Lin-Yi Meng et al3484 Asian Pacific

Lin-Yi Meng et al
3484 Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, Vol 13, 2012
We found that ECMS induces cell cycle G2/M arrest and
apoptosis by decreasing PI3K/Akt signaling.
Materials and Methods
Materials and reagents
Cochinchina momordica seed was purchased from an
herb market in China. Fetal bovine serum (FBS), RPMI
1640 medium, penicillin G, streptomycin and trypsin
were obtained from the Invitrogen Corporation, USA.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) and ribonuclease (RNase)
were purchased from Sigma Chemical, USA. The
3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di-phenytetra-
zoliumromide (MTT) was purchased from AMRESCO
Inc., USA. Hoechst staining kit, Cell cycle analysis
kit, Apoptosis analysis kit, BCA protein analysis kit
and Propidium iodide (PI) agents were purchased from
Beyotime, China. The PVDF membranes were purchased
from Millipore Corporation, Massachusetts, USA. The
polyclone antibodies to PI3K, Akt, NF-κB, caspase-3,
Bax and Bcl-2 were purchased from Cell Signaling, USA.
Preparation of the extract
500 ml of 62% ethanol solution were added to 150 g
(dry weight) of Cochinchina momordica seed flour and
the extract was obtained from a cold soak for 24 h. Then
the extract was refluxed and filtered for 1 h. Collect the
filtrate and added 160 ml of 62% ethanol solution into the
residue. Duplicate the above processes and combine the
filtrates. Add the filtrates into the wet macroporous resin
column. The full absorption in the resin after the resin three
times, the volume of 30%, 50%, 70%, 90% concentration
of ethanol was eluted. Combine and freeze dry the eluent
for ECMS.
Cancer cell line and culture
Human breast cancer MDA-MB-231 cells obtained
from Shanghai Institute for Biological Sciences, China,
and cultured in DMEM medium supplemented with 10%
(v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 100
IU/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, kept at 37℃
in a humidified 5% CO2
incubator. Cells were passaged
every 2-3 days and always used at about 80-90% of the
confluence at passages between 3 and 20 after defreezing.
They were seeded into different culture plates or dishes
at a corresponding density for the respective assays.
Cell proliferation assay
The cell proliferation was measured by MTT method.
Briefly, MDA-MB-231 cells were collected and seeded
in 96-well plates at a density of 5×103
cells/well, and
treated with phosphate buffered saline (PBS), various
concentrations of ECMS and positive control factor,
5-fluorouracil. After incubation for 24 h, 48 h or 72 h, the
medium was removed and replaced with a fresh medium
(180 µl/well). 20 µl of MTT solution (5 mg/ml) added to
each well and the plates were incubated for additional 4 h
at 37℃. Then, the medium was aspirated off, and 150 µl of
DMSO were added to each well. The absorbance was read
at 570 nm as test wavelengths using a microplate reader
(TECAN Infinite 200). Cell viability was expressed as a
percentage of the untreated cells.
Nuclear staining with Hoechst 33258
MDA-MB-231 cells were seeded in 24-well plates at
a density of 5×103
cells/well, and incubated with ECMS
(0.1, 0.2 and 0.4 mg/ml) for 48h. Cellular monolayer in 24-
well plates was fixed and stained with DNA fluorochrome
Hoechst 33258 for 20 min. After washed with PBS, the
morphological features of apoptosis (including cellular
nucleus shrinkage, chromatin condensation, intense
fluorescence and nuclear fragmentation) were monitored
by fluorescence microscopy (Zeiss, German).
Measurement of apoptosis by Annexin V-FITC/PI staining
Flow cytometry was used to quantitatively detect the
apoptotic rate. Cells (5×103
/well) were seeded into 6-well
plates and exposed to ECMS at various concentrations
(0.1, 0.2 and 0.4 mg/ml) for 48 h, and then harvested and
washed with phosphate buffered saline (PBS). Staining
went along with 195 µl bonding buffer containing 5 µl
Annexin V-FITC in the dark at room temperature for 10
min, and then added 10 µl PI in the dark 4℃ for 10 min.
