Extraction of DNA, RNA, and protein

Extraction of DNA, RNA, and protein is the basic method used in molecular biology. These biomolecules can be isolated from any biological material for subsequent downstream processes, analytical, or preparative purposes. In the past, the process of extraction and purification of nucleic acids used to be complicated, time-consuming, labor-intensive, and limited in terms of overall throughput. Currently, there are many specialized methods that can be used to extract pure biomolecules, such as solution-based and column-based protocols. Manual method has certainly come a long way over time with various commercial offerings which included complete kits containing most of the components needed to isolate nucleic acid, but most of them require repeated centrifugation steps, followed by removal of supernatants depending on the type of specimen and additional mechanical treatment. Automated systems designed for medium-to-large laboratories have grown in demand over recent years. It is an alternative to labor-intensive manual methods. The technology should allow a high throughput of samples; the yield, purity, reproducibility, and scalability of the biomolecules as well as the speed, accuracy, and reliability of the assay should be maximal, while minimizing the risk of cross-contamination.

1. Introduction of Biomolecules Extraction

The extraction of biomolecules, DNA, RNA, and protein, is the most crucial method used in molecular biology [1]. It is the starting point for downstream processes and product development including diagnostic kits. DNA, RNA, and protein can be isolated from any biological material such as living or conserved tissues, cells, virus particles, or other samples for analytical or preparative purposes [1].

Two categories that involved in purifying DNA include the isolation of recombinant DNA constructs such as plasmids or bacteriophage and the isolation of chromosomal or genomic DNA from prokaryotic or eukaryotic organisms [2]. Generally, successful nucleic acid purification required four important steps: effective disruption of cells or tissue; denaturation of nucleoprotein complexes; inactivation of nucleases, for example, RNase for RNA extraction and DNase for DNA extraction; away from contamination [2]. The target nucleic acid should be free of contaminants including protein, carbohydrate, lipids, or other nucleic acid, for example, DNA free of RNA or RNA free of DNA [3]. Quality and also integrity of the isolated nucleic acid will directly affect the results of all succeeding scientific research [4].

On the other hand, RNA is an unstable molecule and has a very short half-life once extracted from the cell or tissues [5]. There are several types of naturally occurring RNA including ribosomal RNA (rRNA) (80%–90%), messenger RNA (mRNA) (2.5%–5%) and transfer RNA (tRNA) [3]. Special care and precautions are required for RNA isolation as it is susceptible to degradation [3, 6]. RNA is especially unstable due to the ubiquitous presence of RNases which are enzymes present in blood, all tissues, as well as most bacteria and fungi in the environment [3, 5]. Strong denaturants has always been used in intact RNA isolation to inhibit endogenous RNases [2]. RNA extraction relies on good laboratory technique and RNase-free technique. RNAse is heat-stable and refolds following heat denaturation. They are difficult to inactivate as they do not require cofactors [2]. The most common isolation methods can be divided into two classes: utilization of 4 M guanidinium thiocyanate and utilization of phenol and SDS [2].

Purification of protein is one of the most important parts in protein research to understand their function, as they may partly or completely be involved in any DNA synthesis activity. Protein purification is required to determine its unique characteristics, including size, charge, shape, and function [7]. Cell-based extraction is the starting step for almost all protein purification. Protein can be extracted by a few methods such as detergent lysis, shearing force, treatment with low ionic salt (salting out), and rapid changes in pressure, which aimed to weaken and break the membranes surrounding the cell to allow proteins to escape [7]. Some factors should be considered when handling proteins. Normally, protein extraction is performed at a very low temperature () as proteins are easily denatured once they are released from the cells. Buffer condition is one of the major factors that need to be considered. Specific buffer conditions are recommended to be maintained because of the sensitivity of proteins toward environmental pH changes [4]. The purity of water will affect the yield of end products as unpurified water contains a lot of microorganisms or proteases that will result in protein degradation [4]. Protein inhibitor, which may exist in solution or buffers, causes the hydrolyzation of proteins. Detergent, another significant factor that cannot be neglected in purification of protein, consists of a hydrophobic portion of a linear or branched hydrocarbon “tail” and a hydrophilic “head” [4]. They solubilize the membrane protein and are amphiphatic molecules which form micelles with the hydrophilic head of proteins [4]. Reducing agents will be added into solution or buffer for protein extraction and purification to avoid the lost of activity of proteins or enzymes which is caused by oxidization. Storage of proteins is important as the half-life of protein is commonly dependent on the storage temperature [4].

