In an exemplary method according to

In an exemplary method according to the การเปิดเผย, a nucleic acid molecule encoding a ไลโปคาลินนุนุ is เป้าหมายed to การก่อกลายพันธุ์ at one หรือ more of the amino acid sequence positions 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (SEQ ID NO: 1). ในบางรุรุ, the nucleic acid molecule is further เป้าหมายed to การก่อกลายพันธุ์ at one หรือ more of the amino acid sequence positions 61, 101, 111, 114 and 153 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of the ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย.

[0073] In one embodiment of the การเปิดเผย, a method for the generation of a มิวทีน of ไลโปคาลินนุนุ รวมถึง mutating at least 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, หรือ 17 of the โคดอนs of any of the amino acid sequence positions 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย. In one embodiment, all 18 of the โคดอนs of amino acid sequence positions 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58,
80, 83, 104, 105, 106 and 108 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย are mutated.

[0074] In a further embodiment of the การเปิดเผย, the methods according to the การเปิดเผย รวมถึง the mutation of both of the โคดอนs encoding ซิสเทอีน at positions 61 and 153 in the linear โพลีเปปไทด์ sequence of mature human tear ไลโปคาลิน (SEQ ID NO: 1). In one embodiment position 61 is mutated to encode an alanine, ฟีนิลอะลานีน, lysine, arginine, threonin, แอสพาราจีน, ไทโรซีน, เมไธโอนีน, serine, proline หรือ a ทริปโตฟานe เรซิดิว, to name only a few possibilities. In embodiments where position 153 is mutated, an amino acid such as a serine หรือ alanine can be introduced at position 153.

[0075] In another embodiment of the การเปิดเผย as described herein, the โคดอนs encoding amino acid sequence positions 111 and/or 114 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย are mutated to encode for example an arginine at position 111 and a ทริปโตฟานe at position 114.

[0076] Another embodiment of the methods of the การเปิดเผย, involves การก่อกลายพันธุ์ of the โคดอน encoding the ซิสเทอีน at position 101 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย so that this โคดอน encodes any other amino acid. In one embodiment the mutated โคดอน encoding position 101 encodes a serine. Accordingly, ในบางรุรุ either two หรือ all three of the ซิสเทอีน โคดอนs at position 61, 101 and 153 are replaced by a โคดอน of another amino acid.

[0077] According to the method of the การเปิดเผย, a ไลโปคาลิน มิวทีน is obtained starting from a nucleic acid molecule encoding ไลโปคาลินนุนุ. Such a nucleic acid molecule is เป้าหมายed to การก่อกลายพันธุ์ and introduced into a suitable bacterial หรือ eukaryotic host organism by means of recombinant DNA technology. Obtaining a nucleic acid library of ไลโปคาลิน มิวทีน can be carried out using any suitable technique that is known in the art for generating ไลโปคาลิน มิวทีน with antibody-like properties, i.e. m.uteins that have แอฟฟินิตี้ towards a given target. Examples of such combinatorial methods are described in detail in the PCT publications WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO
03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, หรือ WO 2006/56464 for instance. The content of each of these patent applications is incorporated by reference herein in its entirety. After expression of the nucleic acid sequences that were เป้าหมายed to การก่อกลายพันธุ์ in an appropriate host, the clones carrying the genetic information for the plurality of respective ไลโปคาลิน มิวทีน, which ยึดเกาะa given target can be selected from the library obtained. Well known techniques. can be employed for the selection of these clones, such as phage display (reviewed in Kay, B.K. et al. (1996) ข้างต้น; Lowman, H.B. (1997) ข้างต้น หรือ Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) ข้างต้น), colony screening (reviewed in Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5, 503-510), ribosome display (reviewed in Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) หรือ mRNA display as reported in Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755 หรือ the methods specifically described in WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO
03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, หรือ WO 2006/56464.


[0078] The resulted nucleic acid molecules encoding one หรือ more ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may be expressed using any suitable expression system. The obtained ไลโปคาลิน มิวทีน หรือ ไลโปคาลิน มิวทีน can be further selected. The selection may for example be carried out under competitive conditions. Competitive conditions ตามที่ใช้ในที่นี้ means that selection of ไลโปคาลิน มิวทีน encompasses at least one step in which the ไลโปคาลิน มิวทีน and the given non-natural ลิแกนด์ of wide-type ไลโปคาลิน are brought in contact in the presence of an additional ลิแกนด์, which competes with binding of the มิวทีน to such non-natural ลิแกนด์. This additional ลิแกนด์ maybe a physiological ลิแกนด์ of the target, an excess of the target itself หรือ any other non-physiological ลิแกนด์ of the target that ยึดเกาะ at least an overlapping เอพิโทป to the เอพิโทป recognized by the มิวทีน of the การเปิดเผย and thus interferes with target binding of the มิวทีน. Alternatively, the additional ลิแกนด์ competes with binding of the มิวทีน by complexing an เอพิโทป distinct from the binding ตำแหน่ง of the มิวทีน to the target by allosteric effects.

