Lipase activity was measured employ

Lipase activity was measured employing using triolein (specific
radioactivity: 80e120 mCi mmol1) (PerkineElmer, Boston, MA,
USA) as substrate. Reactions were carried out at 35 C in a 0.5 ml
reaction mixture consisting 80 mM malic acid/MES/Tris (MMT)
buffer, 2 mM DTT, 0.1% Triton X-100, 2% gum Arabic, 0.2 mM [14C]
triolein (pH 5). The concentration of the proteins in each assay
was approximately 200 mg/ml1. For activity measurements, the
substrate was emulsified in 5% [w/v] gum Arabic, under intense
vortexing, immediately before use. Lipase activity was evaluated
following the radiolabeled oleic acid production essentially
according to method of the liquideliquid partition system
described by Belfrage and Vaughan [4]. Aliquots (60 ml) were taken
from the reaction mixture at different times up to 4 h of incubation.
Reactions were stopped by the addition of 1 ml of chloroform:
methanol: heptane (1.25:1.41:1, v/v/v), 15.5 ml of 0.2 M NaOH,
150 mM NaCl. The mixture was vortexed and centrifuged for 5 min
at 10,000g. A 0.1 ml aliquot of the methanol-water upper phase,
was removed and subjected to liquid scintillation counting. The
activity was calculated from kinetic measurements based on at
least 5 values collected over 3 h of incubation.
To determine the optimum pH of the reaction, assay of lipase
activity were carried out using the MMT buffer at pH 3e9. MMT
buffer was obtained by mixing DL-malic acid, MES and Tris base in
the molar ratios 1:2:2. The pH was adjusted to 3 by adding the
appropriate amount 10 M HCl, the pH 9 adding the appropriate
amount 10 M NaOH. A wide variety of pH values in the 3e9 pH
range was reached by mixing high and low pH stock solutions.
Blank reaction with inactivated proteins (heated at 100 C for
15 min) was used as control. The control value was subtracted from
the actual assay value. The activity was expressed in nmol of oleic
acid released per hour per mg of total proteins.
All reagents and chemicals used for lipase activity determination
were obtained from SigmaeAldrich (St. Louis, MO, U.S.A.).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสที่วัดใช้ใช้ (เฉพาะ trioleinradioactivity: 80e120 mCi mmol 1) (PerkineElmer, Boston, MAสหรัฐอเมริกา) เป็นพื้นผิว ปฏิกิริยาได้ดำเนินการใน 35 C ในมล 0.5ส่วนผสมปฏิกิริยาที่ประกอบด้วย 80 mM กรด malic/MES/ตรี (MMT)บัฟเฟอร์ 2 มม. DTT, 0.1% ไตรตั้น X-100 อาหรับเหงือก 2%, 0.2 mM [14 C]triolein (pH 5) ความเข้มข้นของโปรตีนในการทดสอบแต่ละมีประมาณ 200 มิลลิกรัม/มล. 1 สำหรับการประเมินกิจกรรม การพื้นผิวถูก emulsified ใน 5% [w/v] หมากฝรั่งอาหรับ ภายใต้รุนแรงvortexing ทันทีก่อนใช้ มีประเมินกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสต่อการผลิต radiolabeled oleic กรดเป็นตามวิธีของ liquideliquid พาร์ติชันระบบอธิบาย โดย Belfrage และวอน [4] ที่ถ่าย aliquots (60 มล.)