Construction of reporter vectorsTo

Construction of reporter vectors
To distinguish between two strains analyzed for hyphal fusion events, we labeled nuclei in living cells with Xuorescent
proteins. The most prominent and abundant nuclear proteins are the histones, the linker histone (H1) and the core histones (H2A, H2B, H3 and H4). The latter have little sequence similarity with respect to one another; however,each individual histone protein family is highly conserved among diverse phyla (Baxevanis et al. 1995). Genes for fungal histones were recently fused with a gfp gene encoding the green Xuorescent protein to label nuclei in diverse Wlamentous fungi (Freitag et al. 2004; Li et al. 2007; Maruyama et al. 2001; Ramon et al. 2000). In a similar approach, we used the S. macrospora genes for the histone proteins HH2A and HH2B showing 99.1 and 100% amino acid identity, respectively, with their N. crassa counterparts, for the construction of reporter vectors. Instead of gfp that was used for labeling nuclei in N. crassa, Coccidioides posadasii, Aspergillus oryzae and Aspergillus nidulans, we used the ecfp and eyfp genes for vector construction. Both genes encode the cyan and yellow Xuorescent proteins and were recently shown to be suitable reporters in Wlamentous fungi (HoV and Kück 2005).
In this study, we generated the two reporter vectors pCH2B and pYH2A encoding HH2B or HH2A with C-terminal ECFP and EYFP fusion, respectively (ESM S1). Both chimeric genes are under constitutive control of the gpd promoter and the trpC terminator from A. nidulans. For selection of transgenic strains, both plasmids carry the hph gene encoding hygromycin B phosphotransferase leading to hygromycin B-resistant transformants. After transformation of the S.macrospora wild type with the reporter vectors pCH2B or pYH2A, the corresponding strains, wt [pCH2B] and wt [pYH2A], exhibit cyan and yellow Xuorescent nuclei, respectively, indicating that both chimeric genes are functional in S. macrospora. Note that no cross talk was observed between both Xuorescent markers, a requirement for our experiments. Another aspect that was considered is the eVect of overexpression of chimeric histone genes on fungal physiology. Testing the growth velocity of the transgenic strains we observed that hyphal growth is accelerated in both strains compared to the wild type recipient. Beside that, sexual development of the recombinant strains is not impaired (data not shown). This seems to be diVerent from other systems in which recombinant histones were overproduced (Meeks-Wagner and Hartwell 1986).