A B S T R A C TEconomical biofuel p

A B S T R A C T
Economical biofuel production from plant biomass requires the conversion of both cellulose and
hemicellulose in the plant cell wall. The best industrial fermentation organism, the yeast Saccharomyces
cerevisiae, has been developed to utilize xylose by heterologously expressing either a xylose reductase/
xylitol dehydrogenase (XR/XDH) pathway or a xylose isomerase (XI) pathway. Although it has been
proposed that the optimal means for fermenting xylose into biofuels would use XI instead of the XR/XDH
pathway, no clear comparison of the best publicly-available yeast strains engineered to use XR/XDH or XI
has been published. We therefore compared two of the best-performing engineered yeast strains in the
public domain—one using the XR/XDH pathway and another using XI—in anaerobic xylose
fermentations. We
find that, regardless of conditions, the strain using XR/XDH has substantially higher
productivity compared to the XI strain. By contrast, the XI strain has better yields in nearly all conditions
tested.

Xylose is the second most abundant sugar next to glucose in
plant cell wall hydrolysates [10]. Therefore, efficient and rapid
utilization of xylose along with glucose is essential for economic
and sustainable production of fuels and chemicals from lignocellulosic
biomass [16]. Although Saccharomyces cerevisiae has been
exclusively used for producing bioethanol, this yeast cannot
ferment xylose. In order to confer xylose-fermenting capabilities
into S. cerevisiae, two metabolic pathways from other micro-
organisms have been introduced [4,18]. An oxidoreductase
pathway consisting of xylose reductase (XR) and xylitol dehydro-
genase (XDH) [10,17], produces reduced byproducts such as xylitol
and glycerol during anaerobic xylose fermentation, likely due to
the difference in cofactor specificities of XR and XDH [2,10]. XR uses
NADPH, whereas XDH uses NAD+. Therefore, xylose fermentation
facilitated by the XR/XDH pathway under anaerobic conditions canlead to surplus NADH production [2,17], eliciting the production of
glycerol and xylitol. As a solution of the redox imbalance problem,
the second pathway involving xylose isomerase (XI) pathway was
proposed [19]. Several XIs from anaerobic fungi and bacteria have
been identified that are functionally expressed in S. cerevisiae,
allowing construction of xylose-fermenting S. cerevisiae using the
XI pathway [1,3,14,11].
In addition to the introduction and functional expression of two
different metabolic pathways for xylose consumption (XR/XDH
and XI), rational and evolutionary metabolic engineering strategies
have been used to construct efficient xylose-fermenting S.
cerevisiae strains [5,7,11,12]. An outstanding question in the
field
is whether one pathway or the other would be preferred for largescale
fermentation [18]. However, there has not been a direct
comparison of the best performing strains with each pathway
available in the public domain. Such a comparison would benefit
future efforts to develop bioethanol production from lignocellulosic
biomass.
Combined rational and evolutionary engineering efforts have
led to the generation of strains SR8 [7] and SXA-R2P-E [12], two of
the best-performing strains reported to utilize XR/XDH and XI
pathway, respectively. SR8 contains two or more chromosomalcopies of Scheffersomyces stipitis XYL1 (XR), XYL2 (XDH) and XYL3
(xylulokinase, XK) each with optimized expression, along with
deletion of acetaldehyde dehydrogenase, ALD6. It was evolved on
xylose in the laboratory, which resulted in the loss of phosphatase
Pho13 function. It was subsequently made auxotrophic for uracil
(ura3-52) for additional engineering (SR8u) [7]. SXA-R2P-E, also
evolved on xylose, has two copies of Piromyces sp. xylA3* (an
improved XI mutant), S. stipitis TAL1 (transaldolase) integrated,
native XKS1 (XK) overexpressed, and GRE3 (aldose reductase) and
PHO13 deleted [12]. It has been recently reported that PHO13
deletion leads to up-regulation of the pentose phosphate genes
including TAL1 [8].
