used as a selective agent in geneti

used as a selective agent in genetic transformation. To confirm the strain
identification, we reexamined the classification of C. vulgaris CBS 15-
2075 used in this study based on the analysis of internal transcribed
spacer (ITS) sequence of nuclear ribosomal DNA (data not shown). Phylogenetic
relationship showed that the ITS sequence of our strain was
closely clustered with that of C. vulgaris (Fig. 6). On this basis, it is of interest
to note that the antibiotic resistance of C. vulgaris maybe strainspecific,
which can probably be attributed to variations between cell
lines.
Our results indicated that G418 was a potent selection agent able to
completely block the cell growth of C. vulgaris CBS 15-2075 at a concentration
of 30 μg/mL. The inhibitory effect of G418 on cell growth has also
been demonstrated in other Chlorella strains including Chlorella
ellipsoidea [42,43], C. sp. [44], and C. sorokiniana [37]. It is worth noting
that the selection concentration of G418 in these studies varies greatly
from as low as 30 μg/mL to as high as 1 mg/mL, indicating the considerable
difference in antibiotic sensitivity across Chlorella strains. Intriguingly,
we found that G418 at a low concentration of 2.5 μg/mL in
liquid culture promoted the growth of C. vulgaris unexpectedly
(Fig. 2a). This growth-promoting effect might be attributed to the positive
reallocation of the metabolic flux in C. vulgaris cells in response to
the reduced protein synthesis caused by G418. The E. coli derived nptII
gene encodes a neomycin phosphotransferase that confers resistance
to G418 [45] and has been used as a dominant selectable marker for
yeast [46], plant [47], and some microalgae [48]. This selectable marker
gene also worked well for C. vulgaris in our study.
PEG-mediated gene delivery method has proven effective in bacteria
and yeast [49], plant [50] and even some microalgal species [27,28,41]
due to its distinct advantages, such as no requirement for specialized
equipment, simple manipulation, less damage to host cells, and better
reproducibility [31,32]. By using PEG-mediated method, a transformation
efficiency of 356 ± 30 cfu per μg of DNA was obtained in this
study. Although this transformation efficiency is relatively low compared
with those ever reported in other Chlorella species (in the range
of 560–2250 cfu per μg DNA) [25,28,37,41,51], it is acceptable for future
genetic engineering studies for strain improvement. We found that the
use of carrier DNA could increase the transformation efficiency considerably
(data not shown), consistent with the previous report [46]. We
also noticed that the addition of 0.05 M glucose in the selective agar medium
resulted in a significant increase in the transformation efficiency
(~20%), possibly due to the fact that the mixotrophic culture condition
may provide more carbon and energy sources and enhance the survival
rate of positive transformants under selection pressure. It is also possible,
of course, that the presence of glucose may attenuate the inhibitory
effect of G418 on the algal cells, leading to more survival colonies and
thus a ‘false’ increase in the transformation efficiency.
EGFP exhibits much higher fluorescence intensity than wild-type
GFP and has been widely used as a fluorescent reporter in various biological
systems [52]. Our study, for the first time, demonstrated the stable
expression of EGFP, which was driven by CaMV35S promoter, and its
visual detection in live transformed C. vulgaris cells. To expand the applications
of reporter system in C. vulgaris, future research may lie in
the exploration of fluorescent proteins with different spectral palette,
which has been achieved in the model alga Chlamydomonas reinhardtii
[53,54]. To this end, full genome sequencing of C. vulgaris has been completed
and global transcriptome analysis is underway by individual research
groups, which will facilitate to a great extent the development
of more versatile genetic toolbox and reporter system.
In conclusion, we for the first time developed a stable nuclear transformation
method and a feasible fluorescent reporter system for
C. vulgaris, an industrially important microalga with great potential for
CO2 biomitigation, which on the one hand provides a solid foundation
for the future rational genetic manipulation for strain improvement
such as CO2 fixation capacity, and on the other hand will allow great applications
in cell biology for protein subcellular localization by EGFP
fusion