The purification of protein requires specific assay. A quick and easy assay method must be known for protein purification so that a known molecular weight, specific affinity, or immunoaffinity of nonenzymatic protein of interest can be detected using appropriate method [7]. There are several methods commonly used in protein purification. They are ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography and gel electrophoresis [4].

2. History

2.1. Nucleic Acid Extraction

The very first DNA isolation was done by a Swiss physician, Friedrich Miescher in 1869 [8]. He hoped to solve the fundamental principles of life, to determine the chemical composition of cells. He tried to isolate cells from lymph nodes for his experiment but the purity of lymphocytes was hard and impossible to be obtained in sufficient quantities. Therefore, he switched to leucocytes, where he obtained them from the pus on collected surgical bandages.

Initially, Miescher focused on the various type of protein that make up the leukocytes and showed that proteins were the main components of the cell’s cytoplasm. During his tests, he noticed that a substance precipitated from the solution when acid was added and dissolved again when alkali was added. This was, for the first time he had obtained a crude precipitate of DNA.

To separate DNA from the proteins in his cell extracts, Miescher developed new protocol to separate the cells’ nuclei from cytoplasm and then isolated DNA. However, his first protocol failed to yield enough material to continue with further analysis. He had to develop a second protocol to obtain larger quantities of purified nuclein, which had been named as ‘nucleic acid’ later by his student, Richard Altman [8].

2.2. Protein Extraction

In the eighteenth century, proteins were known as a distinct class of biological molecules by Antoine Fourcroy and others. They distinguished this molecule by its ability to coagulate under treatment with heat or acid. However, the first description of protein was carried out by Gerhardus Johannes Mulder, a Dutch chemist, in 1893 [9]. His studies on the composition of animal substances, mainly fibrin, albumin, and gelatin, showed the presence of carbon, hydrogen, oxygen, and nitrogen [9]. Furthermore, he recognized that sulfur and phosphorus were present sometimes in animal substances that consisted large number of atoms and he established that these “substances” were macromolecules [9].

Most of the early studies focused on proteins that could be purified in large quantities. For example, blood, egg white and various toxins. Most of the proteins are hard to purify in more than milligram quantities even with today’s highly advanced methods. A majority of techniques for protein purification were developed in a project led by Edwin Joseph Cohn, a protein scientist, during World War II. He was responsible for purifying blood and worked out the techniques for isolating the serum albumin fraction of blood plasma, which is important in maintaining the osmotic pressure in the blood vessels, which help keep soldier alive [10].

3. Current Tendency

After the fated event where Miescher managed to obtain DNA from cell, many others have followed suit which lead to further advancement in the DNA isolation and purification protocol. The initial routine laboratory procedures for DNA extraction were developed from density gradient centrifugation strategies. Meselson and Stahl used this method in 1958 to demonstrate semiconservative replication of DNA [3]. Later procedures made use of the differences in solubility of large chromosomal DNA, plasmids, and proteins in alkaline buffer [3].

Currently, there are many specialized method of extracting out pure DNA, RNA, or protein. Generally, they are divided into solution-based or column-based protocols. Most of these protocols have been developed into commercial kits that ease the biomolecules extraction processes.

3.1. Type of Nucleic Acid Extraction

3.1.1. Conventional Method

Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction
Salt is the common impurity in nucleic acid samples. It has always been required to be removed from nucleic acid samples before any downstream processes and analysis can be done. Therefore, single or multiple separation and/or purification steps are needed to desalt the sample comprising the nucleic acid [11]. The general steps of nucleic acid purification include cell lysis, which

