Digital Encoding of Cellular mRNAs

Digital Encoding of Cellular mRNAs Enabling Precise and Absolute Gene Expression Measurement by Single-Molecule Counting

Glenn K. Fu*, Julie Wilhelmy, David Stern, H. Christina Fan, and Stephen P. A. Fodor*
Cellular Research Inc., 3183 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, United States
Anal. Chem., 2014, 86 (6), pp 2867–2870
DOI: 10.1021/ac500459p
Publication Date (Web): March 4, 2014
Copyright © 2014 American Chemical Society
*E-mail: [e-mail]. Tel: [phone]., *E-mail: [e-mail]. Tel: [phone].
ACS AuthorChoice - Terms of Use
Abstract
Abstract Image
We present a new approach for the sensitive detection and accurate quantitation of messenger ribonucleic acid (mRNA) gene transcripts in single cells. First, the entire population of mRNAs is encoded with molecular barcodes during reverse transcription. After amplification of the gene targets of interest, molecular barcodes are counted by sequencing or scored on a simple hybridization detector to reveal the number of molecules in the starting sample. Since absolute quantities are measured, calibration to standards is unnecessary, and many of the relative quantitation challenges such as polymerase chain reaction (PCR) bias are avoided. We apply the method to gene expression analysis of minute sample quantities and demonstrate precise measurements with sensitivity down to sub single-cell levels. The method is an easy, single-tube, end point assay utilizing standard thermal cyclers and PCR reagents. Accurate and precise measurements are obtained without any need for cycle-to-cycle intensity-based real-time monitoring or physical partitioning into multiple reactions (e.g., digital PCR). Further, since all mRNA molecules are encoded with molecular barcodes, amplification can be used to generate more material for multiple measurements and technical replicates can be carried out on limited samples. The method is particularly useful for small sample quantities, such as single-cell experiments. Digital encoding of cellular content preserves true abundance levels and overcomes distortions introduced by amplification.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดิจิทัล mRNAs ที่เข้าของโทรศัพท์มือถือเปิดการใช้งานแม่นยำและประเมินนิพจน์ยีนสัมบูรณ์ โดยการนับเชิงโมเลกุลเดี่ยวเกล็นคุณ Fu * จูลี่ Wilhelmy, David สเติร์น H. คริพัดลม และ Stephen P. A. Fodor *มือถือวิจัย Inc., 3183 กระเป๋าไดรฟ์ ดัลลัส แคลิฟอร์เนีย 94304 สหรัฐอเมริกาทางทวารหนัก Chem., 2014, 86 (6), pp 2867-2870ดอย: 10.1021/ac500459pวันเผยแพร่ (เว็บ): 4 มีนาคม 2014ลิขสิทธิ์ © ปี 2014 อเมริกันสมาคมเคมี* อีเมล์: [e-mail] โทร: (+ 1) 650 7526144., * อีเมล์: [e-mail] โทร: (+ 1) 650 7526144AuthorChoice ACS - เงื่อนไขการใช้บทคัดย่อภาพนามธรรมเรานำเสนอวิธีใหม่ในการตรวจสอบที่สำคัญและต้องการวิเคราะห์หาปริมาณกรด ribonucleic messenger (mRNA) ใบแสดงผลของยีนในเซลล์เดียว ครั้งแรก ประชากรทั้งหมดของ mRNAs ถูกเข้ากับบาร์โค้ดโมเลกุลระหว่าง transcription ย้อน หลังจากขยายเป้าหมายยีนน่าสนใจ บาร์โค้ดโมเลกุลจะนับตามลำดับ หรือคะแนนใน hybridization เรื่องตรวจจับให้เหมาะกับจำนวนโมเลกุลในตัวอย่างเริ่มต้น เนื่องจากปริมาณที่แน่นอนที่ วัด ปรับเทียบมาตรฐานมีความจำเป็น และจำนวนมากของความท้าทายการวิเคราะห์หาปริมาณสัมพัทธ์เช่นพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ความโน้มเอียงจะหลีกเลี่ยง เราใช้วิธีการวิเคราะห์ยีนนิพจน์ตัวอย่างนาทีปริมาณ และแสดงให้เห็นถึงวัดที่แม่นยำ ด้วยความไวลงไประดับย่อยเซลล์เดียว วิธีทดสอบง่าย หลอดเดียว จุดสิ้นสุดการใช้มาตรฐานความร้อน cyclers และ PCR reagents ได้ วัดที่ถูกต้อง และแม่นยำจะได้รับโดยไม่จำเป็น สำหรับวงจรวงจรความเข้มตามแบบเรียลไทม์ตรวจสอบ หรือพาร์ทิชันเป็นปฏิกิริยาหลาย (เช่น ดิจิตอล PCR) จริง เพิ่มเติม ตั้งแต่โมเลกุล mRNA ทั้งหมดจะถูกเข้ารหัสกับบาร์โค้ดโมเลกุล ขยายที่สามารถใช้ในการสร้างวัสดุเพิ่มเติมสำหรับการประเมินหลาย และเหมือนกับทางเทคนิคสามารถทำบนตัวอย่างจำกัด วิธีนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับตัวอย่างขนาดเล็กปริมาณ เช่นทดลองเซลล์เดียว การเข้ารหัสดิจิทัลเนื้อหาโทรศัพท์มือถือรักษาระดับความอุดมสมบูรณ์จริง และ overcomes บิดเบือนนำ โดยขยาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเข้ารหัสดิจิตอลมือถือ mRNAs การเปิดใช้งานการแสดงออกของยีนการวัดที่แม่นยำและ Absolute โดยโมเลกุลเดี่ยวนับเกล็นเคFu * จูลี่ Wilhelmy เดวิดสเติร์นเอชคริสติพัดลม, และสตีเฟนโด PA * เซลลูลาร์รีเสิร์ช, 3183 พอร์เตอร์ไดรฟ์พาโลอัลโต แคลิฟอร์เนีย 94304, สหรัฐอเมริกาก้น . Chem 2014, 86 (6), หน้า 2867-2870 DOI: 10.1021 / ac500459p วันที่ตีพิมพ์ (เว็บ): 4 มีนาคม 2014 สงวนลิขสิทธิ์© 2014 สมาคมเคมีอเมริกัน* E-mail: [e-mail] โทรศัพท์: ([phone]. * E-mail: [e-mail] โทรศัพท์: ([phone]. เอซีเอส AuthorChoice - ข้อตกลงการใช้บทคัดย่อภาพนามธรรมเรานำเสนอวิธีการใหม่สำหรับการตรวจสอบที่สำคัญและปริมาณที่ถูกต้องของผู้ส่งสารกรดribonucleic (mRNA) ใบรับรองผลการเรียนของยีนในเซลล์เดียว ครั้งแรกที่ประชากรทั้งหมดของ mRNAs จะถูกเข้ารหัสด้วยบาร์โค้ดโมเลกุลระหว่างการถอดรหัสแบบย้อนกลับ หลังจากการขยายของยีนเป้าหมายที่น่าสนใจบาร์โค้ดโมเลกุลจะนับโดยลำดับหรือฝ่ายตรวจจับการผสมพันธุ์ง่ายที่จะเปิดเผยจำนวนของโมเลกุลในกลุ่มตัวอย่างเริ่มต้น เนื่องจากปริมาณที่แน่นอนจะถูกวัดการสอบเทียบกับมาตรฐานที่ไม่จำเป็นและอีกหลายความท้าทายที่ปริมาณญาติเช่นวิธี polymerase chain reaction (PCR) อคติจะหลีกเลี่ยง เราใช้วิธีการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในปริมาณตัวอย่างนาทีและแสดงให้เห็นการวัดที่แม่นยำที่มีความไวลงไปอยู่ในระดับเดียวเซลล์ย่อย