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สร้างเวกเตอร์โปรแกรมรายงานแยกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ที่สองวิเคราะห์สำหรับเหตุการณ์ hyphal ฟิวชั่น เราชื่อแอลฟาเซลล์นั่งเล่นกับ Xuorescentโปรตีน โปรตีนนิวเคลียร์มาก และโดดเด่นที่สุดคือ histones ฮิสโตนตัวเชื่อมโยงข้อมูล (H1) และ histones หลัก (H2A, H2B, H3 และ H4) หลังมีน้อยลำดับคล้ายกับกัน อย่างไรก็ตาม แต่ละครอบครัวโปรตีนฮิสโตนแต่ละเป็นสูงอยู่ระหว่าง phyla หลากหลาย (Baxevanis et al. 1995) ยีนในเชื้อรา histones เพิ่งถูก fused กับยีน gfp ที่เข้ารหัสโปรตีน Xuorescent สีเขียวกับป้ายชื่อแอลฟาในเชื้อรา Wlamentous หลากหลาย (อย่างไร Freitag et al. 2004 Li et al. 2007 มารุยามะ et al. 2001 Ramon et al. 2000) ในวิธีการคล้ายกัน เราใช้ยีน macrospora S. หาตัวฮิสโตนโปรตีน HH2A และ HH2B แสดง 99.1 และ 100% กรดอะมิโน ตามลำดับ กับคู่ของพวกเขา crassa ตอนเหนือ สร้างเวกเตอร์โปรแกรมรายงาน แทน gfp ที่ใช้สำหรับติดฉลากแอลฟาในตอนเหนือ crassa, Coccidioides posadasii, Aspergillus แห้งระดับต่าง ๆ และ Aspergillus nidulans เราใช้ยีน ecfp และ eyfp สำหรับการก่อสร้างเวกเตอร์ ยีนทั้งสองเข้าฟ้า และเหลืองโปรตีน Xuorescent และล่าสุดได้แสดงให้ ผู้สื่อข่าวเหมาะในเชื้อรา Wlamentous (HoV และ Kück 2005)ในการศึกษานี้ เราสร้างโปรแกรมรายงานสองเวกเตอร์ pCH2B และ pYH2A เข้ารหัส HH2B หรือ HH2A กับ ECFP C-เทอร์มินัลและ EYFP หลอม ตามลำดับ (ESM S1) ทั้ง chimeric ยีนมีการควบคุมขึ้นโปรโมเตอร์ gpd และเทอร์มิเนเตอร์ trpC จาก A. nidulans สำหรับการเลือกสายพันธุ์ถั่วเหลือง plasmids ทั้งมียีน hph ที่เข้ารหัสไป B ทน hygromycin transformants phosphotransferase hygromycin B หลังจากการเปลี่ยนแปลงของชนิดป่า S.macrospora pCH2B เวกเตอร์โปรแกรมรายงานหรือ pYH2A ตรงสายพันธุ์ wt [pCH2B] และ [pYH2A], wt แสดงสี และสีเหลืองแอลฟา Xuorescent ตามลำดับ ระบุว่า ยีน chimeric ทั้งทำงานใน S. macrospora หมายเหตุว่า คุยข้ามกันไม่ถูกตรวจสอบระหว่างทั้งสองเครื่องหมาย Xuorescent ความต้องการสำหรับการทดลองของเรา ด้านที่ถูกถือว่าเป็น eVect ของ overexpression ของฮิสโตน chimeric ยีนในเชื้อราสรีรวิทยา เราทดสอบความเร็วของการเจริญเติบโตของสายพันธุ์ถั่วเหลืองพบว่า เติบโต hyphal เร่งในทั้งสองสายพันธุ์เปรียบเทียบกับป่าชนิดผู้รับ ข้างที่ พัฒนาสายพันธุ์ recombinant ทางเพศไม่ได้พิการ (ข้อมูลไม่แสดง) นี้ดูเหมือนจะ diVerent จากระบบอื่นที่ recombinant histones ได้ overproduced (Meeks วากเนอร์และ Hartwell 1986)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ก่อสร้างของเวกเตอร์นักข่าว
เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างสองสายพันธุ์วิเคราะห์ฟิวชั่นสำหรับการจัดกิจกรรม hyphal เราติดป้ายนิวเคลียสในเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ Xuorescent
โปรตีน โปรตีนนิวเคลียร์ที่โดดเด่นที่สุดและอุดมสมบูรณ์มี histones, ลิงเกอร์สโตน (H1) และ histones หลัก (H2A, H2B, H3 และ H4) หลังมีความคล้ายคลึงกันลำดับเล็ก ๆ น้อย ๆ ที่เกี่ยวกับอีกคนหนึ่ง แต่ครอบครัวของโปรตีนฮีสโตนแต่ละคนเป็นป่าสงวนอย่างมากในหมู่ phyla หลากหลาย (Baxevanis et al. 1995) ยีนสำหรับ histones เชื้อราถูกหลอมละลายเร็ว ๆ นี้กับยีน GFP เข้ารหัสโปรตีน Xuorescent สีเขียวป้ายนิวเคลียสในเชื้อรา Wlamentous หลากหลาย (Freitag et al, 2004;. Li et al, 2007;. Maruyama et al, 2001;.. รามอน et al, 2000) ในวิธีการที่คล้ายเราใช้ยีนเอส macrospora สำหรับโปรตีนฮีสโตน HH2A และ HH2B แสดง 99.1 และ 100% ตัวตนของกรดอะมิโนตามลำดับโดยมี N. crassa คู่ของพวกเขาสำหรับการก่อสร้างของเวกเตอร์นักข่าว แทนที่จะ GFP ที่ใช้สำหรับการติดฉลากในนิวเคลียส N. crassa, Coccidioides posadasii, Aspergillus oryzae และ nidulans Aspergillus เราใช้ ecfp และยีน eyfp สำหรับการก่อสร้างเวกเตอร์ ยีนทั้งสองเข้ารหัสฟ้าและโปรตีน Xuorescent สีเหลืองและมีการแสดงเมื่อเร็ว ๆ นี้ที่จะเป็นนักข่าวที่เหมาะสมในเชื้อรา Wlamentous (HOV และ Kuck 2005).
