The SrtA isoform of the Staphylococ

The SrtA isoform of the Staphylococcus aureus sortase transpeptidase is responsible for the covalent attachment of virulence- and
colonization-associated proteins to the bacterial peptidoglycan. Sortase utilizes two substrates, undecaprenol-pyrophosphoryl-
MurNAc(GlcNAc)-Ala-D-isoGlu-Lys(e-Gly5)-D-Ala-D-Ala (branched Lipid II) and secreted proteins containing a highly conserved
LPXTG sequence near their C termini. SrtA simultaneously cleaves the Thr-Gly bond of the LPXTG-containing protein and forms
a new amide bond with the nucleophilic amino group of the Gly5 portion of branched Lipid II, anchoring the protein to this key
intermediate that is subsequently polymerized into peptidoglycan. Here we show that reported fluorescence quenching activity
assays for SrtA are subject to marked fluorescence inner filter effect quenching, resulting in prematurely hyperbolic velocity versus
substrate profiles and underestimates of the true kinetic parameters kcat and Km. We therefore devised a discontinuous high-performance
liquid chromatography (HPLC)-based assay to monitor the SrtA reaction employing the same substrates used in the
fluorescence quenching assay: Gly5 and Abz-LPETG-Dap(Dnp)-NH2. Fluorescence or UV detection using these substrates facilitates
separate analysis of both the acylation and the transpeptidation steps of the reaction. Because HPLC was performed using
fast-flow analytical columns (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Isoform SrtA ของ Staphylococcus หมอเทศข้างลาย sortase ลทรานสเฟอเรสรับผิดชอบแนบ covalent virulence- และ
สัมพันธ์สนามวิลเลียมเปบทิโดไกลแคนแบคทีเรีย Sortase ใช้ได้ 2, undecaprenol - pyrophosphoryl-
MurNAc (GlcNAc) -อลา - D-isoGlu-Lys (e-Gly5) - D -อลา - D -อลา (แบบแยกสาขาไขมัน II) และวิลเลียม secreted ประกอบด้วยนำสูง
ลำดับ LPXTG ใกล้เทอร์มินิของ C SrtA พร้อมแยกออกพันธบัตร Thr Gly ของโปรตีนที่ประกอบด้วย LPXTG และฟอร์ม
amide พันธบัตรใหม่ที่ มีกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วน Gly5 ของ II ไขมันแบบแยกสาขา anchoring โปรตีนนี้คีย์
ปานกลางที่ต่อ polymerized เป็นเปบทิโดไกลแคน ที่นี่เราแสดงที่รายงานกิจกรรมการชุบ fluorescence
assays สำหรับ SrtA อาจมี fluorescence เครื่องกรองภายในผลการชุบ ในไฮเพอร์โบลิก่อนกำหนดความเร็วเทียบกับ
พื้นผิวโพรไฟล์และ underestimates ของ kcat พารามิเตอร์จริงเดิม ๆ และกม.เราจึงคิดค้นที่ไม่ต่อเนื่องประสิทธิภาพสูง
เหลว chromatography (HPLC) -ใช้ทดสอบปฏิกิริยา SrtA ที่ใช้วัสดุเดียวกับที่ใช้ในการตรวจสอบการ
fluorescence ชุบทดสอบ: Gly5 และ Abz-LPETG-หลักสูตร Dap (Dnp) -NH2 Fluorescence หรือ UV ตรวจโดยใช้พื้นผิวเหล่านี้อำนวยความสะดวก
แยกวิเคราะห์ทั้งอย่างไร acylation และ transpeptidation ขั้นตอนของปฏิกิริยา เนื่องจากทำ HPLC ใช้
คอลัมน์วิเคราะห์กระแสอย่างรวดเร็ว (< รัน 8 นาที), ใช้อัตราความเร็วสูงนี้วิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์ของ SrtA พื้นผิว specificity,
กลไกเดิม ๆ และยับยั้งก็เป็นไปได้ เปิดเผยวิเคราะห์เดิม ๆ ที่ใช้วิเคราะห์ HPLC ที่พารามิเตอร์เดิม ๆ สำหรับ
SrtA กับ Abz-LPETG-หลักสูตร Dap (Dnp) -NH2 จะมม. 5.5 กิโลเมตรและ 0.27 s 1 สำหรับ kcat กำหนดให้ 140 Km สำหรับ Gly5 lM.