วิธีการเป็นเรื่องง่ายที่หลอดเดียวทดสอบจุดสิ้นสุดใช้ cyclers ความร้อนและสารเคมีมาตรฐาน PCR วัดที่ถูกต้องและแม่นยำจะได้รับโดยไม่ต้องใช้รอบต่อวงจรตามความเข้มตรวจสอบเวลาจริงหรือแบ่งทางกายภาพในปฏิกิริยาหลาย (เช่น PCR ดิจิตอล) นอกจากนี้เนื่องจากทุกโมเลกุล mRNA จะถูกเข้ารหัสด้วยบาร์โค้ดโมเลกุลขยายสามารถนำมาใช้ในการสร้างวัสดุอื่น ๆ อีกมากมายสำหรับการตรวจวัดซ้ำหลายครั้งและทางเทคนิคสามารถดำเนินการกับตัวอย่างที่ จำกัด วิธีการที่เป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับปริมาณตัวอย่างเล็ก ๆ เช่นการทดลองเซลล์เดียว การเข้ารหัสดิจิตอลของโทรศัพท์มือถือที่รักษาระดับความอุดมสมบูรณ์จริงและครอบงำบิดเบือนนำโดยการขยาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดิจิตอลการเข้ารหัสของรหัสเปิดใช้งานโทรศัพท์มือถือที่แม่นยำและแน่นอนการแสดงออกของยีนในการวัด โดยโมเลกุลเดี่ยวนับ

K . Fu * เกล็น จูลี่ wilhelmy เดวิด สเติร์น เอช คริสติน่า พัดลม และ สตีเฟน พี เอ โฟดอร์
มือถือวิจัยอิงค์ 3183 พนักงานขับรถ , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย 94304 ประเทศสหรัฐอเมริกา
ทวารหนัก เคมี , 2014 , 86 ( 6 ) , PP 2867 ) 0
ดอย : 10.1021 / ac500459p
วันที่ตีพิมพ์ ( เว็บ ) : 4 มีนาคม 2014
สงวนลิขสิทธิ์สงวนลิขสิทธิ์ 2014 อเมริกันสมาคมเคมี
* E - mail : [e-mail] . เรา : ( 1 ) 650 7526144 . * E-mail : [e-mail] . เรา : ( 1 ) 650 7526144 .
ACS authorchoice - เงื่อนไขการใช้ที่เป็นนามธรรมนามธรรมภาพ


เราเสนอวิธีใหม่สำหรับการตรวจหาเซลล์ที่ไว และแม่นยำของทูตสาธารณรัฐสังคมนิยมประชาธิปไตยศรีลังกา ( mRNA ) ยีน ยีนในเซลล์เดียว ครั้งแรกประชากรทั้งหมดของรหัสการเข้ารหัสที่มีบาร์โค้ดโมเลกุลระหว่าง reverse transcription หลังจากการเพิ่มปริมาณของยีนเป้าหมายที่น่าสนใจ , บาร์โค้ดโมเลกุลจะนับลำดับคะแนนหรือบนเครื่องทำง่ายที่จะเปิดเผยจำนวนของโมเลกุลในเริ่มตัวอย่าง เนื่องจากปริมาณสัมบูรณ์จะวัดการสอบเทียบมาตรฐานเป็นเรื่องไม่จำเป็นและหลายเซลล์ญาติของความท้าทายเช่นวิธีพีซีอาร์ ( PCR ) อคติจะหลีกเลี่ยง เราใช้วิธีการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน และแสดงให้เห็นถึงตัวอย่างนาทีปริมาณการวัดเที่ยงตรงกับความไวลงย่อยระดับเซลล์เดียว . วิธีการเป็นหลอดเดียว ง่าย จบ จุด ( ใช้ความร้อนและ Cyclers มาตรฐาน PCR reagentsการวัดที่ถูกต้องและแม่นยำได้โดยไม่ต้องมีวงจร วงจรความรุนแรงจากการตรวจสอบเวลาจริง หรือทางกายภาพในปฏิกิริยาหลายใด ๆ ( เช่น ดิจิตอล PCR ) เพิ่มเติม เนื่องจากโมเลกุล mRNA ทั้งหมดจะถูกเข้ารหัสด้วยบาร์โค้ดโมเลกุลขยายที่สามารถใช้ในการสร้างวัสดุสำหรับการวัดและเทคนิคหลายแบบสามารถดําเนินการได้ในจำนวนจำกัด วิธีการที่เป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับปริมาณตัวอย่างขนาดเล็ก เช่น การทดลองเซลล์เดียว . การเข้ารหัสของโทรศัพท์มือถือเนื้อหาดิจิตอลรักษาจริงมากมายระดับและเอาชนะการแนะนำโดยขยาย .