ในการศึกษาครั้งนี้เราสร้างสองนักข่าว pCH2B เวกเตอร์และการเข้ารหัส pYH2A HH2B หรือ HH2A กับ ECFP C-terminal และ ฟิวชั่น EYFP ตามลำดับ (ESM S1) ทั้งสองยีนลูกผสมที่อยู่ภายใต้การควบคุมของผู้ก่อการส่วนประกอบ gpd และเทอร์มิ trpC จาก nidulans เอ สำหรับการเลือกสายพันธุ์พันธุ์, พลาสมิดทั้งดำเนินยีน HPH ไฮโกรไม B phosphotransferase นำไปสู่ไฮโกรไม transformants B-ทน หลังจากที่การเปลี่ยนแปลงของป่าประเภท S.macrospora กับนักข่าวเวกเตอร์ pCH2B หรือ pYH2A สายพันธุ์ที่สอดคล้องกันน้ำหนัก [pCH2B] และน้ำหนัก [pYH2A] แสดงสีฟ้าและสีเหลืองนิวเคลียส Xuorescent ตามลำดับแสดงให้เห็นว่ายีนลูกผสมทั้งมีการทำงานในเอส macrospora โปรดทราบว่าไม่มีการพูดคุยข้ามสังเกตเห็นระหว่างเครื่องหมาย Xuorescent ทั้งความต้องการสำหรับการทดลองของเรา ด้านที่ได้รับการพิจารณาอีกประการหนึ่งคือการ eVect แสดงออกของยีนสโตนลูกผสมสรีรวิทยาของเชื้อรา การทดสอบความเร็วในการเจริญเติบโตของสายพันธุ์พันธุ์ที่เราตั้งข้อสังเกตว่าการเจริญเติบโต hyphal จะเร่งในสายพันธุ์ทั้งเมื่อเทียบกับผู้รับป่าประเภท นอกจากนั้นการพัฒนาสายพันธุ์ทางเพศของ recombinant ไม่ได้ด้อยค่า (ไม่ได้แสดงข้อมูล) นี้ดูเหมือนว่าจะ diVerent จากระบบอื่น ๆ ที่ histones recombinant ถูก overproduced (คส์-แว็กเนอร์และฮาร์ตเวลส์ 1986)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การก่อสร้างเวกเตอร์นักข่าว
เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างสองสายพันธุ์ที่วิเคราะห์เหตุการณ์ฟิวชั่นลดลง เราติดป้ายว่านิวเคลียสในเซลล์ที่มีชีวิต มีโปรตีน xuorescent

ที่โดดเด่นที่สุดและอุดมสมบูรณ์นิวเคลียร์โปรตีนฮิสโตนเป็น , สนามกอล์ฟหมอกแดด ( H1 ) และแกนฮิสโตน ( h2a และ h2b , H3 , H4 ) หลังมีความเหมือนของลำดับเล็กน้อยด้วยความเคารพซึ่งกันและกัน อย่างไรก็ตามแต่ละครอบครัวของโปรตีนฮิสโตนที่มีการอนุรักษ์หลากหลายไฟลัม ( baxevanis et al . 1995 ) ยีนสำหรับเชื้อราฮิสโตนเป็นเมื่อเร็ว ๆนี้ผสมกับยีน GFP โปรตีนที่ xuorescent สีเขียวป้ายนิวเคลียสในรา wlamentous หลากหลาย ( ฟรายเทิ่ก et al . 2004 ; Li et al . 2007 ; มารุยาม่า et al . 2001 ราโมน et al . 2000 ) ในแนวทางที่คล้ายกัน เราใช้ Smacrospora ยีนสำหรับโปรตีนฮิสโตน hh2a และ hh2b แสดง 97.2 และ 100% ตามลำดับ กรดอะมิโน เอกลักษณ์ ของพวกเขา . crassa counterparts , การก่อสร้างเวกเตอร์นักข่าว แทนของ GFP ที่ใช้สำหรับการติดฉลากนิวเคลียส และ crassa สมการสมมูล posadasii , , และ เชื้อ Aspergillus oryzae nidulans เราใช้ ecfp eyfp ยีนและการก่อสร้างเวกเตอร์ทั้งยีนและโปรตีน xuorescent เข้ารหัสสีฟ้าสีเหลืองและเมื่อเร็ว ๆนี้แสดงเป็นนักข่าวที่เหมาะสมใน wlamentous เชื้อรา ( Hov และ K ü CK 2005 ) .
ในการศึกษานี้จึงได้สร้างขึ้นสองนักข่าวเวกเตอร์ pch2b pyh2a การเข้ารหัสและ hh2b หรือ hh2a กับ ecfp และฟิวชั่น ซึ่ง eyfp ตามลำดับ ( ESM S1 )ทั้งสองที่ยีนอยู่ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์และ GPD และ trpc คนเหล็กจาก nidulans . เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์พันธุกรรมทั้งพลาสมิดพก hph ยีนยีนต้านยา hygromycin B phosphotransferase นำยีนต้านยา hygromycin b-resistant transformants . หลังจากการเปลี่ยนแปลงของ s.macrospora ป่าประเภทที่มีเวกเตอร์นักข่าว pch2b หรือ pyh2a สายพันธุ์ ที่สอดคล้องกันWT [ pch2b ] และ WT [ pyh2a ] แสดงสีฟ้าและนิวเคลียส xuorescent สีเหลืองตามลำดับ แสดงให้เห็นว่าทั้งสองที่ยีนจะทำหน้าที่ในสหรัฐอเมริกา macrospora . หมายเหตุว่า ไม่มีครอสพูดพบว่าระหว่างทั้งสอง xuorescent เครื่องหมาย ความต้องการสำหรับการทดลองของเรา ในอีกแง่มุมหนึ่ง ที่ถือว่าเป็น evect ของ overexpression ของยีนที่ช่วยต่อสรีรวิทยาของเชื้อราการทดสอบการเจริญเติบโตความเร็วของสายพันธุ์ พันธุ์ที่เราพบว่าอัตราเร่งลดลงในทั้งสองสายพันธุ์เมื่อเทียบกับผู้รับประเภทป่า นอกจากนั้น การพัฒนาทางเพศของสายพันธุ์เซลล์ไม่บกพร่อง ( ข้อมูลไม่แสดง ) นี้ดูเหมือนว่าจะ diverent จากระบบอื่น ๆที่ถูกผลิตมากเกินไปโปรตีนฮิสโตน ( มีค วากเนอร์ และ Hartwell 1986 )