The xylose fermentation performance of the two strains, SR8u
and SXA-R2P-E, was compared in various anaerobic batch culture
conditions (Table 1). Over a range of cell loadings (5–20 Optical
Density (OD) at 600 nm), strain SR8u expressing XR/XDH always
displayed higher rates of ethanol production when compared to
strain SXA-R2P-E expressing XI (Fig. 1A). This result was also true
for seed cultures prepared from mid-log cultures (Fig. 1B) and for
fermentation carried out in both optimized Minimal Medium
(oMM) and YSC media, which was used to evolve strain SXA-R2P-E
(Fig. 2). While xylose consumption and ethanol production rates
were higher in strain SR8u expressing the XR/XDH pathway, strain
SXA-R2P-E had slightly higher ethanol yields and produced less
xylitol as a byproduct (Table 1). Overall, strain SR8u showed 16–
104% higher productivities (g ethanol/OD
h) and 5–19% lower
yields (g ethanol/g xylose

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แบบ B T R S C Tผลิตการประหยัดเชื้อเพลิงชีวภาพจากชีวมวลของพืชต้องการแปลงทั้งเซลลูโลส และhemicellulose ในผนังเซลล์ของพืช ชีวิตอุตสาหกรรมการหมักที่ดีที่สุด ยีสต์ Saccharomycescerevisiae ได้รับการพัฒนาใช้สาร โดย heterologously แสดง reductase สารตัวใด /ไซลิทอล dehydrogenase (XR XDH) เดินหรือทางเดิน isomerase (XI) สาร แม้ว่าจะได้รับเสนอว่า วิธีที่เหมาะสมสำหรับการหมักสารในเชื้อเพลิงชีวภาพจะใช้ XI แทน XR/XDHเดิน เปรียบเทียบสายพันธุ์ที่ดีที่สุดเผยแพร่ยีสต์เพื่อใช้ XR/XDH หรือ XI ไม่ชัดเจนมีการเผย เราจึงเปรียบเทียบสองสายพันธุ์ยีสต์ที่ได้ประสิทธิภาพดีที่สุดในการโดเมนสาธารณะ — ใช้หนึ่งเดิน XR/XDH และอื่นใช้ XI — ในสารที่ไม่ใช้ออกซิเจนจากการหมักแหนม เราพบว่า โดยไม่คำนึงถึงเงื่อนไข สายพันธุ์ที่ใช้ XR/XDH มีมากขึ้นประสิทธิภาพเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ XI โดยคมชัด ความเครียด XI มีอัตราผลตอบแทนที่ดีกว่าในเกือบทุกสภาวะทดสอบสารที่เป็นน้ำตาลสองมากสุดถัดจากกลูโคสในพืชผนังเซลล์ hydrolysates [10] ดังนั้น อย่างรวดเร็ว และมีประสิทธิภาพการใช้ประโยชน์ของสารพร้อมกลูโคสมีความสำคัญทางเศรษฐกิจและยั่งยืนผลิตเชื้อเพลิงและสารเคมี lignocellulosicชีวมวล [16] แม้ว่า Saccharomyces cerevisiae ได้รับใช้เฉพาะการผลิต bioethanol ยีสต์นี้ไม่หมักสาร เพื่อที่จะมอบความสามารถในการหมักสารใน S. cerevisiae สองทางที่เผาผลาญจากไมโครอื่น ๆ -สิ่งมีชีวิตมีการแนะนำ [4,18] เป็น oxidoreductaseเดินสาร reductase (XR) และไซลิทอล dehydro-genase (XDH) [10,17], ก่อให้เกิดผลพลอยได้เศษลดลงเช่นไซลิทอลและกลีเซอรอลระหว่างการหมักสารที่ไม่ใช้ออกซิเจน แนวโน้มการความแตกต่างในทำจำเพาะของ XR และ XDH [2,10] ใช้ XRNADPH ขณะที่ XDH ใช้ NAD + ดังนั้น สารหมักโดยเดิน XR/XDH ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน canlead NADH ผลิตส่วนเกิน [2,17], eliciting การผลิตกลีเซอรอลและไซลิทอล เป็นการแก้ปัญหาความไม่สมดุลอกซ์มีทางเดินสองทาง isomerase (XI) สารที่เกี่ยวข้องกับนำเสนอ [19] มีหลาย XIs จากแบคทีเรียและเชื้อราที่ไม่ใช้ออกซิเจนการระบุฟังก์ชันที่จะแสดงใน S. cerevisiaeช่วยให้โครงสร้างของการหมักสาร S. cerevisiae ใช้การเดิน XI [1,3,14,11]นอกเหนือจากการแนะนำและแสดงทำงานของสองทางเดินเผาผลาญแตกต่างกันสำหรับปริมาณการใช้สาร (XR/XDHและ XI), มีเหตุผล และวิวัฒนาการเผาผลาญวิศวกรรมกลยุทธ์ใช้สร้าง S. หมักสารมีประสิทธิภาพcerevisiae สายพันธุ์ที่ [5,7,11,12] คำถามที่โดดเด่นในการฟิลด์ไม่ว่าทางหนึ่งหรืออื่น ๆ จะต้องการสำหรับ largescaleหมัก [18] อย่างไรก็ตาม ไม่มีโดยตรงการเปรียบเทียบดีที่สุดที่ทำสายพันธุ์ ด้วยละมีอยู่ในโดเมนสาธารณะ การเปรียบเทียบจะได้รับประโยชน์ในอนาคตพยายามพัฒนาผลิต bioethanol จาก lignocellulosicชีวมวลมีความพยายามวิศวกรรมเหตุผล และวิวัฒนาการเป็นรวมการสร้างสายพันธุ์ SR8 [7] และ SXA R2P-E [12], สองสายพันธุ์ดีที่สุดทำรายงานใช้ XR/XDH และ XIเดิน ตามลำดับ SR8 ประกอบด้วยสองราย หรือมากกว่า chromosomalcopies ของ stipitis Scheffersomyces XYL1 (XR), XYL2 (XDH) และ XYL3(xylulokinase, XK) ด้วยเหมาะนิพจน์ ตามด้วยลบของ acetaldehyde dehydrogenase, ALD6 มันถูกพัฒนามาบนสารในห้องปฏิบัติการ ซึ่งผลในการสูญเสียของฟอสฟาเตสฟังก์ชัน Pho13 มันถูกทำมา auxotrophic สำหรับ uracil(ura3-52) สำหรับวิศวกรรมเพิ่มเติม (SR8u) [7] SXA R2P E ยังพัฒนาสาร มีสองสำเนา Piromyces เอสพี xylA3 * (การกลายพันธุ์ XI ที่ปรับปรุงใหม่), S. stipitis TAL1 (transaldolase) รวมเจ้า XKS1 (XK) overexpressed และการ GRE3 (aldose reductase) และPHO13 ลบ [12] มีล่าสุดรายงานว่า PHO13การลบที่นำไปสู่กฎระเบียบขึ้นของยีน pentose ฟอสเฟตรวม TAL1 [8]การหมักสารสองสายพันธุ์ SR8uSXA R2P E ถูกเปรียบเทียบในหลายชุดที่ใช้วัฒนธรรมเงื่อนไข (ตารางที่ 1) ในช่วงของเซลล์รับน้ำหนัก (ออปติคัล 5 – 20ความหนาแน่น (OD) ที่ 600 nm), สายพันธุ์ SR8u แสดง XR/XDH เสมอแสดงอัตราการเพิ่มขึ้นของการผลิตเอทานอลเมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ SXA R2P E แสดง XI (รูปที่ 1A) ผลลัพธ์นี้เป็นจริงเมล็ดวัฒนธรรม จากวัฒนธรรมล็อกกลาง (รูปที่ 1B) และสำหรับดำเนินการทั้งในการหมักเหมาะปานกลางน้อยที่สุด(โอมม์) และ สื่อ YSC ซึ่งใช้ในการพัฒนาสายพันธุ์ SXA R2P E(2 รูป) ในขณะที่ราคาผลิตเอทานอลและปริมาณการใช้สารสูงขึ้นในสายพันธุ์ SR8u แสดงทางเดิน XR/XDH พันธุ์SXA R2P E มีผลผลิตเอทานอลที่สูงขึ้นเล็กน้อย และผลิตน้อยกว่าไซลิทอลเป็น (ตาราง 1) โดยรวม สายพันธุ์พบว่า 16-SR8uลดสูงกว่า 104% (จีเอทานอ ล/OD h) และ 5 – 19% ต่ำผลผลิต (สารเอทานอ ล/g g