[0079] An embodiment of the phage display technique (reviewed in Kay, B.K. et al. (1996), ข้างต้น; Lowman, H. B. (1997) ข้างต้น หรือ Rodi, D.J., & Makowski, L. (1999), ข้างต้น) using temperate Ml 3 phage is given as an example of a selection method that can be employed in the การเปิดเผยนี้. Another embodiment of the phage display technology that can be used for selection of มิวทีน of the การเปิดเผย is the hyperphage phage technology as described by Broders et al. (Broders et al. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display." Methods Mal. Biol. 205:295-302). Other temperate phage such as fl หรือ lytic phage such as T7 may be employed as well. For the exemplary selection method, Ml 3 phagemids are produced which allow the expression of the mutated ไลโปคาลิน nucleic acid sequence as a fusion with a signal sequence at the N-terminus, such as the OmpA-signal sequence, and with the capsid protein pIII of the phage M13 หรือ ชิ้นส่วนย่อยs thereof capable of
being incorporated into the phage capsid at the C-terminus. The C-terminal ชิ้นส่วนย่อย ~pIII of the phage capsid protein that รวมถึง amino acids 21 7 to 406 of the wild type sequence is may be used to produce the fusion proteins. In one embodiment a C-terminal ชิ้นส่วนย่อย of pIII is used, in which the ซิสเทอีน เรซิดิว at position 201 is missing หรือ is replaced by another amino acid.
[0080] Accordingly, a further embodiment of the methods of the การเปิดเผย involves operably fusing a nucleic acid molecule coding for the one หรือ more ไลโปคาลิน มิวทีน and resulting from การก่อกลายพันธุ์ at the 3' end with a gene coding for the coat protein pIII of a filamentous bacteriophage of the Ml3-family หรือ for a ชิ้นส่วนย่อย of this coat protein, in order to
select at least one มิวทีน for the binding of a given ลิแกนด์.


[0081] The fusion protein may รวมถึง additional components such as an แอฟฟินิตี้ tag, which allows the immobilization, detection and/or purification of the fusion protein หรือ its parts. Furthermore, a stop โคดอน can be located between the sequence บริเวณs encoding the ไลโปคาลิน หรือ its มิวทีน and the phage capsid gene หรือ ชิ้นส่วนย่อยs thereof, โดยที่ the stop โคดอน, such as an amber stop โคดอน, is at least partially translated into an amino acid during translation in a suitable suppressor strain.

[0082] For example, the phasmid เวกเตอร์ pTLPC27 (see, for example, Figure 20 and SEQ ID NO: 9 of PCT publication WO 2008/015239), also called pTlc27, can be used for the preparation of a phagemid library encoding human tear ไลโปคาลิน มิวทีน. The inventive nucleic acid molecules coding for the tear ไลโปคาลิน มิวทีน may be inserted into the เวกเตอร์ using

