N/h via a programmable syringe pump

N/h via a programmable syringe pump (BS-9000 Multi-
Phaser, Braintree Scientific Inc., Braintree, MA). The
15N15N-urea solution was prepared using sterile techniques
in a laminar flow hood by combining 3.6 g of
15N15N-urea (99%, Medical Isotopes Inc., Pelham, NH)
with 1 L of sterile saline solution (0.9% NaCl). The
solution was passed through a 0.22-μm filter (Sterivex,
Millipore Corporation, Billerica, MA) into a sterilized
glass container. A sterilized rubber septum was crimped
onto the container after filtration, and the solution was
stored at 4°C until use. The 15N15N-urea solution was
prepared immediately before infusion for each period.
Diets were sampled (100 g/d) as they were weighed,
and samples were frozen (−20°C). If any orts were
present, they were removed at 0455 h daily, weighed,
and frozen (−20°C). Collection vessels for urine and
feces were removed at 0530 h daily and weighed. Urine
samples were mixed thoroughly, and then 1% of daily
output was sampled and frozen. At the same time, a
representative portion of urine was mixed with 0.05 M
H2SO4 (1 part urine with 4 parts H2SO4) such that
the final solution weight was equal to 1% of the daily
urinary output and was frozen for analysis of urinary
purine derivatives and creatinine. Fecal samples were
mixed thoroughly by hand, and 5% was sampled and
frozen. Samples of feces and urine from d 10 through
13 were pooled by steer and used to measure N balance.
Feed and ort samples collected from d 9 through
12 corresponded to urine and fecal samples collected
from d 10 through 13. Urine and fecal samples used for
15N determinations were samples from the total daily
collection from d 10 for measuring background 15N and
samples from the total daily collection from d 13 for
measuring enriched amounts of 15N. Urine (100 mL)
and wet feces (470 mL) were sampled and subsequently
frozen (−20°C) for analysis of 15N enrichments. At the
same times, 20 mL of urine was diluted with 80 mL of
0.05 M H2SO4 and frozen (−20°C) for analysis of 15N
enrichment of purine derivatives.
On d 14 of each period, ruminal bacterial samples
were collected for measurement of 15N enrichment. Approximately
400 mL of ruminal digesta was collected
from the dorsal and ventral rumen through the ruminal
cannula 1, 3, 5, 7, 9, and 11 h after feeding. The
digesta was immediately strained through 4 layers of
cheesecloth, and the liquid portion was analyzed for
pH. Immediately, 10 mL of strained ruminal fluid was
mixed with 1 mL of 6 M HCl and frozen at −20°C for
analysis of ruminal NH3. Another 8 mL of the strained
ruminal fluid was mixed with 2 mL of 25% (wt/wt)
metaphosphoric acid and frozen at −20°C for analysis
of ruminal VFA. The remaining strained ruminal fluid
and ruminal contents were blended (1 min; NuBlend,
Waring Commercial, Torrington, CT) with 0.5 L of saline
solution (0.9% NaCl) to isolate ruminal bacteria.
After blending, the liquid fraction isolated by filtration
through 4 layers of cheesecloth was immediately frozen
(−20°C) and the remaining particulate matter was replaced
in the rumen. On d 14, approximately 300 mL
of duodenal digesta was collected from the duodenal
cannula 1, 3, 5, 7, 9, and 11 h after feeding and frozen
(−20°C).
Laboratory Analyses
Within period, feed samples were pooled across day
on an equal weight basis. Ort samples were composited
by steer within period. Feed and ort samples and
subsamples of feces were dried at 55°C in a forced-air
oven for 72 h, air-equilibrated for 24 h, and weighed to
determine partial DM. Duodenal digesta samples were
freeze-dried. Once dried, all samples were ground to
pass a 1-mm screen (Thomas-Wiley Laboratory Mill
Model 4, Thomas Scientific USA, Swedesboro, NJ).
The DM of feed, ort, fecal, and duodenal samples was
determined by drying for 24 h at 105°C in a forcedair
oven. The OM was determined by ashing for 8 h
in a muffle oven at 450°C. The N content of feed, ort,
duodenal digesta, wet feces, and urine samples was
determined by combustion (Nitrogen Analyzer Model
FP-2000, Leco Corporation, St. Joseph, MI), and CP
was calculated as N × 6.25. Chromium concentration of
fecal and duodenal samples was determined by atomic
absorption after samples were prepared as described
by Williams et al. (1962). Ruminal bacteria were isolated
by thawing samples of ruminal contents and then
centrifuging samples at 500 × g for 20 min at 4°C. Supernatants
were centrifuged at 20,000 × g for 20 min
at 4°C to form a bacterial pellet. The pellet was resuspended
with saline (0.9% NaCl) and centrifuged again
at 20,000 × g for 20 min at 4°C. The bacterial pellets
were frozen and freeze-dried.
Concentrations of allantoin, uric acid, and creatinine
were determined in pooled (d 10 to 13) urine samples
by reverse-phase HPLC (adapted from Shingfield and
Offer, 1999). Samples were analyzed on a Hewlett-
Packard 1050 Ti-Series liquid chromatography system
(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipped with an
UV-visible detector set at 218 nm (Acutect 500 UV/
VIS, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)
and autosampler (AS 1000 SpectraSYSTEM, Thermo
Fisher Scientific Inc.). Separation of the sample components
was achieved with a 5-μm Discovery BIO Wide
Pore C18 column (250 × 4.6 mm i.d., Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO) with a 5-μm Discovery BIO Wide Pore
C18 (20 × 4.6 mm i.d., Sigma-Aldrich) guard column.
The mobile phase was prepared by dissolving 1.01 g
of sodium 1-heptane sulfonic acid and 0.86 g of ammonium
phosphate into 1 L of deionized H2O with 35
mL of methanol and 70 μL of triethylamine added. The
pH was adjusted to 3.2 with HCl, and the entire solution
was filtered (0.45-μm Magna-R, MSI, Westboro,
MA) and degassed with He. Urine samples were diluted
to be within the linear range of the standards (20:1)
with a diluent that was prepared by dissolving 0.86 g of
ammonium phosphate and 1.01 g of sodium 1-heptane
sulfonic acid into 1 L of H2O (pH adjusted to 2.1 with
HCl). Diluted samples were filtered (0.45-μm Syringe