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

B S T R A C Tการผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพจากชีวมวลพืช ราคาประหยัด ต้องแปลงทั้งเซลลูโลสเฮมิเซลลูโลสในพืช ผนังเซลล์ สิ่งมีชีวิตอุตสาหกรรมการหมักยีสต์ Saccharomyces ที่ดีที่สุดโดยได้พัฒนาจากไซโลสโดย heterologously แสดงทั้งเทส / ไซโลสไซลิทอลดีไฮโดรจีเนส ( 9000 / xdh ) ทางเดินหรือไซโลส ไอโซเมอเรส ( Xi ) เส้นทาง แม้ว่ามันจะถูกเสนอว่า วิธีการที่เหมาะสมสำหรับการหมักทำให้เชื้อเพลิงชีวภาพจะใช้สีแทนของ 9000 / xdhทางเดิน , การล้างที่ดีที่สุดที่มีอยู่ทั่วไปสายพันธุ์ยีสต์ที่ออกแบบมาเพื่อใช้ 9000 / xdh หรือซีที่ได้รับการตีพิมพ์ เราจึงเปรียบเทียบสองของการแสดงที่ดีที่สุดออกแบบยีสต์สายพันธุ์ในสาธารณะโดเมนหนึ่งใช้ 9000 / xdh เส้นทางอื่นที่ใช้ถังไซโลส และ ซีfermentations . เราพบว่า ไม่ว่าสภาพความเครียดใช้ 9000 / xdh ได้สูงขึ้นอย่างมากผลผลิตเมื่อเทียบกับ ซีเครียด โดยคมชัด , ซีเครียดได้ผลผลิตดีกว่าในสภาพเกือบทั้งหมดทดสอบไซโลส คือ วินาทีที่ชุกชุมมากที่สุดน้ำตาลกลูโคสในต่อไปผนังเซลล์ของพืช [ 10 ] ดังนั้น , ที่มีประสิทธิภาพและรวดเร็วการใช้เอนไซม์พร้อมกับกลูโคสเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับเศรษฐกิจและการผลิตอย่างยั่งยืนของเชื้อเพลิงและสารเคมีจาก lignocellulosicชีวมวล [ 16 ] แม้ว่า Saccharomyces cerevisiae ที่ได้รับโดยเฉพาะใช้สำหรับการผลิตเอทานอล ยีสต์นี้ไม่สามารถการหมักน้ำตาลไซโลส . เพื่อให้เอนไซม์ที่หมักไว้ ความสามารถใน S . cerevisiae สองเส้นทางการเผาผลาญจากไมโคร - อื่น ๆสิ่งมีชีวิตที่ได้รับการแนะนำ [ 4,18 ] เป็นอ ซิโดรีดักเทสเส้นทาง ประกอบด้วย ไซโลส รีดักเตส ( 9000 ) และไซลิทอล dehydro -genase ( xdh ) [ 10,17 ] ผลิตสารไซลิทอลลดลง เช่นและกลีเซอรอล ระหว่างการหมักถังไซโล โอกาส เนื่องจากความแตกต่างในโคแฟกเตอร์ - และ 2,10 xdh [ 9000 ] 9000 ใช้nadph ในขณะที่ xdh ใช้ NAD + ดังนั้น การหมักน้ำตาลไซโลสสนับสนุนโดย 9000 / xdh ทางเดินภายใต้เงื่อนไขการใช้ canlead NADH การผลิตส่วนเกิน [ 2,17 ] , eliciting การผลิตกลีเซอรอลและไซลิทอล . เป็นโซลูชันของไฟฟ้าไม่สมดุล ปัญหาสองเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ไอโซเมอเรส ( Xi ) เส้นทาง คือเสนอ [ 19 ] จากเชื้อราและแบคทีเรียหลายซิสแบบมีถูกระบุว่าเป็นหน้าที่แสดงใน