The apoptotic cells were analyzed with FACScan flow
cytometry (BD FACSCalibur).
Analysis of cell cycle by PI staining
Cells (3×105
/well) were seeded into 6-well plates and
exposed to ECMS at various concentrations (0.1, 0.2 and
0.4 mg/ml) for 48 h, and then harvested and washed with
PBS, fixed in 70% ethanol at 4℃. Staining went along
with PBS containing 40 (g/ml RNaseA and 10 µg/ml
PI in the dark at room temperature for 30 min. The cell
cycle was measured using FACScan Flow cytometry (BD
FACSCalibur).
Western blotting assay
When administration with ECMS (0.1, 0.2, 0.3 mg/
ml) for 48 h, MDA-MB-231 cells were collected and
homogenized in 200 µl RIPA lysis buffer. Cell lysate was
centrifuged (12,000×g for 15 min at 4°C) and protein
concentration was determined by the BCA protein
assay kit. Equal amounts of protein were denatured and
separated by 10% SDS-PAGE, then transferred onto
PVDF membranes using a Bio-Rad miniprotein-III wet
transfer unit. Nonspecific binding was blocked with
5% bovine serum albumin dissolved in TBST at room
temperature for 1 h. Subsequently, the membranes were
then washed three times and incubated with individual
primary antibodies of PI3K, Akt, NF-κB, Bax, Bcl-
2, Cdk1, Cyclin B1 and caspase-3 at 4°C over night.
The membranes were incubated with the horseradish
peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody
for 1 h at room temperature followed by three washings.
The signals were detected with a chemiluminescence
ECL reagent and quantified by densitometry using a gel
visualizer (Alpha Innotech, CA, USA). GAPDH served
as the loading control, and the results were expressed as
the percentage of control.
Statistical analysis
The data were expressed as means (standard errors of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลินยี่ Meng et al3484 เอเชียแปซิฟิกสมุดรายวันของการป้องกันโรคมะเร็ง Vol 13, 2012เราพบว่า ECMS แท้จริงจับรอบเซลล์ G2/M และ apoptosis สตาร์ท PI3K/Akt ตามปกติวัสดุและวิธีการวัสดุและ reagentsเมล็ดสมุนไพร Cochinchina ถูกซื้อจากการ ตลาดสมุนไพรในประเทศจีน ครรภ์วัวซีรั่ม (FBS), RPMI กลางค.ศ. 1640 ยาเพนนิซิลลิน G, streptomycin และทริปซิน ได้รับมาจาก บริษัท Invitrogen สหรัฐอเมริกา Dimethyl sulfoxide (DMSO) และ ribonuclease (RNase) ซื้อจากซิกเคมี สหรัฐอเมริกา ที่ 3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (- z - y1) -3, 5-ดิ-phenytetra -zoliumromide (MTT) ที่ซื้อจาก AMRESCO อิงค์ สหรัฐอเมริกา อย่างไร Hoechst ย้อมสีชุด วิเคราะห์วงจรเซลล์ ชุด ชุดวิเคราะห์ Apoptosis ชุดวิเคราะห์โปรตีน BCA และซื้อจากตัวแทน Propidium ไอโอไดด์ (PI) Beyotime ประเทศจีน ซื้อสาร PVDF จาก บริษัทมาก รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา ที่ แอนตี้ polyclone PI3K, Akt, NF-κB, caspase-3 Bax และ Bcl 2 ถูกซื้อจากเซลล์ตามปกติ สหรัฐอเมริกา เตรียมการดึงข้อมูลขนาด 500 มล.