after PCR we depleted the template

after PCR we depleted the template plasmid by digesting it with 10 U of DpnI (New
England Biolabs, Ipswich, MA, USA) for 1 h in the same buffer used for the PCR. Restriction
endonucleases PvuII, EcoRI and HindIII were purchased from New England Biolabs (Ipswich,
MA, USA) and used according to manufacturer’s instructions.
Fig 1. Schematic view of recombinational cloning and the influence of inserts and vector stoichiometry and quantity. (A) The plasmid pUC19 was
linearized by PCR using the primers pUC3Bf and pUC3Br, which contained short 50 overhangs (red) matching both ends of the fragment 3B. In parallel, the S.
japonicus genomic region 3B was amplified by PCR using the primers 3Bf and 3Br, specifying 50 short appendages (blue) overlapping the pUC19 vector
ends. After gel-purification, vector and fragments were mixed and co-transformed in E. coli. Sequence tracts of 20 bp shared by the vector and fragment were
substrates for a homologous recombination reaction resulting in the plasmid p3B. (B) E. coli competent cells were transformed with a fixed amount of 100 ng
of the linear pUC19 vector mixed with a variable stoichiometric amount of the fragment 3B. The colony numbers related to each stoichiometric rate represent
an average of three independent transformations. (C) Given a fixed insert to vector stoichiometric rate of 2:1, increasing amounts of the pUC19 vector was
co-transformed with a proportional quantity of the fragment 3B. The average colony numbers found after each transformation assay (performed in triplicates)
were plotted (red). During each cloning assay, competent cells were transformed with the pUC19 vector alone to assess the background of empty vectors
(blue).
doi:10.1371/journal.pone.0119221.g001
Cloning by Homologous Recombination in Escherichia coli
PLOS

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลังจาก PCR เราพร่อง plasmid แม่ โดย digesting กับ 10 U ของ DpnI (ใหม่Biolabs อังกฤษ อิปสวิช MA, USA) สำหรับ 1 h ในบัฟเฟอร์เดียวใช้สำหรับ PCR ข้อจำกัดซื้อจากนิวอิงแลนด์ Biolabs (อิปสวิช endonucleases PvuII, EcoRI และ HindIIIMA, USA) และใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิตฟิก 1 ดูมัน recombinational โคลนและอิทธิพลแทรก stoichiometry เวกเตอร์ และปริมาณ (A มี plasmid pUC19)เป็นเส้นตรง โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ pUC3Bf และ pUC3Br ซึ่งมีอยู่เพียง 50 overhangs (สีแดง) ตรงปลายทั้งสองของ 3B ส่วน พร้อมกัน ได้3B ภูมิภาค genomic japonicus ถูกขยาย โดย PCR โดยใช้ไพรเมอร์ 3Bf และ 3Br ระบุ appendages สั้น 50 (สีน้ำเงิน) เวกเตอร์ pUC19 ที่ทับซ้อนสิ้นสุดการ หลังจากเจฟอก เวกเตอร์และบางส่วนของที่ผสม แล้วเปลี่ยนร่วมใน E. coli ลำดับรามิด 20 bp โดยเวกเตอร์และส่วนที่ใช้ร่วมกันได้พื้นผิวสำหรับปฏิกิริยา homologous recombination ที่เกิด plasmid p3B (ข) E. coli อำนาจเซลล์ถูกแปลง ด้วยยอดเงินคงที่ 100 ngของเวกเตอร์เชิง pUC19 ผสมกับการผันแปร stoichiometric จำนวน 3B ส่วน อาณานิคมหมายเลขที่เกี่ยวข้องกับแต่ละอัตรา stoichiometric แทนค่าเฉลี่ยสามแปลงอิสระ (ค) ให้แทรกเป็นถาวรเวกเตอร์ stoichiometric อัตรา 2:1 การเพิ่มจำนวนของ pUC19 เป็นเวกเตอร์ปริมาณสัดส่วนของ 3B ส่วนร่วมแตกต่างกัน หมายเลขฝูงเฉลี่ยที่พบหลังจากการทดสอบแต่ละแปลง (ดำเนินการใน triplicates)มีพล็อตจุดไว้ (สีแดง) ในระหว่างการทดสอบแต่ละ cloning เซลล์อำนาจถูกแปลงกับเวกเตอร์ pUC19 คนเดียวหาเบื้องหลังของเวกเตอร์ว่าง(สีฟ้า)doi:10.1371/journal.pone.0119221.g001โคลนจาก Homologous Recombination ใน Escherichia coliPLOS

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลังจากตรวจเราหมดแม่แบบพลาสมิดโดยย่อยมันกับ 10 U ของ dpni ( ใหม่
อังกฤษ biolabs อิปสวิช , MA , USA ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในเดียวกัน บัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับ PCR จำกัด
สงบเงียบ pvuii , EcoRI และ - ซื้อมาจากอังกฤษ biolabs ( อิปสวิช
MA , USA ) และใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
กอก 1ดูแผนผังของการโคลน recombinational และอิทธิพลของแทรก และปริมาณสัมพันธ์เวกเตอร์และปริมาณ ( ก ) puc19 พลาสมิดด้วยวิธี PCR โดยใช้ primers
ช่วง puc3bf และ puc3br ซึ่งมีอยู่สั้น 50 ยื่น ( สีแดง ) การจับคู่ทั้งสองปลายของชิ้นส่วนที่ 3B ในขนาน , S .
japonicus จีโนมภูมิภาค 3B ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ และ 3br 3bf ,กำหนด 50 appendages สั้น ( สีฟ้า ) puc19 เวกเตอร์
สิ้นสุดที่ทับซ้อนกัน หลังจากเจลฟอกเวกเตอร์และชิ้นส่วนผสม Co เปลี่ยนใน E . coli ลำดับ 20 BP จำนวนมากร่วมกันโดยมีพื้นผิวเวกเตอร์และชิ้นส่วนสำหรับการเปรียบเทียบ
ปฏิกิริยาที่เกิดใน p3b พลาสมิด ( B ) E . coli มีเซลล์ถูกเปลี่ยนด้วยจำนวน 100 ng
ของเวกเตอร์ puc19 เชิงเส้นตัวแปรอัตราส่วนผสมกับปริมาณของชิ้นส่วนที่ 3B . อาณานิคมหมายเลขที่เกี่ยวข้องกับแต่ละอัตราส่วนเท่ากันแทน
เฉลี่ย 3 แปลงที่เป็นอิสระ ( ค ) ได้รับการแก้ไขแทรกอัตรา 2 : 1 อัตราส่วนเวกเตอร์ , ปริมาณที่เพิ่มขึ้นของ puc19 เวกเตอร์คือ
Co แปลง ด้วยปริมาณสัดส่วนของส่วนห้อง 3Bตัวเลขเฉลี่ยที่พบหลังจากแต่ละการเปลี่ยนแปลงในอาณานิคม ( ทำ 3 ซ้ำ )
) วางแผน ( สีแดง ) ในแต่ละการตรวจสอบเซลล์สามารถถูกเปลี่ยนด้วย puc19 เวกเตอร์คนเดียวเพื่อประเมินพื้นหลังของเวกเตอร์ที่ว่างเปล่า ( สีฟ้า )
.
ดอย : 10.1371 / วารสาร โผน . 0119221 . โคลน g001
โดยการเปรียบเทียบใน Escherichia coli
PLoS