จากปฏิกิริยา ที่แตกต่างกันที่ส่วนผสมเวลาฟักตัวถึง 4 hปฏิกิริยาได้ถูกหยุด โดยการเพิ่ม 1 ml ของคลอโรฟอร์ม:เมทานอล: heptane (1.25:1.41:1, v/v/v) 15.5 มล.ของ 0.2 M NaOH150 mM NaCl ส่วนผสมคือ vortexed และ centrifuged ใน 5 นาทีที่ 10000 กรัม ส่วนลงตัว 0.1 ml ของระยะบนเมทานอลน้ำscintillation เหลวเอาออกไป และการตรวจนับได้ ที่มีคำนวณกิจกรรมจากวัดเดิม ๆ ตามที่ค่าน้อยที่สุด 5 รวบรวมกว่า 3 h ของคณะทันตแพทยศาสตร์การกำหนดค่า pH ที่เหมาะสมของปฏิกิริยา การทดสอบของเอนไซม์ไลเปสกิจกรรมที่ดำเนินการใช้บัฟเฟอร์ MMT ที่ pH 3e9 MMTบัฟเฟอร์ได้รับ โดยการผสมกรด DL malic, MES และทริสเรทติ้งพื้นฐานในthe molar ratios 1:2:2. The pH was adjusted to 3 by adding theappropriate amount 10 M HCl, the pH 9 adding the appropriateamount 10 M NaOH. A wide variety of pH values in the 3e9 pHrange was reached by mixing high and low pH stock solutions.Blank reaction with inactivated proteins (heated at 100 C for15 min) was used as control. The control value was subtracted fromthe actual assay value. The activity was expressed in nmol of oleicacid released per hour per mg of total proteins.All reagents and chemicals used for lipase activity determinationwere obtained from SigmaeAldrich (St. Louis, MO, U.S.A.).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กิจกรรมเอนไซม์ไลเปสวัดการจ้างงานโดยใช้ triolein
(เฉพาะกัมมันตภาพรังสี: 80e120 มิลลิมิลลิโมล 1) (PerkineElmer, บอสตัน,
สหรัฐอเมริกา) เป็นสารตั้งต้น ปฏิกิริยาได้ดำเนินการที่ 35 องศาเซลเซียสใน 0.5
มิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย80 มิลลิมาลิกกรด / MES / ทริส (MMT)
บัฟเฟอร์ 2 มิลลิ DTT, 0.1% Triton X-100, 2% เหงือกอาหรับ, 0.2 มิลลิ [14C]
triolein (pH 5) ความเข้มข้นของโปรตีนในแต่ละการทดสอบที่ประมาณ 200 mg / ml 1
สำหรับการตรวจวัดกิจกรรมที่พื้นผิวถูก emulsified ใน 5% [w / v] เหงือกอาหรับภายใต้รุนแรง vortexing ทันทีก่อนการใช้งาน กิจกรรมเอนไซม์ไลเปสได้รับการประเมินผลดังต่อไปนี้การผลิตกรดโอเลอิก radiolabeled หลักตามวิธีการของระบบพาร์ทิชัน liquideliquid อธิบายโดย Belfrage และวอห์น [4] aliquots (60 มล.) ถูกนำมาจากผสมปฏิกิริยาในช่วงเวลาที่แตกต่างกันถึง4 ชั่วโมงของการบ่ม. ปฏิกิริยาถูกหยุดโดยนอกเหนือจาก 1 มิลลิลิตรของคลอโรฟอร์ม: เมทานอล: heptane (1.25: 1.41: 1, v / v / v), 15.5 มล. 0.2 M NaOH, 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ ส่วนผสมที่ถูกการ vortex และปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่10,000? กรัม 0.1 มล. หารของเมทานอลน้ำขั้นตอนบนที่จะถูกลบออกและยัดเยียดให้นับประกายของเหลว กิจกรรมที่คำนวณได้จากการวัดการเคลื่อนไหวอยู่บนพื้นฐานที่ไม่น้อยกว่า 