Animals and tissue preparationAll e

Animals and tissue preparation
All experimental procedures involving animals were conducted in accordance with the Guide for Care and Use of Research Animals in Teaching and Research and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Yonsei University. Sexually mature crossbred female gilts (ages between 8 and 12 months) were assigned randomly to either cyclic or pregnant status and hysterectomized on either day (D) 12 of the estrous cycle or D12 and D15 of pregnancy (n = 3 gilts/d/status) after the animals were slaughtered. Pregnancy was confirmed by the presence of apparently normal conceptuses with filamentous morphology in uterine flushings from D12 and D15 of pregnancy. Oocyte collection, in vitro maturation, SCNT procedures and endometrial tissue sampling from gilts carrying embryos derived from SCNT on D12 of pregnancy were done as described previously (Ka et al., 2008; Kim et al., 2009). On D12 of pregnancy, uterine endometrial tissues were obtained from four gilts that carried SCNT-derived conceptuses and three gilts with conceptuses resulting from natural mating. Endometrium samples, dissected free from myometrium, were collected from the middle portion of each uterine horn of each gilt. For RNA extraction, endometrial tissues were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C.
Explant culture
Endometrium was dissected from the myometrium and placed into warm phenol red-free DMEM/F-12 culture medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) containing penicillin G (100 IU/ml) and streptomycin (0.1 mg/ml) as described previously (Ka et al., 2001), with some modifications. The endometrium was minced with scalpel blades into small pieces (2 to 3 mm3), and aliquots of 500 mg were placed into T25 flasks with serum-free modified DMEM/F-12 containing 10 μg/ml insulin (Sigma, catalog no. I5500), 10 ng/ml transferrin (Sigma, catalog no. T1428), and 10 ng/ml hydrocortisone (Sigma, catalog no. H0396). Endometrial explants were cultured immediately after mincing in progesterone (P4; 3 ng/ml; Sigma, catalog no. P0130), P4+ estradiol-17β (E2; 50 ng/ml; Sigma, catalog no. E8875), P4 +E2+ICI182,780 (ICI; an estrogen receptor antagonist; 100 ng/ml; Tocris, Ballwin, MO, USA), or E2+P4+RU486 (a progesterone receptor antagonist; 30 ng/ml; Sigma, catalog no. M8046), for 24 h with rocking in an atmosphere of 5% carbon dioxide in air at 37°C. To determine the effects of cytokines on S100G expression, explant tissues were treated with 0, 1, 10, 100 ng/ml IL1B (catalog number I9401; Sigma) in the presence of both E2 (50 ng/ml) and P4 (3 ng/ml) at 37°C for 24 h. Explant tissues were then harvested and total RNA was extracted for real-time RT-PCR analysis of S100G mRNA levels. These experiments were conducted using endometrium from three individual gilts. Treatments were performed in triplicate on tissues obtained from each gilt.
Total RNA extraction, cloning of porcine S100G and RT-PCR
Total RNA was extracted from endometrial tissues and conceptuses from D12 and 15 of pregnancy using TRIzol reagent (Invitrogen Life Technology, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s recommendations. The quantity of RNA was assessed spectrophotometrically, and the integrity of the RNA was examined by gel electrophoresis using 1% agarose gels.