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ใช้เป็นตัวแทนเลือกในการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม เพื่อยืนยันสายพันธุ์ประจำตัวเราซักค้านการจำแนกประเภทของซีบีเอสซี vulgaris 15 2075 มาใช้ในการศึกษาครั้งนี้อยู่บนพื้นฐานของการวิเคราะห์คัดลอกภายในspacer (ITS) ลำดับของดีเอ็นเอนิวเคลียร์โซมอล (ไม่ได้แสดงข้อมูล) วิวัฒนาการความสัมพันธ์พบว่าลำดับของสายพันธุ์ของเราคลัสเตอร์อย่างใกล้ชิดกับที่ซีขิง(รูปที่. 6) บนพื้นฐานนี้ก็เป็นที่น่าสนใจที่จะทราบว่าต้านทานยาปฏิชีวนะซี vulgaris strainspecific บางทีที่อาจจะสามารถนำมาประกอบกับรูปแบบระหว่างเซลล์เส้น. ผลของเราแสดงให้เห็นว่า G418 เป็นตัวแทนเลือกที่มีศักยภาพสามารถที่จะสมบูรณ์ป้องกันการเติบโตของเซลล์ของ ซีบีเอสซี vulgaris 15-2075 ที่ความเข้มข้น 30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ผลของการยับยั้งการเจริญเติบโต G418 มือถือยังได้รับการแสดงให้เห็นในสายพันธุ์Chlorella อื่น ๆ รวมทั้ง Chlorella ellipsoidea [42,43] เอสพีซี [44] และซี sorokiniana [37] เป็นมูลค่า noting ว่ามีความเข้มข้นของการเลือก G418 ในการศึกษาเหล่านี้แตกต่างกันมากจากที่ต่ำเป็น30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรจะสูงถึง 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรแสดงมากความแตกต่างในความไวยาปฏิชีวนะข้ามสายพันธุ์Chlorella น่าดูที่เราพบ G418 ว่าในความเข้มข้นต่ำ 2.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในวัฒนธรรมที่มีสภาพคล่องการส่งเสริมการเจริญเติบโตของซีvulgaris โดยไม่คาดคิด(รูป. 2a) ผลการเจริญเติบโตของการส่งเสริมนี้อาจนำมาประกอบกับบวกจัดสรรของฟลักซ์การเผาผลาญของเซลล์ใน C. vulgaris ในการตอบสนองต่อการสังเคราะห์โปรตีนที่ลดลงเกิดจากG418 เชื้อ E. coli มา nptII ยีนเข้ารหัส phosphotransferase neomycin ว่าฟาโรห์ต้านทานจะG418 [45] และได้ถูกนำมาใช้เป็นเครื่องหมายเลือกที่โดดเด่นสำหรับยีสต์[46] โรงงาน [47] และสาหร่ายบาง [48] เครื่องหมายนี้เลือกยีนยังทำงานได้ดีสำหรับ vulgaris ซีในการศึกษาของเรา. วิธีการจัดส่งยีน PEG-พึ่งได้พิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพในการแบคทีเรียและยีสต์[49] โรงงาน [50] และแม้กระทั่งบางสายพันธุ์สาหร่าย [27,28,41] เนื่องจากการ ข้อดีที่แตกต่างเช่นความต้องการไม่มีเฉพาะอุปกรณ์, การจัดการง่ายความเสียหายน้อยกว่าเซลล์โฮสต์และดีกว่าการทำสำเนา [31,32] โดยใช้วิธี PEG-พึ่งการเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพของ356 ± 30 cfu ต่อไมโครกรัมของดีเอ็นเอที่ได้รับในการศึกษา แม้ว่าการเปลี่ยนแปลงครั้งนี้มีประสิทธิภาพค่อนข้างต่ำเมื่อเทียบกับผู้ที่เคยรายงานในรูปแบบอื่น ๆ ที่คลอเรลล่า (อยู่ในช่วงของโคโลนีต่อ560-2,250 ไมโครกรัม DNA) [25,28,37,41,51] มันเป็นที่ยอมรับสำหรับอนาคตการศึกษาพันธุวิศวกรรมสำหรับการปรับปรุงพันธุ์ เราพบว่าการใช้ดีเอ็นเอผู้ให้บริการสามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการเปลี่ยนแปลงอย่างมาก(ไม่ได้แสดงข้อมูล) ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ [46] เรายังพบว่าการเพิ่มขึ้นของ 0.05 M กลูโคสในสื่อวุ้นคัดเลือกผลในการเพิ่มขึ้นอย่างมากในประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลง(~ 20%) อาจจะเป็นเพราะความจริงที่ว่าสภาพวัฒนธรรม mixotrophic อาจให้คาร์บอนมากขึ้นและแหล่งพลังงานและเพิ่ม การอยู่รอดอัตราtransformants บวกภายใต้ความกดดันเลือก นอกจากนี้ยังเป็นไปได้แน่นอนว่าการปรากฏตัวของกลูโคสอาจเจือจางยับยั้งผลของG418 ในเซลล์สาหร่ายที่นำไปสู่เพิ่มเติมอาณานิคมอยู่รอดและทำให้'เท็จ' เพิ่มประสิทธิภาพในการเปลี่ยนแปลง. จัดแสดงนิทรรศการ EGFP เรืองแสงความเข้มสูงกว่าป่า ประเภทGFP และได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะนักข่าวเรืองแสงในทางชีวภาพต่างๆระบบ[52] การศึกษาของเราเป็นครั้งแรกที่แสดงให้เห็นถึงเสถียรภาพการแสดงออกของ EGFP ซึ่งถูกผลักดันโดยโปรโมเตอร์ CaMV 35S และของการตรวจสอบภาพในการถ่ายทอดสดการเปลี่ยนซีเซลล์ขิง เพื่อขยายการใช้งานของระบบนักข่าวใน vulgaris ซี, การวิจัยในอนาคตอาจจะอยู่ในการตรวจสอบข้อเท็จจริงของโปรตีนเรืองแสงที่มีจานสีสเปกตรัมที่แตกต่างกันซึ่งได้รับการประสบความสำเร็จในสาหร่ายรูปแบบChlamydomonas reinhardtii [53,54] ด้วยเหตุนี้ลำดับจีโนมเต็มรูปแบบของซี vulgaris เสร็จเรียบร้อยแล้วและการวิเคราะห์ยีนทั่วโลกกำลังอยู่ระหว่างการวิจัยแต่ละกลุ่มซึ่งจะอำนวยความสะดวกในระดับที่ดีการพัฒนาของกล่องเครื่องมือทางพันธุกรรมที่หลากหลายมากขึ้นและระบบการรายงานข่าว. โดยสรุปเราเป็นครั้งแรก เวลาพัฒนาเปลี่ยนแปลงนิวเคลียร์มั่นคงวิธีการและระบบนักข่าวเรืองแสงเป็นไปได้สำหรับซี ขิงเป็นสาหร่ายที่สำคัญในอุตสาหกรรมที่มีศักยภาพที่ดีสำหรับbiomitigation CO2 ซึ่งบนมือข้างหนึ่งให้รากฐานที่มั่นคงสำหรับการจัดการทางพันธุกรรมในอนาคตที่มีเหตุผลในการปรับปรุงสายพันธุ์เช่นความสามารถตรึงCO2 และในทางกลับกันจะช่วยให้การใช้งานที่ดีในทางชีววิทยาเซลล์แปลโปรตีนในเซลล์โดย EGFP ฟิวชั่น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ที่ใช้เป็นตัวแทนที่เลือกในการถ่ายทอดทางพันธุกรรม . เพื่อยืนยันว่าสายพันธุ์
ตัวเราตรวจสอบใหม่ประเภทของ C . vulgaris CBS 15 -
0 ที่ใช้ในการศึกษานี้อยู่บนพื้นฐานของการวิเคราะห์ภายในการทับศัพท์
spacer ( ITS ) ลำดับของดีเอ็นเอนิวเคลียร์ไรโบโซม ( ข้อมูลไม่แสดง ) ความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการพบว่าลำดับของ