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีนเป็นวิธีการขั้นพื้นฐานที่ใช้ในอณูชีววิทยา สารชีวโมเลกุลเหล่านี้สามารถแยกออกจากวัสดุชีวภาพใด ๆ สำหรับกระบวนการปลายน้ำตามมาวิเคราะห์หรือการเตรียม ในอดีตที่ผ่านกระบวนการของการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกที่ใช้ในการมีความซับซ้อนใช้เวลานานแรงงานมากและมีข้อ จำกัด ในแง่ของการส่งผ่านข้อมูลโดยรวม ปัจจุบันมีวิธีการพิเศษมากมายที่สามารถนำมาใช้ในการสกัดสารชีวโมเลกุลที่บริสุทธิ์เช่นโซลูชั่นและโปรโตคอลที่ใช้คอลัมน์ วิธีการด้วยตนเองได้อย่างแน่นอนวิธีมานานช่วงเวลาที่มีการให้บริการในเชิงพาณิชย์ต่างๆซึ่งรวมถึงชุดสมบูรณ์ที่ประกอบด้วยส่วนขององค์ประกอบที่จำเป็นในการแยกกรดนิวคลีอิก แต่ส่วนใหญ่ของพวกเขาต้องทำตามขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงซ้ำตามด้วยการกำจัดของ supernatants ขึ้นอยู่กับชนิดของชิ้นงานและ รักษาเครื่องจักรกลเพิ่มเติม ระบบอัตโนมัติได้รับการออกแบบสำหรับห้องปฏิบัติการขนาดกลางถึงใหญ่มีการเติบโตในความต้องการในช่วงหลายปีที่ผ่านมา มันเป็นทางเลือกให้กับวิธีการใช้แรงงานเข้มข้น เทคโนโลยีควรอนุญาตให้มีการส่งผ่านสูงของกลุ่มตัวอย่าง; ผลผลิตที่ได้มีความบริสุทธิ์, การทำสำเนาและขยายขีดความสามารถของสารชีวโมเลกุลเช่นเดียวกับความเร็วความถูกต้องและความน่าเชื่อถือของการทดสอบควรจะสูงสุดในขณะที่ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน. 1 บทนำของชีวโมเลกุลสกัดสกัดของสารชีวโมเลกุลดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีนเป็นวิธีที่สำคัญที่สุดที่ใช้ในอณูชีววิทยา [1] มันเป็นจุดเริ่มต้นของกระบวนการที่ต่อเนื่องและการพัฒนาผลิตภัณฑ์รวมถึงชุดตรวจวินิจฉัย ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีนที่สามารถแยกออกจากวัสดุชีวภาพใด ๆ เช่นที่อยู่อาศัยหรือเนื้อเยื่ออนุรักษ์เซลล์อนุภาคไวรัสหรือตัวอย่างอื่น ๆ สำหรับการวิเคราะห์หรือเตรียม [1]. สองประเภทที่มีส่วนร่วมในการทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอรวมถึงการแยกดีเอ็นเอ โครงสร้างเช่นพลาสมิดหรือ bacteriophage และการแยกของโครโมโซมหรือดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตโปรคาริโอหรือยูคาริโอ [2] โดยทั่วไปการทำให้บริสุทธิ์กรดนิวคลีประสบความสำเร็จจำเป็นต้องมีสี่ขั้นตอนที่สำคัญที่มีประสิทธิภาพการหยุดชะงักของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ; denaturation คอมเพล็กซ์นิวคลีโอ; การใช้งานของนิตัวอย่างเช่น RNase สำหรับการสกัดอาร์เอ็นเอและ DNase สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ ห่างจากการปนเปื้อน [2] กรดนิวคลีเป้าหมายควรเป็นอิสระจากสารปนเปื้อนรวมทั้งโปรตีนคาร์โบไฮเดรตไขมันหรือกรดนิวคลีอิกอื่น ๆ เช่นดีเอ็นเออาร์เอ็นเอของฟรีหรืออาร์เอ็นเอฟรีดีเอ็นเอ [3] คุณภาพและความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกที่แยกจะส่งผลโดยตรงต่อผลของการประสบความสำเร็จการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ [4]. ในทางตรงกันข้าม, RNA