Two micrograms of total RNA were treated with DNase I (Promega, Madison, WI) and reverse transcribed using SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) to obtain cDNA. The cDNA templates were then diluted 1:4 with sterile water and amplified by PCR using Taq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan) and specific primers (forward, 5′-TCC TGC AGA ACT GAA GAG CA-3′; reverse, 5′-GCA GAG ACA TGG GTG GTT TT-3′)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สัตว์และการเตรียมเนื้อเยื่อกระบวนงานทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ทดลองได้ดำเนินการกับรายการแนะนำสำหรับการดูแลและใช้วิจัยสัตว์เลี้ยงในการสอนและการวิจัย และได้รับอนุมัติจากสถาบันสัตว์ดูแลและใช้คณะกรรมการของมหาวิทยาลัยปฮอส กำหนดสถานะวัฏจักร หรือตั้งครรภ์โดยการสุ่ม และ hysterectomized ในวันใด (D) ของวงจร estrous หรือ D12 และ D15 ของการตั้งครรภ์ทางเพศผู้ใหญ่ผลิตหญิงแม่สุกร (อายุระหว่าง 8 และ 12 เดือน) (n = 3 แม่ สุกร/d/สถานะ) หลังจากที่สัตว์ถูกฆ่า ตั้งครรภ์ได้รับการยืนยัน โดยสถานะของ conceptuses ปกติเห็นได้ชัดว่ามีสัณฐานวิทยา filamentous ใน flushings มดลูกจาก D12 และ D15 ของการตั้งครรภ์ Oocyte คอลเลกชัน การเพาะเลี้ยงพ่อแม่ SCNT กระบวนงาน และสุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อของเยื่อบุโพรงมดลูกจากแม่สุกรกำลังโคลนมา SCNT บน D12 ของการตั้งครรภ์ได้ทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Ka et al., 2008 คิม et al., 2009) บน D12 ของการตั้งครรภ์ เนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกมดลูกได้รับจากแม่สุกร 4 ที่ดำเนินมา SCNT conceptuses และแม่สุกร 3 กับ conceptuses ที่เกิดจากการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ ตัวอย่างของ endometrium, dissected ฟรีจาก myometrium ถูกเก็บรวบรวมจากส่วนกลางของแต่ละเขาละปีกมดลูก สำหรับการสกัดอาร์เอ็นเอ เนื้อเยื่อของเยื่อบุโพรงมดลูกมีสแนปแช่ในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียสExplant วัฒนธรรมEndometrium dissected จาก myometrium และอยู่ในอบอุ่นวางแดงฟรี DMEM/F-12 สื่อวัฒนธรรม (ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ที่มียาเพนนิซิลลิน G (100 IU/ml) และ streptomycin (0.1 mg/ml) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Ka และ al., 2001), มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง Endometrium ถูกสับ ด้วยใบมีด scalpel เป็นชิ้นเล็ก ๆ (2-3 mm3), และ aliquots 500 มิลลิกรัมมีอยู่ในน้ำ T25 กับซีรั่มฟรีแก้ไข DMEM/F-12 ประกอบด้วยอินซูลิน μg/ml 10 (ซิก แค็ตตาล็อกไม่ I5500), 10 ng/ml transferrin (ซิก แค็ตตาล็อกไม่ T1428), และ 10 ng/ml hydrocortisone (ซิก แค็ตตาล็อกไม่ H0396) เยื่อบุโพรงมดลูก explants มีอ่างทันทีหลังจาก mincing ในโปรเจสเตอโร (P4; 3 ng/ml ซิก แค็ตตาล็อกไม่ P0130), P4 + estradiol-17β (E2; 50 ng/ml ซิก แค็ตตาล็อกไม่ E8875), P4 + E2 + ICI182, 780 (เหมา เป็นฮอร์โมนหญิงนิสต์ 100 ng/ml Tocris, Ballwin, MO สหรัฐอเมริกา), หรือ E2 + P4 + RU486 (เป็นโปรเจสเตอโรนิสต์ 30 ng/ml ซิก แค็ตตาล็อกไม่ M8046), ใน 24 ชมกับโยกในบรรยากาศ 5% คาร์บอนไดออกไซด์ในอากาศที่ 37 องศาเซลเซียส เพื่อกำหนดลักษณะพิเศษของ cytokines ในนิพจน์ S100G, explant เนื้อเยื่อได้รับการรักษา ด้วย 0, 1, 10, 100 ng/ml IL1B (หมายเลข I9401 แค็ตตาล็อก ซิก) ในต่อหน้าของ E2 ทั้งสอง (50 ng/ml) และ P4 (3 ng/ml) ที่ 37 ° C ใน 24 h. Explant เนื้อเยื่อได้แล้วเก็บเกี่ยว และอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกวิเคราะห์ RT-PCR