ของ 62% เอทานอลได้เพิ่ม 150 กรัม (น้ำหนักแห้ง) ของแป้งเมล็ดสมุนไพร Cochinchina และ สารสกัดได้รับจากแช่เย็นใน 24 ชม แล้ว refluxed และ h. 1 รวบรวมคัดแยกจะ สารกรอง และเพิ่ม 160 ml ของเอทานอล 62% เป็น สารตกค้าง ทำซ้ำขั้นตอนข้างต้น และรวมการ filtrates เพิ่ม filtrates ที่เป็นยาง macroporous เปียก คอลัมน์ ดูดซึมเต็มในยางไม้ยางสามหลัง เวลา ปริมาณ 30%, 50%, 70% ความเข้มข้น 90% ของเอทานอลที่ eluted รวม และแห้งตรึง eluent สำหรับ ECMSบรรทัดของเซลล์มะเร็งและวัฒนธรรมเซลล์มะเร็ง MDA-MB-231 เต้านมมนุษย์ที่ได้รับ จาก สถาบันวิทยาศาสตร์ชีวภาพ จีน เซี่ยงไฮ้ และอ่างใน DMEM เสริม ด้วย 10% (v/v) ยกเลิกความร้อนครรภ์วัวซีรั่ม (FBS) และ 100 ยาเพนนิซิลลิน IU/ml, 100 mg/ml streptomycin เก็บไว้ที่ 37℃ ใน humidified 5% CO2 บ่มเพาะวิสาหกิจ เซลล์ถูก passaged ทุก 2-3 วัน และมักจะใช้ประมาณ 80-90% ของการ บรรจบที่ทางเดินระหว่าง 3 และ 20 หลังจาก defreezing พวกเขาถูก seeded แผ่นวัฒนธรรมต่าง ๆ หรืออาหาร ที่ความหนาแน่นที่สอดคล้องกันสำหรับ assays ตามลำดับทดสอบการขยายตัวของเซลล์ขยายเซลล์ถูกวัด ด้วยวิธี MTT สั้น ๆ รวบรวม และ seeded เซลล์ MDA-MB-231 ในดี 96 แผ่นที่ความหนาแน่นของ 5 × 103 เซลล์/ดี และ รักษา ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBS), ต่าง ๆ ความเข้มข้นของ ECMS และปัจจัยควบคุมบวก 5-fluorouracil หลังจากบ่ม 24 h, 48 h หรือ 72 h การ เอาออก และแทนที่ ด้วยสื่อสดกลาง (180 µl/ดี) เพิ่ม 20 µl ของ MTT (5 mg/ml) แต่ละบ่อและแผ่นถูก incubated สำหรับ h 4 เพิ่มเติม ที่ 37℃ แล้ว aspirated การสื่อปิด และ 150 µl ของ เพิ่ม DMSO ให้ดีละกัน Absorbance ที่ถูกอ่าน ที่ 570 nm เป็นความยาวคลื่นทดสอบใช้อ่าน microplate (TECAN 200 อนันต์) เซลล์นี้ถูกแสดงเป็นการ เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ไม่ถูกรักษาไว้ ย้อมสี ด้วยอย่างไร Hoechst 33258 นิวเคลียร์MDA-MB-231 เซลล์ถูก seeded ในดี 24 แผ่นที่ ความหนาแน่นของ 5 × 103 เซลล์/ดี และ incubated กับ ECMS (0.1, 0.2 และ 0.4 mg/ml) สำหรับ 48h Monolayer โทรศัพท์มือถือใน 24ถาวร และสีกับดีเอ็นเอ fluorochrome ทั้งแผ่น อย่างไร Hoechst 33258 สำหรับ 20 นาที หลังจากล้าง ด้วย PBS การ ลักษณะสัณฐานของ apoptosis (รวมทั้งมือถือ หดตัวนิวเคลียส โครมาตินมีหยดน้ำเกาะ รุนแรง ติดตามการกระจายตัวของนิวเคลียร์และ fluorescence) โดย fluorescence