ของสายพันธุ์ของเราอย่างใกล้ชิดเป็นกลุ่มที่ Cแบบ ( รูปที่ 6 ) บนพื้นฐานนี้ มันเป็นที่น่าสนใจที่จะทราบว่าต้านทานยาปฏิชีวนะ
C . vulgaris อาจ strainspecific
, ซึ่งจะประกอบกับการเปลี่ยนแปลงระหว่างเซลล์

ผลของเราระบุว่าเส้น g418 คือต้าเลือกตัวแทนได้
ปิดกั้นการเจริญของ C . vulgaris CBS 15-2075 ความเข้มข้น
30 μกรัม / มิลลิลิตรผลยับยั้งของ g418 เซลล์ยังถูกพบในสายพันธุ์อื่น ๆ

ellipsoidea รวมถึงสาหร่าย Chlorella sp . 42,43 [ ] , C . [ 44 ] , และ C sorokiniana [ 37 ] เป็นมูลค่า noting
ที่ความเข้มข้นการเลือก g418 ในการศึกษาเหล่านี้จะแตกต่างกันอย่างมาก
จากที่ต่ำเป็น 30 μ g / ml จะสูงเป็น 1 mg / ml แสดงมาก
ความแตกต่างของยาปฏิชีวนะที่ไวในสาหร่ายสายพันธุ์ ฟังดู
, เราพบว่า g418 ที่ความเข้มข้นต่ำ 2.5 μ g / ml ใน
อาหารเหลวส่งเสริมการเจริญเติบโตของ C แบบไม่คาดคิด
( รูปที่ 2A ) ซึ่งส่งเสริมการเจริญเติบโตของผลอาจจะเกิดจากการจัดสรรบวก
ของการเผาผลาญในเซลล์ในการเพิ่มค่า C .

