cleaning. Genomic DNA was extracted

cleaning. Genomic DNA was extracted using phenol
extraction and ethanol precipitation (Bucklin 2000).
To amplify the mitochondrial COI gene, the universal
primers, LCO 1490 and HCO2198 (Folmer et al. 1994)
were used. PCR reactions had a total volume of 25 μl
and were performed according to Ivanova et al. (2009)
using Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as
the enzyme. The PCR conditions were 94°C for 2 min
as initial denaturation and 40 cycles of 94°C for 40s,
55°C for 40s, and 72°C for 1 min. DNA sequencing
was done by direct sequencing of PCR amplification
products, carried out in a 3130xl Genetic Analyzer
automated DNA sequencer, following the manufacturer's
instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). The sequences were obtained bi-directionally two
times for accurate reading.
The O. longicaudis COI was aligned in MEGA 6 (Tamura
et al. 2013) with other COI sequences that show high
sequence similarity using the BLAST tool at Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). The Kimura 2-
parameter (K2P) distance model (Kimura 1980) was used
to calculate sequence divergences. Neighbor-joining (NJ)
trees using the K2P method were generated by MEGA 6
(Tamura et al. 2013) facilities. Nonparametric bootstrapping
was performed using 1,000 replicates.
Results
Life cycle
The mean duration of embryonic development was
2.3 days, and the time of post-embryonic development
was 5.2 days for O. longicaudis. Throughout the life
cycle of the species, a mean of 12 broods per female
and 22 eggs female−1 were produced and the fecundity
rate was 2 eggs female−1 brood−1. The mean longevity
was 47 days, and maximum longevity was 58 days
(Table 1).
Figure 2 shows mean individual growth curve of the
species as a function of time (days). The neonate of
O. longicaudis had an average size of 504 μm and
reached maturity with approximately 655 μm. On
average, two juvenile instars and nine instars were recorded
throughout the life cycle of the species.
DNA barcode
The sequence region of the COI gene (barcode region)
was 658 bp in length and was deposited as accession
number JX501501 in the Genbank. The base composition
for O. longicaudis COI sequence was as follows:
T = 41.33%, C = 13.82%, A = 23.1%, and G = 21.73%.
The calculated A-T content was 64.4 %.
A genetic divergence from other O. longicaudis from
the GenBank was found ranging from 7.0% to 7.2%
(Table 2). With other Chydoridae species including
Oxyurella sp., Kauralona penuelasi, Alona sp., and
Alona setulosa, the genetic divergence ranged from
16.8% to 20.1%.
The NJ tree with 14 COI analyzed sequences shows
O. longicaudis from Brazil as closely related to seven
other O. longicaudis from Mexico (100% bootstrap
support) (Figure 3). For Oxyurella sp., a bootstrap
support of 86% was found with all O. longicaudis and,
Alona sp., and A. setulosa were separated as another clade
(Figure 3).

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทําความสะอาด จีโนมดีเอ็นเอโดยใช้ฟีนอลการสกัดและการตกตะกอนของเอทานอล ( บักลิน 2000 )การขยายยีนไมโตคอนเดรีย ลำปาง , สากลไพรเมอร์ , และว่า hco2198 1490 ( โฟลเมอร์ et al . 1994 )สถิติที่ใช้ ปฏิกิริยา PCR มีปริมาณรวม 25 μ lและมีการปฏิบัติตาม วาโนว่า et al . ( 2009 )การใช้แพลทินัม ทัค ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) เป็นเอนไซม์ เงื่อนไขทั้งหมดจะถูก 94 ° C เป็นเวลา 2 นาทีเป็นครั้งแรก ( และ 40 รอบ 94 ° C 40s ,55 องศา C 40 , และ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที ดีเอ็นเอทำได้โดยการเพิ่มจำนวนของเชื้อโดยตรงผลิตภัณฑ์ที่ทำใน 3130xl วิเคราะห์พันธุกรรมลำดับของดีเอ็นเอโดยอัตโนมัติต่อไปนี้ของผู้ผลิตคําแนะนํา ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) ผู้ที่ได้รับ directionally สองบีเวลาสำหรับการอ่านที่ถูกต้องo . longicaudis ผมก็ชิดในเมกะ 6 ( ทามูระet al . 2013 ) กับอื่น ๆให้คงลำดับสูงความเหมือนของลำดับการใช้ระเบิดที่พบเครื่องมือ( http : / / www.ncbi . nlm . NIH . gov / บริการ / ) พวกคิมูระ 2พารามิเตอร์ ( k2p ) แบบระยะไกล ( คิมูระ 1980 ) ถูกใช้คำนวณลำดับ divergences . เพื่อนบ้านที่เข้าร่วม ( NJ )ต้นไม้ที่ใช้ k2p วิธีสร้าง 6 เมก( ทามูระ et al . 2013 ) สิ่งอำนวยความสะดวก นอนพาราเมตริก bootstrappingการใช้ 1 , 000 ได้แก่ผลลัพธ์วัฏจักรชีวิตหมายถึงระยะเวลาของการพัฒนาตัวอ่อนคือ2.3 วันและเวลาของการพัฒนาตัวอ่อน โพสต์คือ 5.2 วัน โอ longicaudis . ตลอด ชีวิตวัฏจักรของพืช หมายถึง 12 กก ต่อหญิง22 − 1 ) และไข่ของผู้หญิงและการผลิตคะแนนเป็นไข่ 2 ฟองหญิง− 1 กก− 1 หมายถึงอายุยืนเป็น 47 วันและอายุการใช้งานสูงสุด 58 วัน( ตารางที่ 1 )รูปที่ 2 แสดงหมายถึงเส้นโค้งการเจริญเติบโตส่วนบุคคลของชนิดที่เป็นฟังก์ชันของเวลา ( วัน ) ข้าราชการของโอ longicaudis มีขนาดเฉลี่ยของ 504 μ Mถึงวุฒิภาวะที่มีประมาณ 655 μเมตรบนเฉลี่ย สองเด็กและวัยที่ถูกบันทึกไว้โดยเก้าตลอดวัฏจักรชีวิตของชนิดบาร์โค้ดดีเอ็นเอรหัสภูมิภาคของลำปาง ( เขตบาร์โค้ด ) ยีนคือเจ้า BP ในความยาวและฝากเป็นสูหมายเลข jx501501 ในขนาด . พื้นฐานองค์ประกอบสำหรับผม . longicaudis ลำดับได้ดังนี้T = 41.33 เปอร์เซ็นต์ C = 4.41 % = 23.1 % และ G = 22.01 %ค่า a-t เนื้อหา 64.4 %ทางพันธุกรรมอื่น ๆจากความแตกต่างจาก longicaudis Oขนาดมีตั้งแต่ 7.0 , 7.2 %( ตารางที่ 2 ) กับชนิด chydoridae อื่นๆ รวมทั้งoxyurella sp . , kauralona penuelasi ลนา sp . , และลนา setulosa , ความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างร้อยละ 16.8 ถึง 20.1 %NJ ต้นไม้ 14 ผมวิเคราะห์ลำดับแสดงโอ longicaudis จากบราซิล ใกล้ชิดกับเจ็ดอื่น ๆ . longicaudis จากเม็กซิโก ( 100% บูสนับสนุน ) ( รูปที่ 3 ) สำหรับ oxyurella sp . , บูสนับสนุน 86 % พบทั้งหมด . longicaudis และลนา sp . , และ A . setulosa แยกเป็นอีก clade( รูปที่ 3 )