ค่าเหล่านี้แทนการเพิ่ม 300-fold Km สำหรับพื้นผิว LPXTG และเพิ่ม 12,000-fold ใน kcat มากกว่าเอกสารประกอบการรายงาน
ค่า แนะนำว่า SrtA เพิ่มเติมเอนไซม์แข็งแกร่งกว่าวิเคราะห์ก่อนหน้านี้ระบุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไอโซฟอร์ม SrtA ของ Staphylococcus aureus sortase transpeptidase เป็นผู้รับผิดชอบต่อสิ่งที่แนบมาโควาเลนต์ของ virulence- และ
โปรตีนล่าอาณานิคมที่เกี่ยวข้องกับ peptidoglycan แบคทีเรีย Sortase ใช้สองพื้นผิว undecaprenol-pyrophosphoryl-
MurNAc (GlcNAc) -Ala-D-isoGlu-ลิซ (E-Gly5) -D-Ala-D-Ala (แยกไขมัน II) และโปรตีนที่หลั่งที่มีป่าสงวน
ลำดับ LPXTG ใกล้ของพวกเขา C ปลายทาง SrtA พร้อมกันแข็งกระด้างพันธบัตร Thr-Gly ของโปรตีน LPXTG ที่มีรูปแบบและ
พันธะเอไมด์ใหม่กับกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วนของ Gly5 แยกไขมันที่สองทอดสมอโปรตีนนี้สำคัญ
กลางที่ polymerized ก็เป็น peptidoglycan ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่ารายงานกิจกรรมการเรืองแสงดับ
ตรวจสำหรับ SrtA อาจมีการเรืองแสงที่ทำเครื่องหมายผลกรองภายในดับส่งผลให้ความเร็วการผ่อนชำระก่อนเวลาอันควรเมื่อเทียบกับ
รูปแบบพื้นผิวและดูถูกของ kcat พารามิเตอร์ที่แท้จริงเกี่ยวกับการเคลื่อนไหวและกม ดังนั้นเราจึงวางแผนที่มีประสิทธิภาพสูงต่อเนื่อง
ของเหลว chromatography (HPLC) ในการตรวจชั่นการตรวจสอบปฏิกิริยา SrtA ใช้วัสดุเดียวกับที่ใช้ใน
การเรืองแสงดับทดสอบ: Gly5 และ Abz-LPETG-เบา (Dnp) -NH2 การเรืองแสงรังสียูวีหรือการตรวจสอบโดยใช้พื้นผิวเหล่านี้อำนวยความสะดวกใน
การวิเคราะห์แยกของทั้งสอง acylation และขั้นตอนการ transpeptidation ของการเกิดปฏิกิริยา เพราะ HPLC ได้รับการดำเนินการโดยใช้
คอลัมน์วิเคราะห์อย่างรวดเร็วไหล (<8 นาที / วิ่ง), การใช้งานที่ความเร็วสูงของการทดสอบนี้สำหรับการวิเคราะห์ SrtA จำเพาะตั้งต้น
กลไกการเคลื่อนไหวและการยับยั้งตอนนี้เป็นไปได้ การวิเคราะห์การเคลื่อนไหวโดยใช้วิธี HPLC พบว่าพารามิเตอร์สำหรับ
SrtA กับ Abz-LPETG-เบา (Dnp) -NH2 เป็น 5.5mm สำหรับค่า Km และ 0.27 หรือไม่ 1 สำหรับ kcat ที่กมสำหรับ Gly5 มุ่งมั่นจะเป็น 140 LM
ค่าเหล่านี้แสดงถึงการเพิ่มขึ้น 300 เท่าในกมสำหรับพื้นผิว LPXTG และเพิ่มขึ้น 12,000 เท่าใน kcat กว่าวรรณกรรมรายงาน
ค่าบอกว่า SrtA เป็นเอนไซม์ที่แข็งแกร่งกว่าการวิเคราะห์ก่อนหน้านี้มากกว่า ชี้ให้เห็น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ srta ไอโซฟอร์มของ Staphylococcus aureus sortase transpeptidase รับผิดชอบสิ่งที่แนบการของโรค -
การเกี่ยวข้องโปรตีนให้กับเปปติโดไกลแคน แบคทีเรีย sortase ใช้สองพื้นผิว undecaprenol pyrophosphoryl -
murnac ชีวิต - ala-d-isoglu-lys ( e-gly5 ) - d-ala-d-ala ( ย่อยไขมัน II ) และการหลั่งโปรตีนชนิดหนึ่งที่มีที่มีการอนุรักษ์
lpxtg ลำดับใกล้ของพวกเขา C แทร์มินี่ . srta พร้อมกันคลีฟส์ช่วง GLY พันธบัตรของ lpxtg ที่มีรูปแบบโปรตีนและ
พันธบัตรและใหม่ด้วยกลุ่มอะมิโน nucleophilic ของส่วนของกิ่ง gly5 ไขมัน II , anchoring โปรตีนระดับกลางคีย์
นี้ที่ต่อมา polymerized เป็นเปปติโดไกลแคน . ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าดับกิจกรรม
รายงานเรืองใช้สำหรับ srta อาจมีเครื่องหมายเรืองแสงภายในกรองผลดับผลก่อนเวลาอันควรเมื่อเทียบกับค่าความเร็ว ( underestimates
โปรไฟล์ของจริงค่าพารามิเตอร์จลน์ kcat และกม. เราจึงวางแผนไม่ต่อเนื่องที่มีประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography ( HPLC )
- based assay เพื่อตรวจสอบ srta ปฏิกิริยาการเดียวกันที่ใช้ใน
พื้นผิวโดย : gly5 abz ดับ ) และ lpetg DAP ( DNP ) - nh2 . การใช้พื้นผิวหรือตรวจจับยูวีเหล่านี้อำนวยความสะดวก
การวิเคราะห์แยกทั้งสำคัญและ transpeptidation ขั้นตอนของปฏิกิริยา เพราะการใช้ HPLC
ไหลเร็ววิเคราะห์คอลัมน์ ( < 8 นาที / วิ่ง ) ใช้วิธีนี้ช่วยในการวิเคราะห์พื้นผิว srta ต่อ
กลไกจลน์และยับยั้งก็เป็นไปได้ การวิเคราะห์จลนศาสตร์โดยใช้ HPLC assay พบว่าค่าพารามิเตอร์จลน์สำหรับ
srta กับ abz lpetg DAP ( DNP ) - nh2 เป็น 5.5mm สำหรับ km และ 0.27 วินาที
1 สำหรับ kcat . กิโลเมตรสำหรับ gly5 ตัดสินใจว่า 140 LM .
ค่าเหล่านี้เป็นตัวแทนของ 300 พับเพิ่ม km สำหรับ lpxtg ( 12000 พับเพิ่ม kcat ผ่านวรรณกรรมรายงาน
ค่าแนะนำว่า srta เป็นเอนไซม์ที่แข็งแกร่งกว่าเดิม
วิเคราะห์ระบุ