เป็นโมเลกุลที่ไม่เสถียรและมีความสั้นมากครึ่งชีวิตสกัดครั้งเดียวจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อ [5 ] มีหลายชนิดที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติรวมทั้งอาร์เอ็นเอโซมอลอาร์เอ็นเอมี (rRNA) (80% -90%) สาร rna (mRNA) (2.5% -5%) และการถ่ายโอน RNA (tRNA) [3] การดูแลเป็นพิเศษและข้อควรระวังที่จำเป็นสำหรับการแยกอาร์เอ็นเอในขณะที่มันเป็นที่ประทับใจกับการย่อยสลาย [3, 6] อาร์เอ็นเอไม่แน่นอนโดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื่องจากการปรากฏตัวที่แพร่หลายของ RNases ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีอยู่ในเลือดเนื้อเยื่อทั้งหมดรวมทั้งเชื้อแบคทีเรียและเชื้อรามากที่สุดในสภาพแวดล้อม [3, 5] denaturants ที่แข็งแกร่งได้เสมอที่ใช้ในการแยก RNA เหมือนเดิมในการยับยั้งการ RNases ภายนอก [2] สกัด RNA อาศัยเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ดีและเทคนิค RNase ฟรี RNase เป็นความร้อนที่มีเสถียรภาพและต่อไปนี้ refolds denaturation ความร้อน พวกเขาเป็นเรื่องยากที่จะยับยั้งขณะที่พวกเขาไม่จำเป็นต้องมีปัจจัย [2] วิธีการแยกที่พบมากที่สุดสามารถแบ่งออกเป็นสองชั้น:. การใช้ประโยชน์จาก 4 M thiocyanate Guanidinium และการใช้ประโยชน์ของฟีนอลและ SDS [2] การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเป็นหนึ่งในส่วนที่สำคัญที่สุดในการวิจัยโปรตีนที่จะเข้าใจการทำงานของพวกเขาขณะที่พวกเขาส่วนหนึ่งอาจ หรือสมบูรณ์มีส่วนร่วมในกิจกรรมการสังเคราะห์ดีเอ็นเอใด ๆ โปรตีนบริสุทธิ์จะต้องกำหนดลักษณะที่ไม่ซ้ำกันรวมทั้งขนาดค่ารูปร่างและฟังก์ชั่น [7] สกัดเซลล์ที่ใช้เป็นขั้นตอนเริ่มต้นสำหรับเกือบทั้งหมดทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ โปรตีนสามารถสกัดโดยวิธีการบางอย่างเช่นสลายผงซักฟอกแรงตัด, การรักษาด้วยเกลือไอออนิกต่ำ (เกลือออก) และการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในความดันซึ่งมีวัตถุประสงค์ที่จะลดลงและทำลายเยื่อหุ้มโดยรอบเซลล์เพื่อให้โปรตีนที่จะหลบหนี [7 ] ปัจจัยบางประการที่ควรพิจารณาเมื่อจัดการโปรตีน โดยปกติการสกัดโปรตีนจะดำเนินการที่อุณหภูมิที่ต่ำมาก () เป็นโปรตีนแปลงสภาพได้อย่างง่ายดายเมื่อพวกเขาจะถูกปล่อยออกมาจากเซลล์ สภาพบัฟเฟอร์เป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่จะต้องพิจารณา เงื่อนไขบัฟเฟอร์เฉพาะจะแนะนำให้ได้รับการรักษาเพราะความไวของโปรตีนที่มีต่อการเปลี่ยนแปลงค่า pH สิ่งแวดล้อม [4] ความบริสุทธิ์ของน้ำจะมีผลต่อผลผลิตของผลิตภัณฑ์สุดท้ายเป็นน้ำ unpurified มีจำนวนมากของจุลินทรีย์หรือโปรตีเอสที่จะมีผลในการย่อยสลายโปรตีน [4] ยับยั้งโปรตีนซึ่งอาจมีอยู่ในการแก้ปัญหาหรือบัฟเฟอร์สาเหตุ hydrolyzation ของโปรตีน ผงซักฟอกอีกหนึ่งปัจจัยสำคัญที่ไม่สามารถละเลยในการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนประกอบด้วยส่วนที่ไม่ชอบน้ำของเชิงเส้นหรือแยกไฮโดรคาร์บอน "หาง" และ "หัว" น้ำ [4] พวกเขาละลายโปรตีนเมมเบรนและเป็นโมเลกุล amphiphatic ซึ่งรูปแบบ micelles กับหัวน้ำของโปรตีน [4] ตัวแทนลดจะถูกเพิ่มลงในสารละลายบัฟเฟอร์หรือการสกัดโปรตีนและการทำให้บริสุทธิ์เพื่อหลีกเลี่ยงการหายไปของกิจกรรมของโปรตีนหรือเอนไซม์ที่เกิดจากอนุมูลอิสระ การจัดเก็บข้อมูลของโปรตีนเป็นสิ่งสำคัญที่ครึ่งชีวิตของโปรตีนที่เป็นปกติขึ้นอยู่กับอุณหภูมิการจัดเก็บ [4]. บริสุทธิ์ของโปรตีนที่จำเป็นต้องมีการทดสอบเฉพาะ วิธีการทดสอบที่ง่ายและรวดเร็วจะต้องรู้จักสำหรับการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนเพื่อให้มีน้ำหนักโมเลกุลที่รู้จักกันเป็นพี่น้องกันเฉพาะเจาะจงหรือ immunoaffinity ของโปรตีน nonenzymatic ที่สนใจสามารถตรวจพบได้โดยใช้วิธีการที่เหมาะสม [7] มีหลายวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการทำให้บริสุทธิ์โปรตีน พวกเขาเป็นสารแลกเปลี่ยนไอออนกรองเจลโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดและข่าวคราว [4]. 2 ประวัติความเป็นมา2.1 กรดนิวคลีอิกสกัดแยกดีเอ็นเอแรกที่ได้กระทำโดยแพทย์ชาวสวิสฟรีดริช Miescher ในปี 1869 [8] เขาหวังว่าจะแก้หลักการพื้นฐานของชีวิตเพื่อตรวจสอบองค์ประกอบทางเคมีของเซลล์ เขาพยายามที่จะแยกเซลล์จากต่อมน้ำเหลืองสำหรับการทดลองของเขา แต่ความบริสุทธิ์ของเซลล์เม็ดเลือดขาวเป็นเรื่องยากและเป็นไปไม่ได้ที่จะได้รับในปริมาณที่เพียงพอ ดังนั้นเขาเปลี่ยนไปเม็ดเลือดขาวซึ่งเขาได้รับพวกเขาจากหนองในผ้าพันแผลผ่าตัดเก็บรวบรวม. ในขั้นต้น Miescher มุ่งเน้นไปที่ประเภทต่างๆของโปรตีนที่ทำขึ้นเม็ดเลือดขาวและแสดงให้เห็นว่าโปรตีนเป็นส่วนประกอบหลักของพลาสซึมของเซลล์ ในระหว่างการทดสอบของเขาเขาสังเกตเห็นว่าเป็นสารตกตะกอนจากสารละลายกรดเมื่อถูกบันทึกและเลือนหายไปอีกครั้งเมื่ออัลคาไลถูกเพิ่มเข้ามา นี่เป็นครั้งแรกที่เขาได้รับตะกอนน้ำมันดิบดีเอ็นเอ. แยกดีเอ็นเอจากโปรตีนในสารสกัดจากเซลล์ของเขา Miescher พัฒนาโปรโตคอลใหม่ที่จะแยกนิวเคลียสของเซลล์จากเซลล์และดีเอ็นเอที่แยกแล้ว อย่างไรก็ตามโปรโตคอลครั้งแรกของเขาล้มเหลวที่จะให้ผลผลิตวัสดุพอที่จะดำเนินการต่อด้วยการวิเคราะห์ต่อไป เขามีการพัฒนาโปรโตคอลที่สองที่จะได้รับในปริมาณขนาดใหญ่ของ nuclein บริสุทธิ์ซึ่งได้รับการเสนอชื่อเป็น 'กรดนิวคลี' ในภายหลังโดยนักเรียนของเขาริชาร์ดอัลท์แมน [8]. 2.2 การสกัดโปรตีนในศตวรรษที่สิบแปดโปรตีนเป็นที่รู้จักกันเป็นชั้นที่แตกต่างกันของโมเลกุลทางชีวภาพโดยแอนทอน Fourcroy และอื่น ๆ พวกเขาประสบความสำเร็จโมเลกุลนี้โดยความสามารถในการแข็งตัวภายใต้การรักษาด้วยความร้อนหรือกรด แต่คำอธิบายแรกของโปรตีนที่ได้ดำเนินการโดยโยฮันเน Gerhardus Mulder นักเคมีชาวดัตช์ในปี 1893 [9] การศึกษาของเขากับองค์ประกอบของสารที่สัตว์ส่วนใหญ่ไฟบริน, อัลบูมิและเจลาตินที่แสดงให้เห็นการปรากฏตัวของคาร์บอนไฮโดรเจนออกซิเจนและไนโตรเจน [9] นอกจากนี้เขาได้รับการยอมรับว่ากำมะถันและฟอสฟอรัสอยู่ในปัจจุบันในบางครั้งสารสัตว์ที่ประกอบไปด้วยจำนวนมากของอะตอมและเขายอมรับว่าเหล่านี้ "สาร" เป็นโมเลกุล [9]. ส่วนใหญ่ของการศึกษาต้นมุ่งเน้นไปที่โปรตีนที่สามารถนำมาทำให้บริสุทธิ์ในปริมาณมาก ยกตัวอย่างเช่นเลือดไข่ขาวและสารพิษต่างๆ ส่วนใหญ่ของโปรตีนมีความยากในการชำระล้างในกว่ามิลลิกรัมปริมาณแม้จะมีวันนี้วิธีการขั้นสูง ส่วนใหญ่ของเทคนิคในการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ได้รับการพัฒนาในโครงการที่นำโดยโจเซฟเอ็ดวิน Cohn นักวิทยาศาสตร์โปรตีนในระหว่างสงครามโลกครั้งที่สอง เขาเป็นผู้รับผิดชอบในการฟอกเลือดและการทำงานออกเทคนิคในการแยกส่วนของซีรั่มอัลบูมิเลือดซึ่งเป็นสิ่งสำคัญในการรักษาแรงดันในหลอดเลือดซึ่งช่วยให้ทหารมีชีวิต [10]. 