microscopy (Zeiss เยอรมัน) วัด apoptosis โดยย้อมสี Annexin V-FITC/PIใช้เซลล์กระแส quantitatively ตรวจการ อัตรา apoptotic เซลล์ (5 × 103/ ดี) ถูก seeded เข้า 6-ดี แผ่น และ ECMS สัมผัสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0.1, 0.2 และ 0.4 mg/ml) สำหรับ 48 h และเก็บเกี่ยวผลผลิตแล้ว และ ล้าง ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBS) ย้อมสี ไปพร้อมกับบัฟเฟอร์ยึด µl 195 ประกอบด้วย 5 µl Annexin V FITC ในมืดที่อุณหภูมิห้อง 10 นาที และเพิ่ม 10 µl PI ใน 4 ℃สีดำใน 10 นาที มีวิเคราะห์เซลล์ apoptotic กับไหล FACScan เซลล์ (BD FACSCalibur)วิเคราะห์วงจรเซลล์โดยย้อมสีปี่เซลล์ (3 × 105/ ดี) ถูก seeded เป็นดี 6 แผ่น และ ECMS สัมผัสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0.1, 0.2 และ 0.4 mg/ml) สำหรับ 48 h และเก็บเกี่ยวผลผลิต แล้วล้างด้วย PBS ถาวรในเอทานอล 70% ที่ 4 ℃ ย้อมสีไปตาม ด้วย PBS ประกอบด้วย 40 (g/ml RNaseA และ ml 10 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง ผีในมืดอุณหภูมิห้องสำหรับ 30 นาที เซลล์ วงจรถูกวัดโดยใช้เซลล์กระแส FACScan (BD FACSCalibur)ตะวันตก blotting วิธีวิเคราะห์เมื่อจัดการกับ ECMS (0.1, 0.2, 0.3 มิลลิกรัม /มล.) สำหรับ 48 h, MDA-MB-231 เซลล์ถูกรวบรวม และ homogenized เป็นกลุ่มใน 200 µl ริป้าราคา lysis บัฟเฟอร์ มีเซลล์ lysate centrifuged (12, 000 ซื้อ g สำหรับ 15 นาทีที่ 4° C) และโปรตีน กำหนดความเข้มข้น ด้วยโปรตีน BCA ชุดทดสอบ จำนวนเท่าของโปรตีนถูก denatured และ โดย 10% SDS หน้า การโอนย้ายไปยังแล้ว สาร PVDF ใช้เป็นไบโอ-Rad miniprotein-III เปียก โอนย้ายหน่วยงาน ผูกเจาะจงถูกบล็อกด้วย 5% วัว serum albumin ละลายใน TBST ห้อง อุณหภูมิสำหรับ 1 h ในเวลาต่อมา สารถูก แล้วละซักแล้วสามครั้ง และ incubated ด้วย แอนตี้หลัก PI3K, Akt, NF κB, Bax, Bcl-2, Cdk1, Cyclin B1 และ caspase-3 ที่ 4° C ข้ามคืน สารมี incubated กับ horseradish peroxidase กลวงป้องกันกระต่าย IgG รองแอนติบอดี สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องตาม ด้วยสาม washings สัญญาณที่พบกับ chemiluminescence ที่ รีเอเจนต์ ECL และ quantified โดยใช้เจ densitometry จอภาพ (อัลฟา Innotech, CA, USA) GAPDH ให้บริการ ควบคุมโหลด และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็น เปอร์เซ็นต์ของการควบคุมวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลที่แสดงความหมาย (มาตรฐานข้อผิดพลาด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Lin-Yi เม้ง et al,
3484 เอเชียแปซิฟิกวารสารการป้องกันโรคมะเร็ง, ฉบับที่ 13, 2012
เราพบว่า ECMS ก่อให้เกิดวงจรมือถือ G2 / M