แบบเรียลไทม์ของระดับ S100G mRNA ทดลองเหล่านี้ได้ดำเนินการใช้ endometrium จากแม่สุกรแต่ละสาม บำบัดได้ดำเนินการใน triplicate บนเนื้อเยื่อที่ได้รับจากแต่ละปีกรวมสกัดอาร์เอ็นเอ ของช่วง S100G และ RT-PCRอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากเนื้อเยื่อของเยื่อบุโพรงมดลูกและ conceptuses จาก D12 และ 15 ของการตั้งครรภ์ใช้ TRIzol รีเอเจนต์ (Invitrogen ชีวิตเทคโนโลยี คาร์ลส CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีประเมินปริมาณของอาร์เอ็นเอ spectrophotometrically และความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอถูกตรวจสอบ โดยใช้ 1% agarose เจ electrophoresis เจลMicrograms สองของอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้รับการรักษากับผม (Promega เมดิสัน WI) และกลับทับศัพท์โดยใช้ตัวยก II กลับ Transcriptase (Invitrogen) รับ cDNA DNase แบบ cDNA ถูกทำให้เจือจาง 1:4 ใส่น้ำ แล้วขยาย โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์เฉพาะ (ไปข้างหน้า 5′-TCC TGC ตู้ทำเฒ่าปิดปาก CA-3′ กลับ 5′ GCA ปิดปาก ACA TGG GTG GTT TT-3′) และพอลิเมอเรส Taq (Takara ชีวภาพ ชิงะ ญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สัตว์และการเตรียมเนื้อเยื่อ
ทุกขั้นตอนการทดลองที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ที่ถูกดำเนินการตามคู่มือสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ในการวิจัยการเรียนการสอนและการวิจัยและรับรองจากสถาบันการดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการมหาวิทยาลัยยอนเซ ทางเพศสัมพันธ์ผู้ใหญ่ลูกผสมสุกรหญิง (อายุระหว่าง 8 และ 12 เดือน) ถูกสุ่มให้ทั้งสถานะวงจรหรือตั้งครรภ์และมดลูกในวันที่ทั้ง (D) 12 ของวงจรการเป็นสัดหรือ D12 และ D15 ของการตั้งครรภ์ (n = 3 สุกร / d / สถานะ ) หลังจากที่สัตว์ที่ถูกฆ่า การตั้งครรภ์ได้รับการยืนยันโดยการปรากฏตัวของ conceptuses ปกติเห็นได้ชัดกับสัณฐานใยใน flushings มดลูกจาก D12 และ D15 ของการตั้งครรภ์ คอลเลกชันเซลล์ในหลอดทดลองสุกวิธี SCNT และการสุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกจากสุกรแบกตัวอ่อนที่ได้มาจาก SCNT บน D12 ของการตั้งครรภ์ได้ทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (กา et al, 2008;.. คิมและคณะ, 2009) ใน D12 ของการตั้งครรภ์เนื้อเยื่อมดลูกเยื่อบุโพรงมดลูกที่ได้รับจากสี่สุกรที่ดำเนิน conceptuses SCNT มาและสามสุกรกับ conceptuses ที่เกิดจากการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ ตัวอย่างเยื่อบุโพรงมดลูกชำแหละฟรีจาก myometrium ถูกเก็บมาจากส่วนตรงกลางของแต่ละแตรมดลูกของแต่ละทอง สำหรับการสกัด RNA เนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกเป็นสแน็ปแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 ° C.
วัฒนธรรม explant คำ
endometrium ถูกชำแหละจาก myometrium และวางไว้ในที่อบอุ่นฟีนอลสีแดงฟรี DMEM / F-12 กลางวัฒนธรรม (Sigma, เซนต์หลุยส์ , MO, USA) ที่มี penicillin G (100 IU / ml) และ streptomycin (0.1 mg / ml) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (กา et al., 2001) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง เยื่อบุโพรงมดลูกถูกสับด้วยใบมีดมีดผ่าตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ (2-3 mm3) และส่วนลงตัว 500 มกถูกวางลงในขวด T25 ที่มีการปรับเปลี่ยนในซีรั่มฟรี DMEM / F-12 ที่มี 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรอินซูลิน (Sigma, แคตตาล็อกไม่มี. I5500 ), 10 ng / มล transferrin (Sigma, แคตตาล็อกไม่มี. T1428) และ 10 ng / มล hydrocortisone (Sigma, แคตตาล็อกไม่มี. H0396) ชิ้นเยื่อบุโพรงมดลูกที่ถูกเลี้ยงในทันทีหลังจากที่ดัดจริตในกระเทือน (P4 3 ng / ml; Sigma, แคตตาล็อกไม่มี P0130.), P4 + estradiol-17β (E2 50 ng / ml; Sigma, แคตตาล็อกไม่มี E8875.), P4 + E2 + ICI182 , 780 (ICI; ศัตรูรับฮอร์โมน; 100 ng / ml; Tocris, Ballwin, MO, USA) หรือ E2 + P4 + RU486 (ศัตรูกระเทือน 30 ng / ml; Sigma, แคตตาล็อกไม่มี M8046.) สำหรับ 24 ชั่วโมงที่มีการโยกในบรรยากาศของ 5% ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ในอากาศที่อุณหภูมิ 37 ° C การตรวจสอบผลกระทบของ cytokines การแสดงออก S100G เนื้อเยื่อชิ้นได้รับการรักษาด้วย 0, 1, 10, 100 ng / ml IL1B (แค็ตตาล็อกจำนวน I9401; Sigma) ในการปรากฏตัวของทั้งสอง E2 (50 ng / ml) และ P4 (3 เส้นทาง / ml) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เนื้อเยื่อชิ้นเก็บเกี่ยวแล้วและ RNA ทั้งหมดถูกสกัดสำหรับเรียลไทม์วิเคราะห์ RT-PCR ของ S100G ระดับ mRNA การทดลองเหล่านี้ถูกดำเนินการโดยใช้เยื่อบุโพรงมดลูกจากบุคคลสามสุกร รักษาได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าในเนื้อเยื่อที่ได้รับจากแต่ละทอง.
การสกัด RNA รวม, โคลน S100G หมูและ RT-PCR
รวมอาร์เอ็นเอเป็นสารสกัดจากเนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกและ conceptuses จาก D12 และ 15 ของการตั้งครรภ์โดยใช้น้ำยา Trizol (Invitrogen ชีวิตเทคโนโลยีคาร์ลส, แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาณของอาร์เอ็นเอได้รับการประเมิน spectrophotometrically และความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอได้รับการตรวจสอบโดยใช้เจลอิเล็กเจล agarose 1%.
สองไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้รับการรักษาด้วย DNase ฉัน (Promega, Madison, WI) และ Reverse คัดลอกโดยใช้ยกครั้งที่สองกลับ Transcriptase (Invitrogen) เพื่อให้ได้ cDNA cDNA แม่ถูกเจือจางแล้ว 1: 4 ด้วยน้ำหมันและขยายโดยวิธี PCR โดยใช้โพลิเมอร์ Taq (Takara ไบโอชิ, ประเทศญี่ปุ่น) และไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง (ไปข้างหน้า 5'-TCC TGC AGA ACT GAA GAG CA-3 '; ย้อนกลับ 5 '-GCA GAG ACA TGG GTG GTT TT-3')

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเตรียมสัตว์และเนื้อเยื่อทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ทดลอง
ขั้นตอนได้ดำเนินการตามคู่มือสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองในการสอน และการวิจัย และรับรองโดยสถาบันการดูแลสัตว์และคณะกรรมการของมหาวิทยาลัย Yonsei .ผู้ใหญ่เพศลูกผสมโดยหญิง ( อายุระหว่าง 8 ถึง 12 เดือน ) ได้รับมอบหมายให้เป็นแบบสุ่มหรือตั้งครรภ์ สถานะ และ hysterectomized ทั้งวัน ( D ) 12 ของรอบการเป็นสัด หรือ d12 และ d15 ของการตั้งครรภ์ ( n = 3 โดย / D / สถานะ ) เมื่อสัตว์ถูกฆ่าการตั้งครรภ์ที่ได้รับการยืนยันโดยการปรากฏตัวของปกติ apparently เป็น conceptuses กับสัณฐานในมดลูกและ flushings จาก d12 d15 ของการตั้งครรภ์ โอโอไซต์คอลเลกชัน ในหลอดทดลองเป็นขั้นตอน และเยื่อบุโพรงมดลูก scnt ตัวอย่างเนื้อเยื่อจากตัวอ่อนโดยแบกมาจาก scnt บน d12 ของการตั้งครรภ์ ทำไปตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( KA et al . , 2008 ; Kim et al . , 2009 ) ใน d12 ของการตั้งครรภ์เนื้อเยื่อบุมดลูกมดลูกได้จากสี่โดยที่ดำเนินการ scnt ได้มา conceptuses สามโดยมี conceptuses ที่เกิดจากการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ ตัวอย่างฟรีจากมดลูกผ่า , ยม , เก็บจากส่วนกลางของแต่ละเสียงมดลูกของแต่ละทอง . สำหรับการสกัดอาร์เอ็นเอ เนื้อเยื่อบุมดลูกถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวถ่ายเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 80 องศา C .
