2.5.2. Polymerase chain reaction (R

2.5.2. Polymerase chain reaction (RT-PCR)
The genome of PMTV consists of three ssRNA species and
the coat protein gene is located on RNA 3 (Kashiwazaki et al.,
1995). Olignucleotides primers were designed to amplify the coat
protein gene, with additional (underlined) nucleotides to create
a BamHI site. Primer 1 (downstream) had the sequence: 5
-
CGGGATCCTATGCACCAGCCCAGCGT-3 complementary to residues
801 to 819 of PMTV (isolate T) RNA 3, and primer 2 (upstream) had
the sequence: 5
-TCGGATCCTCTCGGATACCACCCTT-3 identical to
residues 268–284 of PMTV (isolate T) RNA 3. The oligonucleotides
were synthesized on an Applied BioSystems, Model 391 PCRmate
DNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The
primers were expected to amplify a band of 566 bp corresponding
to the PMTV coat protein gene with additional BamHI sites (Arif
et al., 1994).The PCR mixture (50 l) contained one micro liter each of downsteam
and upstream primers, 2 l of a 2 mm solution of each of
the four dNTPs, 1.5 l of 50 mM MgCl2, 10 l 10 × PCR buffer, 1 l
(5 units) Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI, USA) and
28 l water. The mixture was subjected to 40 cycles of heating
and cooling in PTC-200 Thermal Cycler (M J Research, Watertown,
MA, USA). Each cycle consisted of 1.5 min at 94 ◦C for denaturation,
1.5 min at 54 ◦C for primer annealing, and 2.5 min at 72 ◦C
for primer extension, followed by a 10 min final extension at 72 ◦C.
The PCR products (10 l) were electrophoreses in 1% agrose gels
in Tris-borate-EDTA buffer containing 0.5 l/ml ethidium bromide.
Molecular size markers (Promega, Madison, WI, USA) were used as
control. The specific bands were visualized under UV light using
Quantity One for Windows (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,
USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5.2 การพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (RT-PCR)ประกอบด้วยกลุ่มของ PMTV พันธุ์ ssRNA สาม และเสื้อยีนที่อยู่บนอาร์เอ็นเอ 3 (Kashiwazaki et al.,1995) มีการออกแบบไพรเมอร์ Olignucleotides ขยายเสื้อยีน กับนิวคลีโอไทด์ (ขีดเส้นใต้) เพิ่มเติมเพื่อสร้างเว็บไซต์ BamHI สีรองพื้น 1 (น้ำ) มีลำดับที่: 5-เสริมการตก CGGGATCCTATGCACCAGCCCAGCGT-3มี 801 กับ 819 PMTV (แยก T) อาร์เอ็นเอ 3 และรองพื้น 2 (ต้นน้ำ)ลำดับที่: 5-TCGGATCCTCTCGGATACCACCCTT-3 เหมือนกับตก 268-284 ของ PMTV (แยก T) อาร์เอ็นเอ 3 Oligonucleotidesถูกสังเคราะห์ในการใช้ BioSystems รุ่น 391 PCRmateสังเคราะห์เสียงดีเอ็นเอ (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA, USA) ที่ไพรเมอร์คาดว่าจะขยายวงของ bp ที่ตรง 566การยีนโปรตีนตรา PMTV ไซต์ BamHI เพิ่มเติม (Arifร้อยเอ็ด al., 1994) ส่วนผสม PCR (50 ลิตร) อยู่หนึ่งไมโครลิตรละของ downsteamและไพร เมอร์ขั้นต้นน้ำ ปัญหา 2 มม.แต่ละ 2 ลิตรdNTPs สี่ 1.5 l 50 มม. MgCl2, 10 l 10 × PCR บัฟเฟอร์ 1 l(หน่วยที่ 5) Taq DNA พอลิเมอเรส (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) และน้ำ 28 l ส่วนผสมถูกยัดเยียดให้ 40 วงจรการทำความร้อนและระบายความร้อนในอาคารผู้โดยสาร 200 Cycler ร้อน (วิจัย J M, WatertownMA, USA) รอบแต่ละรอบประกอบด้วย 1.5 นาทีที่ 94 ◦C สำหรับ denaturation1.5 นาทีที่ 54 ◦C สำหรับการอบเหนียวสีรองพื้น และ 2.5 นาทีที่ 72 ◦Cสำหรับขยายพื้น ตาม ด้วยนามสกุลเป็นครั้งสุดท้าย 10 นาทีที่ 72 ◦Cผลิตภัณฑ์ PCR (10 ลิตร) ได้ electrophoreses ในเจ agrose 1%ในทริสเรทติ้ง borate EDTA บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยโบรไมด์ ethidium 0.5 l/mlใช้เป็นเครื่องหมายขนาดโมเลกุล (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา)ควบคุม วงเฉพาะมี visualized ภายใต้ UV แสงโดยใช้ปริมาณหนึ่งสำหรับ Windows (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส CAสหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5.2 ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (RT-PCR)
จีโนมของ PMTV ประกอบด้วยสามชนิด ssRNA
และยีนโปรตีนหุ้มตั้งอยู่ในอาร์เอ็นเอ3 (Kashiwazaki et al.,
1995) ไพรเมอร์ Olignucleotides
ถูกออกแบบมาเพื่อขยายเสื้อยีนโปรตีนที่มีเพิ่มเติม(ขีดเส้นใต้)
นิวคลีโอในการสร้างเว็บไซต์BamHI ไพรเมอร์ที่ 1 (ต่อเนื่อง) มีลำดับ: 5?
-
CGGGATCCTATGCACCAGCCCAGCGT-3? ประกอบกับตกค้าง
801-819 ของ PMTV (แยก T) อาร์เอ็นเอ 3 และไพรเมอร์ 2 (ต้นน้ำ)
มีลำดับ: 5
-TCGGATCCTCTCGGATACCACCCTT-3? เหมือนกับตกค้าง 268-284 ของ PMTV (แยก T) อาร์เอ็นเอ 3. oligonucleotides ถูกสังเคราะห์บนแอพพลายด์รุ่น 391 PCRmate สังเคราะห์ดีเอ็นเอ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ที่คาดว่าจะขยายวงของ 566 bp ที่สอดคล้องกับโปรตีนPMTV เสื้อยีนกับเว็บไซต์ BamHI เพิ่มเติม (Arif et al., 1994) ส่วนผสม PCR ได้โดยเริ่มต้น (50 ลิตร) ที่มีขนาดเล็กหนึ่งลิตรแต่ละ downsteam และไพรเมอร์ต้นน้ำ 2 ลิตรของการแก้ปัญหามม 2 ของแต่ละสี่dNTPs 1.5 ลิตร 50 มิลลิ MgCl2, 10 ลิตร 10 ×บัฟเฟอร์ PCR, 1 ลิตร(5 หน่วย) โพลิเมอร์ Taq DNA (Promega เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) และ28 ลิตรน้ำ ส่วนผสมที่ถูกยัดเยียดให้ 40 รอบของเครื่องทำความร้อนและความเย็นในPTC-200 Thermal Cycler (MJ วิจัยทาวน์MA, USA) แต่ละรอบประกอบด้วย 1.5 นาทีที่ 94 ◦Cสำหรับ denaturation, 1.5 นาทีที่ 54 ◦Cสำหรับการหลอมไพรเมอร์และ 2.5 นาทีที่ 72 ◦Cสำหรับการขยายไพรเมอร์ตามด้วย10 นาทีสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 ◦C. ผลิตภัณฑ์ PCR ( 10 ลิตร) เป็น electrophoreses ใน 1% เจล agrose ในบัฟเฟอร์ Tris-borate-EDTA มี 0.5 ลิตร / ml ethidium bromide. เครื่องหมายโมเลกุลขนาด (Promega เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้เป็นระบบควบคุม วงดนตรีที่เฉพาะเจาะจงได้รับการมองเห็นภายใต้แสงยูวีโดยใช้จำนวนหนึ่งสำหรับ Windows (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว, CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