การจับกุมและการตายของเซลล์โดยการลดPI3K / สัญญาณสิ้นคิด. วัสดุและวิธีการวัสดุและสารเคมีCochinchina มะระเมล็ดซื้อมาจากตลาดสมุนไพรในประเทศจีน ซีรั่มของทารกในครรภ์วัว (FBS) RPMI 1640 กลาง penicillin G, streptomycin และ trypsin ที่ได้รับจาก Invitrogen คอร์ปอเรชั่นสหรัฐอเมริกา. Dimethyl sulfoxide (DMSO) และ ribonuclease (RNase) ที่ซื้อมาจากซิกเคมี, สหรัฐอเมริกา 3 (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di-phenytetra- zoliumromide (MTT) ซื้อมาจาก AMRESCO อิงค์ประเทศสหรัฐอเมริกา ชุดการย้อมสี Hoechst วงจรการวิเคราะห์เซลล์ชุดชุดวิเคราะห์Apoptosis ชุดวิเคราะห์โปรตีนเก็บกวาดและไอโอไดด์Propidium (PI) ตัวแทนที่ซื้อมาจากBeyotime จีน เยื่อ PVDF ที่ซื้อมาจากคคอร์ปอเรชั่น, Massachusetts, สหรัฐอเมริกา แอนติบอดี polyclone เพื่อ PI3K, สิ้นคิด, NF-κB, caspase-3, แบ็กซ์และ Bcl-2 ที่ซื้อมาจากสัญญาณมือถือ, USA. การเตรียมสารสกัด500 มล. ของการแก้ปัญหาเอทานอล 62% ถูกเพิ่มเข้าไปใน 150 กรัม(น้ำหนักแห้ง) ของ แป้งเมล็ดมะระโคชินและสารสกัดที่ได้รับจากการนอนแช่เย็นเป็นเวลา24 ชั่วโมง จากนั้นสารสกัดที่ถูก refluxed และกรองเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เก็บกรองและเพิ่ม 160 มล. ของการแก้ปัญหาเอทานอล 62% ลงในสารตกค้าง ซ้ำกระบวนการข้างต้นและรวมfiltrates เพิ่ม filtrates ลงในเรซิน macroporous เปียกคอลัมน์ การดูดซึมเต็มรูปแบบในเรซินหลังจากเรซินสามครั้งปริมาณ 30%, 50%, 70%, 90% ความเข้มข้นของเอทานอลชะ รวมและแช่แข็งแห้งตัวชะสำหรับ ECMS. สายพันธุ์ของเซลล์มะเร็งและวัฒนธรรมของมนุษย์มะเร็งเต้านม MDA-MB-231 เซลล์ที่ได้รับจากเซี่ยงไฮ้สถาบันวิทยาศาสตร์ชีวภาพ, จีน, และเพาะเลี้ยงในกลาง DMEM เสริมด้วย 10% (v / v) ความร้อนที่ใช้งาน ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) และ 100 IU / ml ยาปฏิชีวนะ 100 mg / ml streptomycin, เก็บไว้ที่ 37 ℃ในความชื้น5% CO2 ศูนย์บ่มเพาะ เซลล์ที่ถูก passaged ทุก 2-3 วันและมักจะใช้เวลาประมาณ 80-90% ของบรรจบกันที่ทางเดินระหว่าง3 และ 20 หลังจาก defreezing. พวกเขาได้รับเมล็ดลงในแผ่นวัฒนธรรมที่แตกต่างหรืออาหารที่มีความหนาแน่นที่สอดคล้องกันสำหรับการตรวจตามลำดับ. ทดสอบการแพร่กระจายของเซลล์การงอกของเซลล์วัดด้วยวิธี MTT. สั้น ๆ , MDA-MB-231 เซลล์ถูกเก็บรวบรวมและเมล็ดในแผ่น96 หลุมที่มีความหนาแน่นของ 5 × 103 เซลล์ / ดีและรับการรักษาด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ(พีบีเอส) ต่างๆที่มีความเข้มข้นของECMS และปัจจัยที่ควบคุมบวก5 fluorouracil หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมงหรือ 72 ชั่วโมงที่สื่อจะถูกลบออกไปและแทนที่ด้วยสื่อสด(180 ไมโครลิตร / กัน) 20 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา MTT (5 mg / ml) เพิ่มเข้ามาในแต่ละจานที่ดีและได้รับการบ่มเป็นเวลา4 ชั่วโมงเพิ่มเติมที่37 ℃ จากนั้นสื่อที่ถูกดูดออกไปและ 