−วัฒนธรรม คือ ผ่ามดลูก
ต่อจากยมอยู่ในที่อบอุ่นและฟีนอลสีแดงฟรี dmem / f-12 อาหารเลี้ยงเชื้อ ( Sigma , St . Louis , MO , USA ) ประกอบด้วย penicillin G ( 100 IU / ml ) และสเตร็ปโตมัยซิน ( 0.1 mg / ml ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( KA et al . , 2001 ) , มีการปรับเปลี่ยน ที่เยื่อบุมดลูกถูกสับด้วยมีดใบเป็นชิ้นเล็ก ( 2 มม. )เฉยๆของและ 500 มิลลิกรัม อยู่ใน t25 ขวดที่มี serum-free แก้ไข dmem / f-12 บรรจุ 10 μ g / ml อินซูลิน ( Sigma , แคตตาล็อกไม่ i5500 ) 10 ng / ml ทรานสเฟอริน ( Sigma , แคตตาล็อกไม่ t1428 ) , และ 10 ng / ml hydrocortisone ( Sigma , แคตตาล็อกไม่ h0396 ) เยื่อบุโพรงมดลูกเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงทันทีหลังจากดัดจริตในโพรเจสเทอโรน ( P4 3 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ; Sigma , แคตตาล็อกไม่ p0130 ) P4 estradiol-17 บีตา ( E2 ;50 ng / ml ; Sigma , แคตตาล็อกไม่ e8875 ) P4 E2 ici182780 ( ICI ; estrogen receptor antagonist ; 100 ng / ml ; tocris ballwin , โม , USA ) หรือ E2 P4 ru486 ( progesterone receptor antagonist ; 30 ng / ml ; Sigma , แคตตาล็อกไม่ m8046 ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโยก ในบรรยากาศของ 5% คาร์บอนไดออกไซด์ในอากาศที่อุณหภูมิ 37 องศา เพื่อศึกษาผลของไซโตไคน์ในการแสดงออก s100g กระดาษทิชชู่ ทำนองเดียวกับการรักษาด้วย 0 , 110 , 100 ng / ml il1b ( หมายเลขบัญชีรายชื่อ i9401 ; Sigma ) ในการแสดงตนของทั้งสอง E2 ( 50 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ) และ P4 ( 3 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ต่อเนื้อเยื่อจึงเก็บเกี่ยวและอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดสำหรับการวิเคราะห์แบบเรียลไทม์ของ s100g 4 ระดับ การทดลองเหล่านี้มีวัตถุประสงค์การใช้มดลูกจากสามโดยบุคคล การรักษาผู้ป่วยทั้งสามใบต่อเนื้อเยื่อที่ได้จากแต่ละทอง .
การสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมด , โคลนของ s100g สุกรและ RT-PCR
รวมซึ่งสกัดจากเนื้อเยื่อของเยื่อบุโพรงมดลูก และ conceptuses จาก d12 และ 15 ของการตั้งครรภ์โดยใช้ trizol รีเอเจนต์ ( เทคโนโลยี , ชีวิต Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาณ RNA นี้ประเมิน ,และความสมบูรณ์ของ RNA ถูกตรวจสอบโดยวิธีเจลใช้ 1% เจล ( .
2 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้รับการรักษาด้วยการตรวจหา ADNase ผม ( promega เมดิสัน , WI ) และย้อนกลับและใช้ตัวยก 2 reverse transcriptase ( Invitrogen ) เพื่อให้ได้สายพันธุ์ . วิธีเจือจางกับน้ำ 1 : 4 แม่แบบแล้วเป็นหมัน และขยายโดยวิธี PCR โดยใช้แท็กใช้ไบโอชิงะ ( ทาการะ , ,ญี่ปุ่น ) และไพรเมอร์จำเพาะ ( เดินหน้า 5 ’ - ทีซีซี TGC อีกมุขนั้นกลับทำกา ca-3 ; 5 ’ - GCA มุข ACA tgg GTG gtt tt-3 School )