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในวิธีที่ระบุตามการการเปิดเผย โมเลกุลกรดนิวคลีอิกที่เข้ารหัสแบบไลโปคาลินนุนุเป็น เป้าหมายed เพื่อการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งหรือมากกว่าของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 และ 108 ลำดับที่เส้นโพลีเปปไทด์ไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (เลขลำดับรหัส: 1) ในบางรุรุ โมเลกุลกรดนิวคลีอิกเป็น เป้าหมายed ต่อไปการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งหรือเพิ่มเติมตำแหน่งกรดอะมิโนลำดับ 61 , 101, 111, 114 และ 153 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย[0073] ในลื่นหนึ่งของการเปิดเผย วิธีการสร้างของมิวทีนของรวมถึงไลโปคาลินนุนุ mutating ที่ 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 หรือของ โคดอนs ใด ๆ ของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 และ 108 ลำดับที่เส้นโพลีเปปไทด์ไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ในหนึ่งลื่น โคดอนs ลำดับกรดอะมิโนทั้งหมด 18 ตำแหน่ง 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 5880, 83, 104, 105, 106 และ 108 ลำดับที่เส้นโพลีเปปไทด์ไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะกลาย[0074] ในลื่นเพิ่มเติมของการการเปิดเผย วิธีตามรวมถึงการเปิดเผยการกลายพันธุ์ของ โคดอนs รหัสซิสเทอีนที่ตำแหน่ง 61 และ 153 ตามลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของผู้ใหญ่ทั้งสองฉีกไลโปคาลิน (เลขลำดับรหัส: 1) ในตำแหน่งหนึ่งลื่น 61 จะกลายจะเข้าอะลานีน ฟีนิลอะลานีน แอล-ไลซีน อาร์จินีน threonin แอสพาราจีน ไทโรซีน เมไธโอนีน แถ proline หรือเรซิดิว ทริปโตฟานe ชื่อเฉพาะบางโอกาส ใน embodiments ที่ตำแหน่ง 153 จะกลาย สามารถนำกรดอะมิโนที่มีเช่นการแถหรืออะลานีนที่ตำแหน่ง 153[0075] ในลื่นอื่นของการเปิดเผยตามนี้ โคดอนs รหัสกรดอะมิโนตำแหน่งลำดับ 111 / 114 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะกลายการเข้ารหัสเช่นการอาร์จินีนที่ตำแหน่ง 111 และ ทริปโตฟานe ที่ตำแหน่ง 114[0076] เกี่ยวข้องลื่นอีกวิธีของการเปิดเผย การก่อกลายพันธุ์โคดอนรหัสซิสเทอีนที่ตำแหน่ง 101 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยเพื่อให้โคดอนนี้จแมปกรดอะมิโนอื่น ๆ ในหนึ่งลื่น กลายโคดอนเข้ารหัสตำแหน่ง 101 จแมปแถ ตามลำดับ ในบางรุรุทั้งสองหรือทั้งสามของ โคดอนs ซิสเทอีนที่ตำแหน่ง 61, 101 และ 153 จะถูกแทนที่ โดยโคดอนของกรดอะมิโนอื่น[0077] According กับวิธีการการเปิดเผย ไลโปคาลินมิวทีนได้รับเริ่มต้นจากโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกเข้ารหัสไลโปคาลินนุนุ เช่นโมเลกุลกรดนิวคลีอิกมี เป้าหมายed กับการก่อกลายพันธุ์ และนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตในการโฮสต์ eukaryotic หรือแบคทีเรียที่เหมาะสมโดยใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอวททช รับรีกรดนิวคลีอิกของไลโปคาลินมิวทีนสามารถทำการใช้เทคนิคใดเหมาะสมที่เป็นที่รู้จักกันในศิลปะการสร้างแอนติบอดีเช่นคุณสมบัติ มิวทีนไลโปคาลินเช่น m.uteins ที่มีแอฟฟินิตี้ต่อเป้าหมายที่กำหนด ตัวอย่างเช่นวิธีการปัญหาอธิบายไว้ในรายละเอียดในสิ่งพิมพ์ของ PCT WO 99/16873, 00/75308, 03/029471, 03/029462, WO WO WO WO03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 หรือ WO 2006/56464 เช่นกัน เนื้อหาของแต่ละโปรแกรมประยุกต์สิทธิบัตรเหล่านี้เป็นส่วนประกอบ โดยการอ้างอิงนี้ทั้งนั้น หลังจากที่กรดนิวคลีอิกของลำดับที่มี เป้าหมายed กับการก่อกลายพันธุ์ในการโฮสต์ที่เหมาะสม โคลนดำเนินข้อมูลพันธุกรรมสำหรับการได้ของไลโปคาลินที่เกี่ยวข้องมิวทีน ยึดเกาะa ที่กำหนดเป้าหมายที่สามารถเลือกจากไลบรารีได้รับ เทคนิคที่รู้จักกันดี สามารถทำงานสำหรับการเลือกโคลนเหล่านี้ เช่น phage แสดง (ทบทวนในเคย์ B.K. et al. (1996) ข้างต้น Lowman หรือข้างต้น (1997) H.B. Rodi, D.J. และ Makowski ข้างต้น (1999) L.), อาณานิคมตรวจ (ตรวจทานใน Pini หวี A. et al. (2002) หน้าจอแสดงอัตราความเร็วสูง chem. 5, 503-510), ไรโบโซมแสดง (ทานใน Amstutz, P. et al. (2001) สกุลเงิน Opin Biotechnol 12, 400-405) หรือ mRNA แสดงเป็นรายงานใน Wilson สหรัฐอเมริกา Acad. Sci. Proc. Natl. al. et D.S. (2001) 98, 3750-3755 หรือวิธีการที่อธิบายเฉพาะใน WO 99/16873, 00/75308 WO, WO 03/029471, WO 03/029462, WO03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 หรือ WO 2006/56464[0078] โมเลกุลทำให้เกิดกรดนิวคลีอิกเข้ารหัสหนึ่งหรือเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจแสดงโดยใช้ระบบใด ๆ นิพจน์ที่เหมาะสม ได้รับไลโปคาลินมิวทีนหรือไลโปคาลินมิวทีนสามารถเลือกเพิ่มเติม การเลือกอาจเช่นจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขการแข่งขัน ตามที่ใช้ในที่นี้แข่งขันเงื่อนไขหมายความ ว่า ตัวเลือกไลโปคาลินมิวทีนครอบคลุมอย่างน้อยหนึ่งขั้นตอนในซึ่ง ไลโปคาลินมิวทีนและลิแกนด์ไม่ใช่ธรรมชาติกำหนดของไลโปคาลินชนิดทั้งนำติดต่อในต่อหน้าของลิแกนด์การเพิ่มเติม ที่แข่งขัน ด้วยรวมของมิวทีนกับลิแกนด์ไม่ใช่ธรรมชาติเช่นกัน ทีนี้เพิ่มเติมลิแกนด์ลิแกนด์สรีรวิทยาของเป้าหมาย เป้าหมายตัวเองมากเกินหรือใด ๆ อื่น ๆ ลิแกนด์ไม่ใช่สรีรวิทยาของเป้าหมายที่ยึดเกาะเอพิโทปน้อยการทับซ้อนกันกับเอพิโทปมิวทีนของการเปิดเผยที่รู้จัก และดัง รบกวนเป้าหมายรวมของมิวทีน หรือ ลิแกนด์เพิ่มเติมแข่งขัน ด้วยมัดมิวทีนการโดย complexing เอพิโทปแตกต่างจากตำแหน่งรวมของมิวทีนเป็นเป้าหมายโดยผล allosteric[0079] การลื่นของ phage แสดงราคาเทคนิค (ทบทวนเคย์ B.K. et al. (1996), ข้างต้น H. B. (1997) ข้างต้นหรือ Rodi, D.J., & Makowski, L. (1999), ข้างต้น Lowman) โดยใช้ 3 Ml แจ่ม phage ถูกกำหนดเป็นตัวอย่างของวิธีการเลือกที่สามารถทำงานในการเปิดเผยนี้ ศูนย์รวมแห่งเทคโนโลยีการแสดงผล phage ที่สามารถใช้ตัวเลือกมิวทีนของการเปิดเผยอื่นเป็นเทคโนโลยี phage hyperphage ตามที่อธิบายไว้โดย Broders et al. (Broders et al. (2003) "Hyperphage ปรับปรุงงานนำเสนอของแอนติบอดีใน phage แสดง" วิธี Mal. Biol. 205:295-302) อื่น ๆ phage แจ่มเช่น fl หรือ lytic phage เช่น T7 อาจทำงานเช่น สำหรับวิธีเลือกเยี่ยง phagemids Ml 3 ผลิตซึ่งทำให้ค่าของการไลโปคาลินกลายลำดับดีเอ็นเป็นการผสมผสานกัน กับลำดับสัญญาณที่ตัว N-นัส เช่นลำดับสัญญาณ OmpA และ pIII โปรตีน capsid ของ phage M13 หรือ ชิ้นส่วนย่อยs ดังกล่าวสามารถการรวมเข้าไปใน capsid phage ที่ C-เทอร์มินัส ชิ้นส่วนย่อยสถานี C ~ pIII โปรตีน capsid phage ที่รวมถึงกรดอะมิโน 21 7-406 ลำดับชนิดป่า อาจถูกใช้เพื่อผลิตอาหารโปรตีนที่ได้ ในหนึ่งลื่นที่ใช้ชิ้นส่วนย่อย C-เทอร์มินัลของ pIII เรซิดิวซิสเทอีนตำแหน่ง 201 ที่ถูกที่ ขาดหายไปหรือถูกแทนที่ ด้วยกรดอะมิโนอื่น [0080] ตาม ลื่นเพิ่มเติมวิธีการการเปิดเผยเกี่ยวข้องกับ operably ยีโมเลกุลกรดนิวคลีอิกรหัสสำหรับหรือหนึ่งเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีน และเกิดจากการก่อกลายพันธุ์ที่ปลาย 3' กับยีนเป็นรหัสสำหรับ pIII โปรตีนตราของแบคที filamentous ของหรือครอบครัว Ml3 สำหรับชิ้นส่วนย่อยของโปรตีนนี้ตรา เพื่อเลือกมิวทีนสำหรับการรวมของลิแกนด์กำหนด[0081] โปรตีนฟิวชั่นอาจรวมถึงคอมโพเนนต์เพิ่มเติมเช่นการแท็กแอฟฟินิตี้ ซึ่งทำให้การตรึงโป ตรวจสอบ และ/หรือฟอกหรือโปรตีนอาหารส่วน นอกจากนี้ โคดอนหยุดสามารถพักลำดับ บริเวณs เข้ารหัสไลโปคาลินหรือของมิวทีนและ phage capsid ยีนหรือ ชิ้นส่วนย่อยs ดังกล่าว โดยที่โคดอนการหยุด เช่นโคดอนเป็นสีเหลืองอำพันหยุด เป็นบางส่วนที่แปลเป็นกรดอะมิโนระหว่างแปลในต้องใช้ตัวป้องกันไฟเกินเหมาะ[0082] เช่น phasmid เวกเตอร์ pTLPC27 (ดู เช่น 20 รูปและเลขลำดับ ID: 9 เปอร์เซ็นต์พิมพ์ WO 2008/015239), หรือที่เรียกว่า pTlc27 สามารถใช้สำหรับการเตรียมของเข้าน้ำตามนุษย์ไลโปคาลินมิวทีนรี phagemid โมเลกุลกรดนิวคลีอิกประดิษฐ์รหัสสำหรับมิวทีนไลโปคาลินฉีกขาดอาจถูกแทรกลงในเวกเตอร์ใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในวิธีการที่เป็นแบบอย่างตามการเปิดเผยโมเลกุลกรดนิวคลีอิกเข้ารหัสไลโปคาลินนุนุมีเป้าหมายเอ็ดเพื่อการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งหรือมากกว่าของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26-34, 56-58, 80 , 83, 104-106 และ 108 ของเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (SEQ ID NO: 1) ในบางรุรุโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกเป็นอีกเป้าหมายเอ็ดเพื่อการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งหรือมากกว่าของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 61, 101, 111, 114 และ 153 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโป คาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย. [0073] หนึ่งในศูนย์รวมของการเปิดเผยวิธีการในการผลิตของที่มิวทีนของไลโปคาลินนุนุรวมถึงกรรมวิธีอย่างน้อย 2, 3, 4, 5 , 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 หรือของโคดอนของตำแหน่งใด ๆ ของลำดับกรดอะมิโน 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 และ 108 ของเชิงเส้น โพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย หนึ่งในศูนย์รวมทั้งหมด 18 ของโคดอนของอะมิโนลำดับกรดตำแหน่ง 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 และ 108 ของเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะมีการกลายพันธุ์. [0074] ในศูนย์รวมต่อไปของการเปิดเผยวิธีการให้เป็นไปตามการเปิดเผยรวมถึงการกลายพันธุ์ของทั้งสอง โคดอน s เข้ารหัสซิสเทอีนที่ตำแหน่ง 61 และ 153 ในเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของการฉีกขาดของมนุษย์ที่เป็นผู้ใหญ่ไลโปคาลิน (SEQ ID NO: 1) ในตำแหน่งศูนย์รวมหนึ่ง 61 กลายพันธุ์ในการเข้ารหัสอะลานีนที่ฟีนิลอะลานีนไลซีน, อาร์จินี, threonin, แอสพาราจีน, ไทโรซีน, เมไธโอนีน, ซีรีน, โพรลีนหรือทริปโตฟาน อีเรซิดิว, ชื่อเพียงความเป็นไปได้ไม่กี่ ใน embodiments ที่ตำแหน่ง 153 จะกลายพันธุ์เป็นกรดอะมิโนเช่นซีรีนหรืออะลานีนสามารถนำตำแหน่งที่ 153 [0075] ในศูนย์รวมของการเปิดเผยอีกตามที่อธิบายไว้ในเอกสารฉบับนี้ที่โคดอน s เข้ารหัสตำแหน่งลำดับกรดอะมิโน 111 และ / หรือ 114 ของเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะมีการกลายพันธุ์ในการเข้ารหัสเช่นอาร์จินีที่ตำแหน่ง 111 และทริปโตฟานอีที่ 114 ตำแหน่ง[0076] ศูนย์รวมอีก วิธีการของการเปิดเผยที่เกี่ยวข้องกับการก่อกลายพันธุ์ของโคดอนเข้ารหัสซิสเทอีนที่ตำแหน่ง 101 เส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยเพื่อที่ว่านี้ โคดอน encodes กรดอะมิโนอื่น ๆ หนึ่งในศูนย์รวมกลายพันธุ์โคดอนตำแหน่งเข้ารหัสถอดรหัส 101 ซีรีน ดังนั้นในบางรุรุทั้งสองหรือทั้งสามของซิสเทอีนโคดอน s ที่ 61 ตำแหน่ง 101 และ 153 จะถูกแทนที่ด้วยโคดอนของกรดอะมิโนอีก. [0077] ตามวิธีการของการเปิดเผยนั้น ไลโปคาลินมิวทีนได้เริ่มต้นจากการเข้ารหัสโมเลกุลกรดนิวคลีอิกไลโปคาลินนุนุ เช่นโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกเป็นเป้าหมายเอ็ดเพื่อการก่อกลายพันธุ์และนำเข้าสู่การเป็นเจ้าภาพแบคทีเรียหรือสิ่งมีชีวิต eukaryotic ที่เหมาะสมโดยวิธีการของเทคโนโลยีดีเอ็นเอ ได้รับห้องสมุดกรดนิวคลีอิกของไลโปคาลินมิวทีนสามารถดำเนินการได้โดยใช้เทคนิคที่เหมาะสมที่เป็นที่รู้จักกันในงานศิลปะการสร้างไลโปคาลินมิวทีนที่มีคุณสมบัติแอนติบอดีเหมือน iemuteins ที่มีแอ ฟฟินิตี้ที่มีต่อเป้าหมายที่กำหนด ตัวอย่างของวิธีการรวมกันดังกล่าวจะอธิบายในรายละเอียดในสิ่งพิมพ์ PCT WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005 / 019256, หรือ WO 2006/56464 เช่น เนื้อหาของแต่ละยื่นขอจดสิทธิบัตรเหล่านี้เป็นนิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นโดยการอ้างอิงในเอกสารฉบับนี้อย่างครบถ้วน หลังจากที่การแสดงออกของลำดับกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายเอ็ดเพื่อการก่อกลายพันธุ์ในพื้นที่ที่เหมาะสมโคลนแบกข้อมูลทางพันธุกรรมสำหรับส่วนใหญ่ของแต่ละไลโปคาลินมิวทีนซึ่งยึดเกาะเป็นเป้าหมายที่ได้รับสามารถ เลือกจากห้องสมุดที่ได้รับ เทคนิคที่รู้จักกันดี สามารถใช้สำหรับการเลือกของโคลนเหล่านี้เช่นการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์ (สอบทานในเคย์, BK, et al (1996) ข้างต้น. โลว์, HB (1997) ข้างต้นหรือ Rodi, ดีเจและ Makowski ลิตร (1999) ข้างต้น) การตรวจคัดกรองอาณานิคม (สอบทานใน Pini เอ et al. (2002) หวี. Chem. หน้าจอกำลังการผลิตสูง. 5, 503-510) จอแสดงผลไรโบโซม (สอบทานใน Amstutz พี et al. (2001) ฟี้ . Opin. Biotechnol. 12, 400-405) หรือจอแสดงผล mRNA รายงานในวิลสัน, et al, DS (2001) พร Natl Acad วิทย์ สหรัฐอเมริกา 98, 3750-3755 หรือวิธีการที่อธิบายเฉพาะใน WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005 / 019,256, หรือ WO 2006/56464. [0078] ส่งผลให้โมเลกุลของกรดนิวคลีเข้ารหัสหนึ่งหรืออื่น ๆ อีกมากมายไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจจะแสดงออกโดยใช้ระบบการแสดงออกที่เหมาะสม ที่ได้รับไลโปคาลินมิวทีนหรือไลโปคาลินมิวทีนสามารถเลือกต่อไป การเลือกตัวอย่างเช่นอาจจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขการแข่งขัน เงื่อนไขการแข่งขันตามที่ใช้ในที่นี้หมายความว่าการเลือกของไลโปคาลินมิวทีนบนโลกไซเบอร์อย่างน้อยหนึ่งขั้นตอนที่ไลโปคาลินมิวทีนและไม่ได้รับจากธรรมชาติลิแกนด์ของกว้าง พิมพ์ไลโปคาลินจะถูกนำในการติดต่อในที่ที่มีการเพิ่มเติมลิแกนด์ซึ่งแข่งขันกับผลผูกพันของมิวทีนที่จะลิที่ไม่ใช่ธรรมชาติเช่นแกนด์ นี้เพิ่มเติมลิแกนด์อาจจะเป็นลิสรีรวิทยาแกนด์ของเป้าหมายส่วนที่เกินจากเป้าหมายที่ตัวเองหรือคนอื่น ๆ ที่ไม่ใช่ทางสรีรวิทยาลิแกนด์ของเป้าหมายที่ยึดเกาะอย่างน้อยที่ทับซ้อนกันเอพิโทปกับเอพิโทปที่ ได้รับการยอมรับโดยมิวทีนของการเปิดเผยและทำให้เป็นอุปสรรคกับเป้าหมายที่มีผลผูกพันของมิวทีน อีกทางเลือกเพิ่มเติมลิแกนด์แข่งขันกับผลผูกพันของมิวทีนโดย complexing เอพิโทปที่แตกต่างจากที่มีผลผูกพันตำแหน่งของมิวทีนไปยังเป้าหมายโดยผลกระทบ allosteric. [0079] เป็นศูนย์รวมของการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์ เทคนิค (สอบทานในเคย์, BK, et al (1996), ข้างต้น. โลว์, HB (1997) ข้างต้นหรือ Rodi, ดีเจและ Makowski แอล (1999), ข้างต้น) โดยใช้พอสมควร Ml 3 ทำลายจุลินทรีย์จะได้รับเป็น ตัวอย่างของวิธีการเลือกที่สามารถได้รับการว่าจ้างในการเปิดเผยนี้ ศูนย์รวมของเทคโนโลยีการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์อื่นที่สามารถใช้สำหรับการเลือกของมิวทีนของการเปิดเผยเป็นเทคโนโลยี phage hyperphage ตามที่อธิบายไว้โดยพี่น้อง et al, (พี่น้อง, et al (2003) "การปรับปรุงการนำเสนอ Hyperphage แอนติบอดีในการแสดง phage.." วิธีการ Mal Biol 205:... 295-302) phage หนาวอื่น ๆ เช่นชั้นหรือทำลายจุลินทรีย์ lytic เช่น T7 อาจจะต้องใช้เช่นกัน สำหรับวิธีการเลือกที่เป็นแบบอย่าง Ml 3 phagemids มีการผลิตซึ่งจะช่วยให้การแสดงออกของการกลายพันธุ์ไลโปคาลินลำดับกรดนิวคลีอิกเป็นฟิวชั่นที่มีลำดับสัญญาณที่ N-ปลายทางเช่นลำดับ OMPA สัญญาณและมี โปรตีน capsid PIII ของ M13 phage หรือชิ้นส่วนย่อยของมันความสามารถในการที่จะถูกรวมอยู่ในcapsid ทำลายจุลินทรีย์ที่ C-ปลายทาง C-ขั้วชิ้นส่วนย่อย ~ PIII ของโปรตีน capsid ทำลายจุลินทรีย์ที่รวมถึงกรดอะมิโน 21 7-406 ลำดับชนิดป่าอาจจะใช้ในการผลิตโปรตีนฟิวชั่น หนึ่งในศูนย์รวม C-ขั้วชิ้นส่วนย่อยของ PIII ถูกนำมาใช้ในการที่ซิสเทอีนเรซิดิวที่ตำแหน่ง 201 จะหายไปหรือถูกแทนที่ด้วยกรดอะมิโนอีก. [0080] ดังนั้นศูนย์รวมต่อไปของ วิธีการของการเปิดเผยเกี่ยวกับการ operably หลอมรวมเป็นโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกเข้ารหัสสำหรับหนึ่งหรืออื่น ๆ อีกมากมายไลโปคาลินมิวทีนและเป็นผลมาจากการก่อกลายพันธุ์ที่ 3 'จบลงด้วยการเข้ารหัสยีนโปรตีนเสื้อ PIII ของ bacteriophage ใยของ ML3 ครอบครัวหรือสำหรับชิ้นส่วนย่อยของโปรตีนเสื้อนี้เพื่อที่จะเลือกอย่างน้อยหนึ่งในมิวทีนสำหรับการรวมของที่ได้รับลิแกนด์. [0081] โปรตีนฟิวชั่นอาจรวมถึงส่วนประกอบเพิ่มเติม เช่นแอฟฟินิตี้แท็กซึ่งจะช่วยให้การตรึงการตรวจสอบและ / หรือการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนฟิวชั่นหรือชิ้นส่วนของมัน นอกจากนี้หยุดโคดอนจะอยู่ระหว่างลำดับบริเวณ s เข้ารหัสไลโปคาลินหรือของมิวทีนและ capsid phage ยีนหรือชิ้นส่วนย่อยของมันโดยที่หยุดโคดอนเช่นอำพัน . หยุดโคดอนเป็นอย่างน้อยแปลบางส่วนเป็นกรดอะมิโนในระหว่างการแปลในสายพันธุ์ต้านที่เหมาะสม[0082] ตัวอย่างเช่น phasmid เวกเตอร์ pTLPC27 (ดูตัวอย่างเช่นรูปที่ 20 และ SEQ ID NO: 9 ของสิ่งพิมพ์ PCT WO 2008/015239) หรือที่เรียกว่า pTlc27 สามารถนำมาใช้ในการจัดทำห้องสมุด phagemid เข้ารหัสการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลินมิวทีน โมเลกุลของกรดนิวคลีสร้างสรรค์การเขียนโปรแกรมสำหรับการฉีกขาดไลโปคาลินมิวทีนอาจจะแทรกลงในเวกเตอร์ใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในวิธีการที่เป็นแบบอย่างตามการการเปิดเผย , กรดนิวคลีอิกโมเลกุลเป็นไลโปคาลินนุนุเข้ารหัสคือเป้าหมายเอ็ดการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งค็อคมากกว่าของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26-34 56-58 , 80 , 83 104-106 และ 108 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ( seq id : 1 )ในบางรุรุ , โมเลกุลของกรดนิวคลีอิก ต่อไปเป้าหมายเอ็ดการก่อกลายพันธุ์ที่หนึ่งค็อคมากกว่าของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่งที่ 61 , 101 , 111 , 114 และ 153 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย

[ 0073 ] หนึ่งในศูนย์รวมของการเปิดเผย ,วิธีการสำหรับรุ่นของมิวทีนของไลโปคาลินนุนุรวมถึง mutating อย่างน้อย 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 8 , 10 , 12 , 14 , 15 , 16 , 17 ของโคดอนค็อคของใด ๆของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26-34 56-58 , 80 , 83 104-106 และ 108 ของเส้นตรง โพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย . ในรูปร่างหนึ่งทั้งหมด 18 แห่ง โคดอนของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 56 , 57 , 58 ,
80 , 83 , 104 , 105 , 106 และ 108 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะกลายพันธุ์ .

[ 0074 ] ในศูนย์รวมของการเปิดเผยเพิ่มเติม ,วิธีที่ตามไปการเปิดเผยรวมถึงการกลายพันธุ์ของทั้งของโคดอน s เข้ารหัสซิสเทอีนที่ตำแหน่งและ 153 ในแบบเชิงเส้น โพลีเปปไทด์ลำดับของผู้ใหญ่ไลโปคาลินฉีกมนุษย์ ( seq id : 1 ) ในรูปร่างหนึ่งตำแหน่ง 61 จะกลายพันธุ์เพื่อเข้ารหัสเป็นอะลานีนฟีนิลอะลานีนกรดอะมิโนอาร์จินีน threonin แอสพาราจีน , , , ,ไทโรซีนเมไธโอนีน , เอนไซม์โพรลีนค็อคเป็นทริปโตฟาน E เรซิดิวเพื่อชื่อเพียงไม่กี่ ความเป็นไปได้ ใน embodiments ที่ตำแหน่งแต่จะกลายพันธุ์เป็นกรดอะมิโน เช่น เซรีนค็อคอะลานีนสามารถแนะนำที่ตำแหน่ง 153

[ 0075 ] อีกศูนย์รวมของการเปิดเผยตามที่อธิบายไว้ในที่นี้การโคดอนลำดับกรดอะมิโนของการเข้ารหัสตำแหน่งและ / หรือ 114 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยจะกลายพันธุ์การเข้ารหัสตัวอย่างเช่นเป็นอาร์จินีนที่ตำแหน่ง 111 และทริปโตฟาน E ที่ตำแหน่ง 114 .

[ 0076 ] อีกหนึ่งศูนย์รวมของวิธีการของการเปิดเผย ,เกี่ยวข้องกับการก่อกลายพันธุ์ของโคดอนที่ซิสเทอีนการเข้ารหัสที่ตำแหน่ง 101 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยดังนั้นโคดอนกรดอะมิโนนี้เข้ารหัสใด ๆอื่น ๆ ในรูปร่างหนึ่งโคดอนกลายพันธุ์การเข้ารหัสตำแหน่ง 101 encodes เป็นซีรี . ตามในบางรุรุทั้งสองค็อคทั้งสามของซิสเทอีนโคดอน s ที่ตำแหน่ง 61 , 101 และ 153 จะถูกแทนที่โดยโคดอนอื่นกรดอะมิโน

[ 0077 ] ตามวิธีการของการเปิดเผย , ไลโปคาลินมิวทีนได้เริ่มต้นจากโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกไลโปคาลินนุนุการเข้ารหัสเช่นกรดนิวคลีอิกโมเลกุลเป็นเป้าหมายเอ็ดการก่อกลายพันธุ์และแนะนำใน eukaryotic สิ่งมีชีวิตที่เหมาะสมแบคทีเรียค็อคโฮสต์โดยเทคโนโลยีรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอได้รับห้องสมุดกรดนิวคลีอิกของไลโปคาลินมิวทีนสามารถดําเนินการใช้เทคนิคที่เหมาะสมใด ๆที่เป็นที่รู้จักกันในศิลปะสำหรับการสร้างไลโปคาลินมิวทีนกับแอนติบอดี เช่น คุณสมบัติ คือ m.uteins ที่มีแอฟฟินิตี้ต่อให้เป้าหมาย ตัวอย่างของวิธีการดังกล่าวจะอธิบายในรายละเอียดในด้านสิ่งพิมพ์ 16873 wo 99 / ,00 / 75308 wo wo 03 / 03 / 029462 029471 wo wo
03 / 2005 / 019254 029463 wo wo wo / 019255 2005 , 2005 / 2006 / 56464 019256 ค็อค wo , ตัวอย่างเช่น เนื้อหาของแต่ละโปรแกรมเหล่านี้เป็นส่วนประกอบ โดยอ้างอิงสิทธิบัตรฉบับนี้อย่างครบถ้วน หลังจากการแสดงของกรดนิวคลีอิกลำดับที่เป้าหมายเอ็ดการก่อกลายพันธุ์ในโฮสต์ที่เหมาะสมโคลนแบกข้อมูลทางพันธุกรรมสำหรับจำนวนของแต่ละไลโปคาลินมิวทีนซึ่งยึดเกาะกำหนดเป้าหมายสามารถเลือกจากห้องสมุดได้ รู้จักเทคนิค สามารถใช้สำหรับการเลือกของโคลนเหล่านี้ เช่น ฟาแสดง ( ดูในเค , BK et al . ( 1996 ) ข้างต้น ; โลว์เมิน HB ( 1997 ) ข้างต้นโรดีค็อค , ดี. เจ.เมิกคอฟสกี้และ L . ( 2542 ) ข้างต้น ) , อาณานิคม ( ดูในการตรวจพินิ อ. et al . ( 2002 ) หวี เคมี หน้าจอ throughput สูง 5 , 503-510 ) , แสดงไรโบโซม ( ทบทวนแอมสตัตส์ , หน้า et al . ( 2001 ) curr . ระดม . biotechnol . 12 , 400-405 ) ค็อคอาจแสดงรายงานในวิลสัน , D.S . et al . ( 2001 ) proc . NATL . ราช . สภาวะโลกร้อน 98 ประเทศสหรัฐอเมริกา3750-3755 ค็อควิธีการเฉพาะที่อธิบายไว้ใน 99 / 16873 wo wo wo / 75308 00 , 03 / 03 / 029462 029471 wo wo
03 / 2005 / 019254 029463 wo wo wo 2005 / 2005 / 019255 019256 ค็อค , , wo 2006 / 56464


[ ] ผล 0078 กรดนิวคลีอิก โมเลกุลเข้ารหัสหนึ่งค็อคเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจจะแสดงออกด้วยท่าทางที่เหมาะสมใด ๆ ระบบ