3 แนวโน้มปัจจุบันหลังจากเหตุการณ์ที่โชค Miescher การจัดการที่จะได้รับดีเอ็นเอจากเซลล์อื่น ๆ อีกมากมายได้ตามเหมาะสมซึ่งนำไปสู่การส่งเสริมความก้าวหน้าในการแยก DNA และโปรโตคอลบริสุทธิ์ ขั้นตอนการตรวจทางห้องปฏิบัติการประจำเริ่มต้นสำหรับการสกัดดีเอ็นเอได้รับการพัฒนาจากการใช้กลยุทธ์การปั่นแยกลาดหนาแน่น Meselson Stahl และใช้วิธีการนี้ในปี 1958 แสดงให้เห็นถึงการจำลองแบบ semiconservative ดีเอ็นเอ [3] ขั้นตอนต่อมาทำให้การใช้ความแตกต่างในการละลายของดีเอ็นเอโครโมโซมขนาดใหญ่พลาสมิดและโปรตีนในบัฟเฟอร์อัลคาไลน์ [3]. ปัจจุบันมีหลายวิธีการเฉพาะของการสกัดดีเอ็นเอออกมาบริสุทธิ์อาร์เอ็นเอหรือโปรตีน โดยทั่วไปแล้วพวกเขาจะแบ่งออกเป็นวิธีการแก้ปัญหาหรือคอลัมน์ที่ใช้โปรโตคอล ส่วนใหญ่ของโปรโตคอลเหล่านี้ได้รับการพัฒนาเป็นชุดเชิงพาณิชย์ที่ความสะดวกในกระบวนการสกัดสารชีวโมเลกุล. 3.1 ประเภทกรดนิวคลีอิกสกัด3.1.1 วิธีธรรมดาGuanidinium Thiocyanate-ฟีนอล-สกัดคลอโรฟอร์มเกลือเป็นสิ่งเจือปนที่พบในตัวอย่างกรดนิวคลี มันได้รับการเสมอที่จำเป็นจะถูกลบออกจากตัวอย่างกรดนิวคลีก่อนที่กระบวนการปลายน้ำใด ๆ และการวิเคราะห์ที่สามารถทำได้ ดังนั้นการแยกเดียวหรือหลายและ / หรือขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์มีความจำเป็นเพื่อ desalt ตัวอย่างที่ประกอบไปด้วยกรดนิวคลีอิก [11] ขั้นตอนทั่วไปของการทำให้บริสุทธิ์กรดนิวคลีรวมถึงการสลายเซลล์ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอและโปรตีนเป็นวิธีพื้นฐานที่ใช้ในชีววิทยาระดับโมเลกุล สารชีวโมเลกุลเหล่านี้สามารถแยกจากวัสดุทางชีวภาพกระบวนการต่อเนื่องที่ตามมาวิเคราะห์ดวัตถุประสงค์ ในอดีต กระบวนการของการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกใช้ยุ่งยาก ใช้เวลามาก ใช้แรงงาน และ จำกัด ในแง่ของระบบโดยรวมขณะนี้มีเฉพาะวิธีที่คุณสามารถใช้เพื่อแยกชีวโมเลกุลบริสุทธิ์ เช่น ใช้วิธีและคอลัมน์ที่ใช้โปรโตคอล วิธีการด้วยตนเองได้แน่นอนมาไกลในช่วงเวลาต่าง ๆ ข้อเสนอเชิงพาณิชย์ซึ่งรวมถึงชุดสมบูรณ์ที่ประกอบด้วยส่วนใหญ่ของส่วนประกอบที่จำเป็นที่จะต้องแยกกรดนิวคลีอิก แต่ส่วนใหญ่ของพวกเขาต้องใช้ขั้นตอนที่ 3 ซ้ำ ,ตามด้วยการกำจัด supernatants ขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่างและการรักษาเครื่องกลเพิ่มเติม ระบบอัตโนมัติที่ออกแบบมาสำหรับขนาดกลางและขนาดใหญ่มีการเติบโตในความต้องการห้องปฏิบัติการมากกว่าที่ผ่านมา เป็นอีกทางเลือกของวิธีการคู่มือที่ใช้แรงงาน . เทคโนโลยีที่ควรอนุญาตให้มีอัตราความเร็วสูงตัวอย่าง ; ผลผลิต , ความบริสุทธิ์ , ยา ,และ scalability ของสารชีวโมเลกุล ตลอดจนความเร็วความถูกต้องและความน่าเชื่อถือของการทดสอบควรจะสูงสุดในขณะที่ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้าม