S . cerevisiae ,อนุญาตให้สร้างไซโลหมักเชื้อ S . cerevisiae โดยใช้11 . [ 1,3,14,11 ]นอกจากการแนะนำการทำงานของทั้งสองและแสดงออกเส้นทางการเผาผลาญอาหารที่แตกต่างกันสำหรับการบริโภคน้ำตาลไซโลส ( 9000 / xdhและ Xi ) มีเหตุผลและกลยุทธ์การปรับปรุงวิวัฒนาการจะถูกใช้เพื่อสร้างประสิทธิภาพการย่อยหมัก .S . cerevisiae สายพันธุ์ [ 5,7,11,12 ] เป็นคำถามที่โดดเด่นในฟิลด์คือว่าทางหนึ่งหรืออื่น ๆ จะต้องให้มากกว่ากระบวนการหมัก [ 18 ] อย่างไรก็ตาม ไม่มีตรงการเปรียบเทียบสายพันธุ์ที่ดีที่สุดในการแสดงกับแต่ละ .ใช้ได้ในโดเมนสาธารณะ เช่นการเปรียบเทียบจะได้รับประโยชน์ความพยายามในอนาคตที่จะพัฒนาการผลิตเอทานอลจาก lignocellulosicชีวมวลรวมเหตุผลและวิวัฒนาการด้านวิศวกรรมมีความพยายามนำไปสู่การสร้างสายพันธุ์ sr8 [ 7 ] และ sxa-r2p-e [ 12 ] , สองมีประสิทธิภาพมากที่สุดสายพันธุ์รายงานใช้ 9000 / xdh และซีเส้นทาง ตามลำดับ sr8 ประกอบด้วยสองคนหรือมากกว่า chromosomalcopies ของ scheffersomyces stipitis xyl1 ( 9000 ) xyl2 ( xdh ) และ xyl3( xylulokinase XK , ) แต่ละปรับสีหน้าพร้อมกับการลบของอะเซทัลดีไฮด์ดีไฮโดรจีเนส ald6 . มันถูกพัฒนาบนไซโลส ในห้องปฏิบัติการ ซึ่งส่งผลให้เกิดการสูญเสียของฟอสฟาเทสpho13 ฟังก์ชัน ต่อมาได้ auxotrophic สำหรับ Name( ura3-52 ) สำหรับวิศวกรรมเพิ่มเติม ( sr8u ) [ 7 ] sxa-r2p-e , ยังวิวัฒนาการในไซโลส มี 2 เล่ม xyla3 * ( piromyces sp .การปรับปรุง Xi mutant ) , S . stipitis tal1 ( transaldolase ) รวมพื้นเมือง xks1 ( XK ) กับ และ gre3 ( อัตราผลตอบแทน ) และpho13 ลบ [ 12 ] มันได้รับรายงานว่า pho13 เมื่อเร็วๆ นี้การลบนำไปสู่ขึ้นการควบคุมของเพนโทสฟอสเฟต ยีนรวม tal1 [ 8 ]ที่หมักไซโลส ประสิทธิภาพของ sr8u สองสายพันธุ์sxa-r2p-e และถูกเปรียบเทียบในชุดต่าง ๆ ไร้วัฒนธรรมเงื่อนไข ( ตารางที่ 1 ) ช่วงเซลล์กระทำ ( 5 – 20 แสงความหนาแน่น ( OD ) ที่ 600 nm ) , สายพันธุ์ sr8u แสดง 9000 / xdh เสมอแสดงอัตราที่สูงขึ้นของการผลิตเอทานอล เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ sxa-r2p-e แสดงซี ( รูปที่ 1A ) ผลที่ได้นี้ก็จริงเมล็ดพันธุ์ที่เตรียมจากวัฒนธรรมวัฒนธรรม mid log ( รูปที่ 1A ) และการหมักทำทั้งในอาหารที่เหมาะสมน้อยที่สุด( omm ) และ ysc สื่อที่ใช้พัฒนา sxa-r2p-e เมื่อย( รูปที่ 2 ) ในขณะที่การบริโภคน้ำตาลไซโลส และอัตราการผลิตเอทานอลสูงกว่าในสายพันธุ์ sr8u แสดง 9000 / xdh ทางเดิน , เมื่อยsxa-r2p-e ได้ผลผลิตเอทานอลสูงขึ้นเล็กน้อย และผลิตน้อยไซลิทอลเป็นผลพลอยได้ ( ตารางที่ 1 ) รวม sr8u พบ 16 –ความเครียด104 % ผลิตภาพสูงกว่า ( กรัมเอทานอล / odh ) และ 5 ) 19 % กว่าผลผลิตเอทานอล ( G / g ไซโลส