5 ค่ารวบรวมกว่า 3 ชั่วโมงของการบ่ม. เพื่อตรวจสอบค่า pH ที่เหมาะสมของปฏิกิริยาการทดสอบของเอนไซม์ไลเปสกิจกรรมที่ได้ดำเนินการโดยใช้บัฟเฟอร์MMT ที่ pH 3e9 MMT บัฟเฟอร์ที่ได้รับโดยการผสมกรด DL-malic, mes และฐานทริสในอัตราส่วนโดยโมล1: 2: 2 ค่า pH ที่มีการปรับถึง 3 โดยการเพิ่มปริมาณที่เหมาะสม10 M HCl ที่ pH 9 เพิ่มที่เหมาะสมจำนวน10 M NaOH ความหลากหลายของค่า pH ในค่า pH 3e9 ช่วงก็มาถึงโดยการผสมค่าความเป็นกรดสูงและต่ำโซลูชั่นหุ้น. ปฏิกิริยากับโปรตีนที่ว่างเปล่าการใช้งาน (ความร้อนที่ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา15 นาที) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม มูลค่าการควบคุมที่ถูกหักออกจากค่าการทดสอบที่เกิดขึ้นจริง กิจกรรมที่ได้รับการแสดงใน nmol ของโอเลอิกกรดปล่อยออกมาต่อชั่วโมงต่อมิลลิกรัมโปรตีนรวม. สารเคมีทั้งหมดและสารเคมีที่ใช้สำหรับการกำหนดกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสที่ได้รับจาก SigmaeAldrich (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กิจกรรมของเอนไซม์ถูกวัดการใช้ไตรโอลี น ( เฉพาะ
กัมมันตภาพรังสี : 80e120 MCI mmol  1 ) ( perkineelmer , Boston , MA ,
USA ) เป็นสับสเตรท ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นใน 3  C ใน 0.5 ml
ปฏิกิริยาผสม 80 มม. ประกอบด้วยกรด malic / mes / ทริส ( MMT )
บัฟเฟอร์ , 2 มม. ส่วน 0.1% Triton X-100 , หมากฝรั่ง 2% ภาษาอาหรับ , 0.2 มม. [ 14c ]
ไตรโอลี น ( pH 5 ) ความเข้มข้นของโปรตีนในแต่ละการทดสอบ
ประมาณ 200 mg / ml  1 สำหรับการวัดกิจกรรม
( ถูกใช้ใน 5 % [ w / v ] หมากฝรั่งอาหรับภายใต้เข้ม
vortexing ทันทีก่อนที่จะใช้ กิจกรรมของเอนไซม์ถูกประเมิน
ต่อไปนี้ radiolabeled กรดโอเลอิก การผลิตเป็นหลัก
ตามวิธีของ liquideliquid พาร์ติชันระบบและอธิบายโดย belfrage
วอห์น [ 4 ] เฉยๆ ( 60 มล. ) ถ่าย
จากปฏิกิริยาของส่วนผสมในเวลาที่ต่างกันถึง 4 ชั่วโมง 1 .
ปฏิกิริยาหยุดเพิ่ม 1 มิลลิลิตรของคลอโรฟอร์ม : เมทานอล : เฮปเทน ( 1.25:1.41:1
V / V / V ) 15.5 มล. 0.2 M NaOH
ขนาด 150 มม. ส่วนผสม vortexed ไฟฟ้า 5 นาที
ที่ 10 , 000  กรัมเป็นส่วนลงตัวของเมธานอล 0.1 มิลลิลิตร น้ำบนเฟส
ถูกเอาออก และต้องเหลวข้อมูลนับ
กิจกรรมที่คำนวณได้จากการวัดตัวยึดที่
5 ค่าเก็บมากกว่า 3 ชั่วโมง 1 .
หา pH ที่เหมาะสมของปฏิกิริยาของเอนไซม์ด้วยวิธีกิจกรรม
ทดลองโดยใช้ MMT บัฟเฟอร์ pH 3e9 . MMT
บัฟเฟอร์ได้โดยการผสมกรดมาลิก ( MES กับทริสฐาน
อัตราส่วนโมล 1:2:2 . ปรับ pH 3 โดยเพิ่มปริมาณที่เหมาะสม 10
M HCl ,พีเอช 9 เพิ่มปริมาณที่เหมาะสม
10 M NaOH ความหลากหลายของค่า pH ในช่วง pH
3e9 มาถึงโดยการผสมสูงและโซลูชั่นหุ้น pH ต่ำ .
ว่างปฏิกิริยากับโปรตีน ( ซึ่งใช้อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที 
) ใช้ควบคุม ค่าควบคุมหักออกจาก
ค่าการทดสอบที่เกิดขึ้นจริง กิจกรรมที่ถูกแสดงในโอลิอิก
?กรดออกต่อชั่วโมงต่อมิลลิกรัมโปรตีนทั้งหมด
สารเคมีและสารเคมีที่ใช้ไลเปสความมุ่งมั่น
ได้จาก sigmaealdrich ( St . Louis , MO , USA )