150 ไมโครลิตรของDMSO ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดี การดูดกลืนแสงที่ได้รับการอ่านที่ 570 นาโนเมตรเป็นความยาวคลื่นการทดสอบโดยใช้เครื่องอ่าน microplate (TECAN ไม่มีที่สิ้นสุด 200) ชีวิตของเซลล์ได้รับการแสดงเป็นร้อยละของเซลล์ที่ได้รับการรักษา. การย้อมสีนิวเคลียร์กับ Hoechst 33258 MDA-MB-231 เซลล์เมล็ดในแผ่น 24 หลุมที่มีความหนาแน่นของ5 × 103 เซลล์ / ดีและบ่มกับ ECMS (0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) สำหรับ 48 ชั่วโมง monolayer โทรศัพท์มือถือใน 24 แผ่นเดียวได้รับการแก้ไขและการย้อมด้วยสารเรืองแสงเป็นดีเอ็นเอHoechst 33258 สำหรับ 20 นาที ล้างหลังจากที่มีพีบีเอสที่ลักษณะทางสัณฐานของการตายของเซลล์(รวมถึงโทรศัพท์มือถือหดตัวนิวเคลียสควบแน่นโครมาติรุนแรงเรืองแสงและการกระจายนิวเคลียร์) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Zeiss, ภาษาเยอรมัน). การวัดการตายโดย Annexin V-FITC / PI ย้อมสีcytometry ไหลเป็น ที่ใช้ในการตรวจสอบปริมาณอัตราapoptotic เซลล์ (5 × 103 / ดี) มีเมล็ดเป็น 6 ดีจานและสัมผัสกับECMS ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ(0.1, 0.2 และ 0.4 mg / ml) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงและเก็บเกี่ยวแล้วและล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(พีบีเอส) การย้อมสีไปพร้อมกับ 195 บัฟเฟอร์พันธะไมโครลิตรมี 5 ไมโครลิตร Annexin V-FITC ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีและจากนั้นเพิ่ม 10 ไมโครลิตร PI ในที่มืด 4 ℃เป็นเวลา 10 นาที. เซลล์ apoptotic วิเคราะห์ที่มีการไหล FACScan ภูมิคุ้มกัน ( BD FACSCalibur). การวิเคราะห์วงจรมือถือโดย PI ย้อมสีเซลล์(3 × 105 / ดี) ได้รับเมล็ดลงในแผ่น 6 ดีและสัมผัสกับECMS ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ (0.1, 0.2 และ0.4 mg / ml) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงและจากนั้นการเก็บเกี่ยว และล้างด้วยพีบีเอส, การแก้ไขในเอทานอล 70% ที่ 4 ℃ การย้อมสีไปพร้อมกับพีบีเอสที่มี 40 (g / ml RNaseA และ 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร PI ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที. เซลล์รอบวัดโดยใช้FACScan ไหลภูมิคุ้มกัน (BD FACSCalibur). ทดสอบซับตะวันตกเมื่อการบริหารงานที่มี ECMS ( 0.1, 0.2, 0.3 mg / ml) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง, MDA-MB-231 เซลล์ถูกเก็บรวบรวมและปั่นใน200 ไมโครลิตร RIPA lysis บัฟเฟอร์. lysate เซลล์หมุนเหวี่ยง(12,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C) และโปรตีนเข้มข้นเป็นกำหนดโดยโปรตีนเก็บกวาดชุดทดสอบ. จำนวนเงินที่เท่ากันของโปรตีนที่ถูกแปลงสภาพและแยกจากกันโดย10% SDS-PAGE จากนั้นก็ย้ายไปยังเยื่อPVDF