1 การแยกสารชีวโมเลกุล

การสกัดของชีวโมเลกุล , DNA , RNA และโปรตีน เป็นสิ่งสำคัญที่สุด วิธีการที่ใช้ในอณูชีววิทยา [ 1 ]มันเป็นจุดเริ่มต้นของกระบวนการพัฒนาผลิตภัณฑ์ปลายน้ำและรวมถึงชุดตรวจวินิจฉัย DNA , RNA และโปรตีนสามารถแยกออกจากวัสดุทางชีวภาพ เช่น ห้องนั่งเล่น หรือป่าสงวนเนื้อเยื่อ , เซลล์ , อนุภาคไวรัส หรืออื่น ๆ ตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์หรือวัตถุประสงค์ค่า

[ 1 ]สองประเภทที่เกี่ยวข้องกับบริสุทธิ์ดีเอ็นเอรวมถึงการสร้างพลาสมิดดีเอ็นเอเช่น หรือ โรงพยาบาล และการแยกโครโมโซม หรือ ดีเอ็นเอจากโพรคาริโอติกหรือ eukaryotic สิ่งมีชีวิต [ 2 ] โดยทั่วไป ประสบความสำเร็จ กรดนิวคลีอิกเป็นสี่ขั้นตอนที่สำคัญ : การฟอกที่มีประสิทธิภาพของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ ของนิ วคลีโอโปรตีนเชิงซ้อน ( ;การยับยั้งของ nucleases ตัวอย่างเช่นเลสสำหรับ RNA การสกัดและตรวจหา ADNase สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ ; การปนเปื้อนห่างจาก [ 2 ] เป้าหมายกรดนิวคลีอิกควรปลอดจากสารปนเปื้อน ได้แก่ โปรตีน คาร์โบไฮเดรต ไขมัน กรดหรือสารประกอบอื่น ๆเช่น DNA , RNA หรือ DNA ฟรีฟรีดีเอ็นเอ [ 3 ]คุณภาพและความสมบูรณ์ของแยกกรดนิวคลีอิกจะส่งผลกระทบโดยตรงต่อผลของการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ประสบความสำเร็จ [ 4 ] .