งานวาง . ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ( RT-PCR )
จีโนมของ pmtv ประกอบด้วยสามชนิด ssrna
โปรตีนหุ้มอนุภาคตั้งอยู่บนอาร์เอ็นเอ ( กาชิวาซากิ et al . ,
1995 ) olignucleotides ไพรเมอร์ถูกออกแบบมาเพื่อขยายเสื้อ
โปรตีนยีน กับเพิ่มเติม ( ขีดเส้นใต้ ) นิวคลีโอไทด์สร้าง BamHI
เป็นเว็บไซต์ ไพรเมอร์ 1 ( ปลายน้ำ ) มีลำดับ 5 
-
cgggatcctatgcaccagcccagcgt-3  คู่ตกค้าง
801 ถึงคุณของ pmtv ( แยก RNA primer 3 t ) และ 2 ( upstream )
ลำดับ 5 
- tcggatcctctcggataccaccctt-3 เหมือนกัน

 ตกค้าง 268 – 284 ของ pmtv ( แยกประเภท ) 3 . ส่วนโอลิโกนิวคลีโอไทด์
สังเคราะห์ใน Applied Biosystems รุ่นผม pcrmate
ดีเอ็นเอสังเคราะห์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา
โดยคาดว่าจะขยายเป็นวง จำนวน 566 BP ที่สอดคล้องกัน
ไป pmtv โปรตีนหุ้มอนุภาค BamHI กับเว็บไซต์อื่นๆ ( Arif
et al . , 1994 ) . เพิ่มส่วนผสม ( 50 ลิตร ) ที่มีอยู่ 1 ไมโครลิตรละ downsteam
และ primers ต้นน้ำ 2 ล. 2 มิลลิเมตร โซลูชั่นของแต่ละ
สี่ dntps 1.5 ลิตร 10 ลิตร 10 ชุด 50 มม. กันชน PCR × 1
( 5 หน่วย ) ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( promega เมดิสัน , WI , USA ) และ
28 ลิตรน้ำ ผสมภายใต้ 40 รอบ ของความร้อนและเย็นใน ptc-200 Thermal cycler
( M J การวิจัย Watertown ,
MA , USA ) แต่ละรอบ จำนวน 1.5 นาทีที่ 94 ◦ C (
, 1.5 นาทีที่ 54 ◦ C สำหรับรองพื้น annealing และ 2.5 นาทีที่ 72 ◦ C
สำหรับไพรเมอร์ ส่วนขยายตามด้วย 10 นาทีสุดท้ายของนามสกุลที่ 72 ◦ C .
ผลิตภัณฑ์ PCR ( 10 ลิตร ) electrophoreses 1% agrose เจล
ในบริษัทบอเรตบัฟเฟอร์ที่มี EDTA 0.5 ลิตร / ml ทิเดียมโบรไมด์ .
เครื่องหมายขนาดโมเลกุล ( promega เมดิสัน , WI , USA ) ถูกใช้เป็น
ควบคุม วงดนตรีที่เฉพาะเจาะจงได้มองเห็นแสงยูวีโดยใช้
ปริมาณหนึ่งสำหรับ Windows ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA , USA

)