ใช้ Bio-Rad miniprotein-III เปียกหน่วยโอน. เชิญชมผลผูกพันถูกบล็อกด้วย5% โปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มวัว ละลายใน TBST ณ ห้องอุณหภูมิ1 ชม. ต่อจากนั้นเยื่อที่ถูกล้างแล้วสามครั้งและบ่มกับบุคคลแอนติบอดีหลักของPI3K, สิ้นคิด, NF-κB, แบ็กซ์, Bcl- 2 Cdk1, Cyclin B1 และ caspase-3 ที่ 4 ° C ข้ามคืน. เยื่อถูกบ่มกับพืชชนิดหนึ่งแอนติบอดี peroxidase-ผัน IgG ต่อต้านกระต่ายรองเป็นเวลา1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องตามด้วยสามซัก. สัญญาณที่ตรวจพบมี chemiluminescence น้ำยา ECL และวัดโดยความหนาแน่นของการใช้เจลVisualizer ( อัลฟา Innotech, CA, USA) GAPDH ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการโหลดและผลที่ได้รับการแสดงเป็นร้อยละของการควบคุม. การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลแสดงเป็นหมายความว่า (ข้อผิดพลาดมาตรฐานของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลินอี้เม้ง et al
3243 เอเชียแปซิฟิกวารสารการป้องกันมะเร็ง Vol 13 , 2012
เราพบว่า ecms ก่อให้เกิดวัฎจักรเซลล์ G2 / M ( โดยการลด pi3k จับกุมและ

/ akt ส่งสัญญาณ วัสดุและวิธีการวัสดุและสารเคมี

โคชินจีนสมุนไพรเมล็ด
สมุนไพร ซื้อจากตลาดในประเทศจีน แม่วัวเลือด ( FBS ) , RPMI 1640 penicillin G ,
) และสเตร็ปโตมัยซินซิน
ที่ได้รับจากบริษัท Invitrogen , USA
เต๊ะ ( DMSO ) และไรโบนิวคลีเ ( เลส )
ซื้อมาจาก Sigma เคมี , USA
3 - ( 4 , 5 ) - dimethylthiahiazo ( - z-y1 ) - 3 , 5-di-phenytetra -
zoliumromide ( MTT ) ซื้อมาจาก amresco
Inc . , USA Hoechst จากชุด ชุดวิเคราะห์
วัฏจักรเซลล์ ชุดวิเคราะห์โปรตีน ( โปรตีนการวิเคราะห์ชุด
propidium และไอโอไดด์ ( PI ) ตัวแทนซื้อมาจาก
beyotime , จีน ที่ซื้อจากเมมเบรน PVDF
มิลลิ Corporation , Massachusetts , USA
polyclone แอนติบอดี pi3k akt , NF , - κ B , การศึกษาลักษณะ
BAX , และการส่งสัญญาณของเซลล์ bcl-2 ซื้อมาจากอเมริกา การเตรียมสารสกัด

500 มิลลิลิตร สารละลายเอทานอลร้อยละ 62 เพิ่ม 150 g
น้ำหนักแห้งของโคชินจีนสมุนไพรและสารสกัดเมล็ดแป้ง
ได้จากการแช่เย็นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วกรองแยกเป็น refluxed

1 h . เก็บกรองและเพิ่ม 160 มิลลิลิตร สารละลายเอทานอลร้อยละ 62 ใน
กาก ทำซ้ำกระบวนการข้างต้น และรวม
สารละลาย . เติมสารละลายลงในคอลัมน์เรซินเปียก
macroporous .เต็มหลังการดูดซึมในเรซินเรซิน 3
ครั้ง ปริมาณ 30% , 50% , 70% , 90% เอทานอลความเข้มข้น
คือตัวอย่าง . รวมและแช่แข็งแห้งเพื่อ ecms ตัว
.
เซลล์มะเร็ง และเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์วัฒนธรรม

mda-mb-231 ได้รับจากสถาบันวิทยาศาสตร์ทางชีวภาพ เซี่ยงไฮ้ประเทศจีน
และเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย dmem 10 %