บนมืออื่น ๆ , RNA เป็นโมเลกุลที่ไม่เสถียรและมีครึ่งชีวิตสั้นมากสกัดครั้งเดียวจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อ [ 5 ] มีหลายประเภทของธรรมชาติที่เกิดขึ้น รวมทั้ง ไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอ ( RNA ( rRNA ) – 80% 90% ) เอ็มอาร์เอ็นเอ ( mRNA ) ( 25 % และ 5 % ) ทีอาร์เอ็นเอ ( การเมารถ ) [ 3 ] การดูแลพิเศษและข้อควรระวังจะต้องแยก RNA เป็นเสี่ยงต่อการเสื่อมสภาพ [ 5 , 6 ] ซึ่งเป็นโดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่เสถียรเนื่องจากการแสดงตนของ rnases แพร่หลายซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีอยู่ในเลือด , เนื้อเยื่อ , เช่นเดียวกับส่วนใหญ่แบคทีเรียและเชื้อราในสิ่งแวดล้อม [ 4 , 5 ]denaturants แข็งแรงมักจะถูกใช้ในการ rnases เหมือนเดิม RNA แยกภายนอก [ 2 ] การสกัด DNA อาศัยเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ดีและเทคนิคเลสฟรี เลสคือความร้อนคงที่และ refolds ต่อไปนี้ ( ความร้อน พวกเขาจะยากที่จะทำให้พวกเขาไม่ต้องใช้ปัจจัย [ 2 ] วิธีการแยกโดยทั่วไปสามารถแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม :การใช้ 4   M guanidinium ไทโอไซยาเนตและการใช้ฟีนอลและ SDS [ 2 ] .

บริสุทธิ์ของโปรตีนเป็นหนึ่งในที่สำคัญที่สุดส่วนในโปรตีนงานวิจัยที่จะเข้าใจของพวกเขาฟังก์ชันเช่นที่พวกเขาอาจจะบางส่วนหรือทั้งหมดมีส่วนร่วมในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในกิจกรรม บำบัดน้ำเสียโปรตีนจะต้องกำหนดคุณลักษณะที่เป็นเอกลักษณ์ ได้แก่ ขนาด รูปร่าง และหน้าที่แล้ว [ 7 ]สกัดจากเซลล์เริ่มต้นขั้นตอนเกือบทั้งหมดโปรตีนบริสุทธิ์ โปรตีนสามารถสกัดโดยวิธีการไม่กี่เช่นการสลายผงซักฟอก , แรงตัด , การรักษาด้วยไอออนต่ำเกลือ ( salting out ) และการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในดัน ซึ่งมุ่งที่จะลดลงและทำลายเยื่อหุ้มรอบเซลล์เพื่อให้โปรตีนที่จะหลบหนี [ 7 ] ปัจจัยบางประการที่ควรพิจารณาเมื่อใช้โปรตีนโดยปกติการสกัดโปรตีนจะดำเนินการที่อุณหภูมิต่ำมาก ( ) เป็นโปรตีนจะเกิดได้ง่ายเมื่อพวกเขาถูกปล่อยออกมาจากเซลล์ กันชนสภาพเป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญที่ต้องพิจารณา เงื่อนไขเฉพาะบัฟเฟอร์ควรรักษา เพราะความไวของโปรตีนต่ออ การเปลี่ยนแปลงด้านสิ่งแวดล้อม [ 4 ]ความบริสุทธิ์ของน้ำจะมีผลต่อผลผลิตของผลิตภัณฑ์สุดท้ายเป็น unpurified น้ำเต็มไปด้วยจุลินทรีย์ หรือทางที่จะส่งผลในการสลายโปรตีน [ 4 ] สารยับยั้งโปรตีนซึ่งอาจมีอยู่ในสารละลายบัฟเฟอร์ หรือ สาเหตุ แอลฟาของโปรตีน ผงซักฟอก , ปัจจัยอื่นที่ไม่สามารถละเลยในการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน