Hedgehog signaling is critical for

Hedgehog signaling is critical for correct embryogenesis and tissue development. However, on matu-
ration, signaling is also found to be aberrantly activated in many cancers. Palmitoylation of the secreted
signaling protein sonic hedgehog (Shh) by the enzyme hedgehog acyltransferase (Hhat) is required for
functional signaling. To quantify this important posttranslational modification, many in vitro Shh pal-
mitoylation assays employ radiolabeled fatty acids, which have limitations in terms of cost and safety.
Here we present a click chemistry armed enzyme-linked immunosorbent assay (clickeELISA) for
assessment of Hhat activity through acylation of biotinylated Shh peptide with an alkyne-tagged pal-
mitoyl-CoA (coenzyme A) analogue. Click chemistry functionalization of the alkyne tag with azido-FLAG
peptide allows analysis through an ELISA protocol and colorimetric readout. This assay format identified
the detergent n-dodecyl b - D -maltopyranoside as an improved solubilizing agent for Hhat activity.
Quantification of the potency of RU-SKI small molecule Hhat inhibitors by clickeELISA indicated IC 50
values in the low- or sub-micromolar range. A stopped assay format was also employed that allows
measurement of Hhat kinetic parameters where saturating substrate concentrations exceed the binding
capacity of the streptavidin-coated plate. Therefore, clickeELISA represents a nonradioactive method for
assessing protein palmitoylation in vitro that is readily expandable to other classes of protein lipidation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เกมส์ทำอาหารตามปกติเป็นสิ่งสำคัญสำหรับพัฒนาเกิดเอ็มบริโอและเนื้อเยื่อที่ถูกต้อง อย่างไรก็ตาม ใน matu-อาหาร สัญญาณยังพบการเรียกใช้ aberrantly ในมะเร็งหลาย Palmitoylation ของที่ secretedสัญญาณเสียงทำโปรตีน (Shh) โดยเอนไซม์ทำ acyltransferase (Hhat) ต้องใช้ทำงานตามปกติ วัดปริมาณนี้สำคัญ posttranslational แก้ไข หลายใน Shh พาล-mitoylation assays จ้าง radiolabeled กรดไขมัน ซึ่งมีข้อจำกัดในด้านต้นทุนและความปลอดภัยที่นี่เรานำเสนอเป็นคลิเคมีอาวุธเอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay (clickeELISA) สำหรับการประเมินกิจกรรม Hhat ผ่านอย่างไร acylation ของเพปไทด์ Shh biotinylated และการติดแท็กแอลไคน์พาลอนาล็อก mitoyl-CoA (coenzyme A) คลิ functionalization เคมีของแอลไคน์ป้ายด้วยค่าสถานะ azidoเพปไทด์ได้วิเคราะห์ผ่าน ELISA การโพรโทคอลและเทียบเคียง readout รูปนี้ทดสอบที่ระบุตัว n dodecyl ผงซักฟอก b - D - maltopyranoside เป็นตัวแทน solubilizing ปรับปรุงกิจกรรม Hhatนับจำนวนสกี RU โมเลกุลเล็ก Hhat inhibitors โดย clickeELISA ระบุ IC 50ค่าในช่วงต่ำ - หรือย่อย-micromolar รูปทดสอบหยุดยังถูกจ้างที่ช่วยให้วัด Hhat พารามิเตอร์เดิม ๆ ที่ saturating พื้นผิวความเข้มข้นเกินการรวมความจุของแผ่นเคลือบ streptavidin ดังนั้น clickeELISA แสดงวิธีการ nonradioactiveประเมินโปรตีน palmitoylation ในที่พร้อมขยายได้ถึงชั้นอื่น ๆ ของโปรตีน lipidation

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การส่งสัญญาณเม่นเป็นสิ่งสำคัญสำหรับ embryogenesis ที่ถูกต้องและการพัฒนาเนื้อเยื่อ อย่างไรก็ตามเมื่อวันที่ matu-
ปันส่วนสัญญาณนอกจากนี้ยังพบว่ามีการเปิดใช้งาน aberrantly ในมะเร็งหลายชนิด Palmitoylation
หลั่งของสัญญาณโปรตีนเม่นโซนิค(Shh) โดยเอนไซม์เม่น acyltransferase (ที่ Hhat)
เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการส่งสัญญาณการทำงาน ที่จะหาจำนวนดัดแปลงหลังนี้สำคัญจำนวนมากในหลอดทดลอง Shh pal-
ตรวจ mitoylation จ้างกรดไขมัน radiolabeled ซึ่งมีข้อ จำกัด ในแง่ของค่าใช้จ่ายและความปลอดภัย.
ที่นี่เรานำเสนอคลิกอาวุธเคมีเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (clickeELISA)
สำหรับการประเมินของกิจกรรมHhat ผ่าน acylation ของไบโอตินเปปไทด์ที่มี Shh alkyne ติดแท็ก pal-
mitoyl-CoA (โคเอนไซม์ A) อะนาล็อก คลิก functionalization คุณสมบัติทางเคมีของแท็ก alkyne กับ azido-FLAG
เปปไทด์ช่วยให้การวิเคราะห์ผ่านโปรโตคอลวิธี ELISA และอ่านข้อมูลสี รูปแบบการทดสอบนี้ระบุผงซักฟอก n-โดเดซิลข. - D -maltopyranoside เป็นตัวแทนละลายที่ดีขึ้นสำหรับกิจกรรม Hhat ปริมาณความแรงของ RU-SKI โมเลกุลขนาดเล็กยับยั้ง Hhat โดย clickeELISA ที่ระบุ IC 50 ค่าในระดับต่ำหรือย่อย micromolar ช่วง . รูปแบบการทดสอบหยุดยังเป็นลูกจ้างที่ช่วยให้การวัดค่าพารามิเตอร์การเคลื่อนไหว Hhat ที่ saturating ความเข้มข้นสารตั้งต้นที่มีผลผูกพันเกินกว่าความจุของแผ่นstreptavidin เคลือบ ดังนั้น clickeELISA แสดงให้เห็นถึงวิธีการ nonradioactive สำหรับการประเมินpalmitoylation โปรตีนในหลอดทดลองที่มีความพร้อมที่จะขยายชั้นเรียนอื่น ๆ ของโปรตีน lipidation

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ส่งสัญญาณเม่นเป็นอย่างถูกต้องและพัฒนาเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ อย่างไรก็ตาม มาตุ -
ส่วน สัญญาณก็พบว่าเป็น aberrantly ใช้ในมะเร็งหลายชนิด palmitoylation ของหลั่ง
ส่งสัญญาณโปรตีนโซนิคเม่น ( จุ๊ ) โดยเอนไซม์เม่น acyltransferase ( hhat ) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ
หน้าที่ส่งสัญญาณ ที่มีการปรับเปลี่ยน posttranslational นี้สำคัญหลายในหลอดทดลอง . PAL -
mitoylation ) จ้าง radiolabeled กรดไขมัน ซึ่งมีข้อจำกัดในแง่ของต้นทุนและความปลอดภัย .
ที่นี่เราเสนอคลิกเคมีติดอาวุธ enzyme-linked immunosorbent assay ( clickeelisa )
การประเมิน hhat กิจกรรมสำคัญของไลว์เปปไทด์ที่มีอัลไคน์แท็กเพื่อน -
mitoyl COA ( Coenzyme ) อนาล็อก .คลิก functionalization เคมีของอัลไคน์กับ azido แท็กธง
เปปไทด์ช่วยให้วิเคราะห์โปรโตคอลและผ่านวิธี Colorimetric รุก . รูปแบบนี้ใช้ระบุ
ผงซักฟอก n-dodecyl B - D - maltopyranoside เป็นแนวทางการศึกษา ตัวแทนของกิจกรรม hhat .
ปริมาณของความแรงของ ru-ski โมเลกุลเล็ก hhat inhibitors โดย clickeelisa พบ IC 50