1 × 10 7 เซลล์ได้สัมผัสกับ 2.7 × 10 5 VGE จาก CHC-1 หรือ CHC-3 หรือ 500 ไมโครลิตร (1 × 10 4 VGE) ของพลาสม่าจาก CHC-2 ใน 9.5 มิลลิลิตรของกลางวัฒนธรรม นอกจากนี้จำนวนเดียวกันของเซลล์เป้าหมายได้สัมผัสถึงสามตัวอย่าง 500 ไมโครลิตรของพลาสม่าที่มีสุขภาพปกติ (NHP) จาก 3 ผู้บริจาคที่มีสุขภาพที่แตกต่างกัน (การติดเชื้อจำลอง) ในฐานะที่เป็นตัวควบคุมอื่นเซลล์เป้าหมายได้รับการเลี้ยงด้วย 9.5 มิลลิลิตรของกลางเพียงอย่างเดียว (NP, พลาสม่าไม่ได้) ในทุกกรณี inocula NHP หรือถูกลบออกหลังจาก 24 ชั่วโมงและเซลล์ล้างให้สะอาดก่อนที่จะมีการระงับใน 9.5 มิลลิลิตรของกลางตามที่อธิบายไว้ [7] เซลล์ที่ถูกแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ก่อนและหลังการกระตุ้น PHA (เวลา 0) และวันที่ 1, 4, 7 และ 10 dpi นอกจากที่ระบุ นอกจากนี้เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมในแต่ละจุดเวลาดังกล่าวข้างต้นเพื่อตรวจสอบฟีโนไทป์ของเซลล์และการตายของเซลล์ (ดูด้านล่าง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในหลอดทดลองการติดเชื้อไวรัสตับอักเสบซี
อีกครั้งการติดเชื้อของน้ำเหลืองเซลล์ที่มีรายการต่อไปนี้ส่งรายงานมาก่อน รวมถึงตับพร่องเพิ่มการจำลองแบบของไวรัสในเม็ดเลือดขาว [ 7 ] สั้น ๆ , monocyte การกระทำโดยเคลือบพลาสติกสำหรับ 4 ชั่วโมง นี้นำไปสู่สามพับลด cd14 โมโนไซทเป็นวัดโดยเครื่องนับเซลล์ ( เพิ่มเติมไฟล์ 1 รูป S1 )ก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นต่อเนื่องของขาว สัมผัสกับเชื้อไวรัส ex vivo ด้วยเกิด ( PHA ) ในการแสดงตนของการเรียนแบบร่วมมือแบบมนุษย์ ( 2 ) นำไปสู่การแพร่กระจายเชื้อไวรัส [ 7 ] อย่างไรก็ตาม เงื่อนไขเหล่านี้ยังเติม lymphocyte proliferation และนำไปสู่อัตราค่อนข้างสูงของลิมโฟไซต์เกิด ( ข้อมูลไม่แสดง )ผลลัพธ์เหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นด้วย PHA ซ้ำ . เพื่อลดผลกระทบ ที่อาจมีอิทธิพลของเชื้อไวรัสในเซลล์ และการเกิด apoptosis เรากระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดกับผาเพียงครั้งเดียวก่อนที่จะติดเชื้อในการศึกษาปัจจุบัน ดังนั้น ตับพร่องเม็ดเลือดเซลล์จากผู้บริจาคมีสุขภาพดี รักษาด้วย 5 μ g / ml ผา ( ซิกม่า Aldrich Mississauga Ontario ,แคนาดา ) 48 h [ 7 ] ต่อไปนี้การกระตุ้น 1  ×  10 7 เซลล์ได้รับ 2.7  ×  10 5 vge จาก chc-1 หรือ chc-3 หรือ 500 μ L ( 1  ×  10 4 vge ) ของพลาสมาจาก chc-2 9.5 ml ในอาหารเลี้ยงเชื้อ . นอกจากนี้ หมายเลขเดียวกันของเซลล์เป้าหมายถูก 3 500 - μ l ตัวอย่างพลาสมาปกติ ( nhp ) จาก 3 ที่แตกต่างกันสุขภาพผู้บริจาค ( เชื้อเยาะเย้ย ) ควบคุมอื่นเพาะเลี้ยงเซลล์เป้าหมาย 9.5 มล. ขนาดกลางคนเดียว ( NP ไม่มีพลาสมา ) ในทุกกรณี , inocula หรือ nhp ถูกลบออกหลังจาก 24 ชั่วโมงและเซลล์ล้างให้สะอาดก่อนที่จะระงับใน 9.5 มล. ขนาดกลางตามที่อธิบายไว้ [ 7 ] เซลล์มีการตรวจสอบคุณภาพวิเคราะห์ก่อนและหลังการกระตุ้นผา ( 0 ) และ 1 , 4 , 7 และ 10 d.p.i. เว้นแต่ที่ระบุไว้ นอกจากนี้เซลล์ในที่แต่ละเวลาจุดดังกล่าวเพื่อตรวจสอบการเกิด apoptosis ในเซลล์ ( ดูด้านล่าง )