ลดการสังเคราะห์โปรตีนเกิดจาก g418 . E .โคไลได้ยีน nptii
encodes เป็นมีเดียวิกิ phosphotransferase ที่เกี่ยวข้องกับ g418 ต้านทาน
[ 45 ] และถูกใช้เป็นเครื่องหมายเลือกเด่นสำหรับ
ยีสต์ [ 46 ] [ 47 ] พืชและสาหร่ายขนาดเล็ก [ 48 ] นี้เลือกเครื่องหมาย
ยีนยังทำงานได้ดีสำหรับ C . vulgaris ในการศึกษาของเรา โดยวิธีตรึง
ได้พิสูจน์ประสิทธิภาพในการส่งมอบยีนแบคทีเรีย และยีสต์
[ 49 ]พืช [ 50 ] และแม้กระทั่งบางชนิด 27,28,41 [ สาหร่าย ]
เนื่องจากข้อได้เปรียบที่แตกต่างของมัน เช่น ไม่มีความต้องการพิเศษ
อุปกรณ์ง่ายการจัดการความเสียหายน้อยกว่าการโฮสต์เซลล์และตรวจสอบดีกว่า 31,32 [
] โดยใช้ PEG โดยวิธีการเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพของ±
356 30 CFU ต่อμกรัมของ DNA ได้ในการศึกษานี้

แม้ว่าการเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพต่ำเมื่อเทียบกับที่เคยรายงานใน
สาหร่ายชนิดอื่น ๆ ( ในช่วง
560 – 2 , 250 CFU ต่อμ g DNA ) [ 25,28,37,41,51 ] เป็นที่ยอมรับสำหรับการศึกษาพันธุวิศวกรรมในอนาคต
ปรับปรุงสายพันธุ์ เราพบว่า การใช้พาหะดีเอ็นเอ
สามารถเพิ่มการเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพมาก
( ข้อมูลไม่แสดง ) ,สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ [ 46 ] เรา
ก็สังเกตเห็นว่า นอกจาก 0.05 เมตรกลูโคสในอาหารวุ้น
มีผลในการเพิ่มขึ้นอย่างมากในการเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพ
( ~ 20% ) อาจจะเนื่องจากความจริงที่ว่า mixotrophic วัฒนธรรมสภาพ
อาจให้คาร์บอนและแหล่งพลังงาน และเพิ่มอัตราการอยู่รอด
บวก transformants ภายใต้ความกดดันที่เลือกนอกจากนี้ยังเป็นไปได้
แน่นอน ซึ่งการปรากฏตัวของกลูโคสอาจลดผลการยับยั้งของ g418
ในเซลล์สาหร่าย , ชั้นนำมากกว่าการอยู่รอดอาณานิคมและ
ดังนั้น ' เท็จ ' เพิ่มประสิทธิภาพในการแปลง .
egfp แสดงความเข้มแสงที่สูงกว่าของ
GFP และได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะที่เป็นนักข่าว เรืองแสงในระบบชีวภาพ
ต่างๆ [ 52 ] การศึกษาของเราเป็นครั้งแรกที่แสดงให้เห็นถึงการแสดงออกที่มั่นคง
ของ egfp ซึ่งถูกขับเคลื่อนโดยการ camv35s และตรวจจับอยู่เปลี่ยน C
ภาพแบบเซลล์ เพื่อขยายการใช้งานของระบบข่าว
C . vulgaris , การวิจัยในอนาคตอาจอยู่ในการสำรวจของโปรตีนเรืองแสงด้วย

แตกต่างกันสเปกตรัมสี ซึ่งได้ประสบในรูปแบบสาหร่าย reinhardtii
คลาไมโดโมแนส[ 53,54 ] จบเรื่องนี้ ลำดับจีโนมเต็ม C . vulgaris เรียบร้อยแล้ว
และการวิเคราะห์ทราน ริปโตมทั่วโลกดำเนินการโดยกลุ่มงานวิจัย
บุคคลซึ่งจะอำนวยความสะดวกในขอบเขตที่ดี การพัฒนาของระบบมากขึ้นหลากหลายทางพันธุกรรมนะครับ

และ นักข่าว สรุป เราเป็นครั้งแรกการพัฒนานิวเคลียร์
การมั่นคงวิธีการที่เป็นไปได้ของนักข่าวและเรืองแสงระบบ
C . vulgaris , สาหร่ายทางอุตสาหกรรมที่สำคัญที่มีศักยภาพที่ดีสำหรับ
CO2 biomitigation ซึ่งในมือข้างหนึ่งให้รากฐานสำหรับอนาคต เหตุผลทางพันธุกรรมจัดการ

สำหรับการปรับปรุงสายพันธุ์เช่นความสามารถในการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ และในทางกลับกันจะช่วยให้การใช้งาน
ยอดเยี่ยมชีววิทยาเซลล์โปรตีนตําแหน่งภายในเซลล์จำกัดโดย egfp
ฟิวชั่น