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

N/h ผ่านปั๊มเข็มโปรแกรม (BS-9000 หลาย-Phaser, Inc. วิทยาศาสตร์ลดี้ลดี้ MA) ที่โซลูชั่น 15N15N urea ถูกเตรียมโดยใช้เทคนิคการฆ่าเชื้อในฮูด laminar กระแสโดยรวม 3.6 g ของ15N15N-urea (99% แพทย์ไอโซโทป Inc. เพลแฮม เอ็น)กับ 1 ลิตรใส่น้ำเกลือ (0.9% NaCl) ที่โซลูชั่นได้ผ่านตัว$ 0.22-μm (Sterivexมากบริษัท Billerica, MA) เป็นการ sterilizedคอนเทนเนอร์แก้ว Septum sterilized ยางถูก crimpedลงในภาชนะกรอง และการแก้ปัญหาได้เก็บที่ 4° C จนกว่าจะใช้ โซลูชั่น 15N15N ureaเตรียมทันทีก่อนคอนกรีตสำหรับแต่ละรอบระยะเวลาอาหารพวกเขามีน้ำหนัก ตัวอย่าง (100 g/d) ได้และตัวอย่างถูกแช่แข็ง (−20 ° C) ถ้า orts ใด ๆปัจจุบัน พวกเขาถูกเอาออกที่ 0455 h วัน น้ำหนักและแช่แข็ง (−20 ° C) รวบรวมเรือสำหรับปัสสาวะ และอุจจาระได้ถูกเอาออกที่ 0530 h ทุกวัน และชั่งน้ำหนัก ปัสสาวะตัวอย่างถูกผสมอย่างละเอียด แล้ว 1% ของทุกวันผลลัพธ์ตัวอย่าง และแช่แข็ง ในเวลาเดียวกัน การส่วนพนักงานของปัสสาวะถูกผสมกับ 0.05 Mกำมะถัน (ปัสสาวะส่วนที่ 1 กับ 4 ส่วนกำมะถัน) ที่โซลูชั่นสุดท้ายรับน้ำหนักได้เท่ากับ 1% ของทุกวันท่อปัสสาวะออก และถูกแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ของท่อปัสสาวะตราสารอนุพันธ์ purine และ creatinine มีตัวอย่าง fecalผสมทำ ด้วยมือ และ 5% เป็นตัวอย่าง และแช่แข็ง ตัวอย่างอุจจาระและปัสสาวะจาก d 10 ผ่าน13 ถูกทางถูกพู โดยคัดท้าย และใช้วัดดุล Nรวบรวมตัวอย่างอาหารและ ort จาก d 9 ผ่าน12 corresponded การปัสสาวะและตัวอย่าง fecal รวบรวมจาก d 10 ถึง 13 ปัสสาวะและตัวอย่าง fecal ใช้สำหรับ15N determinations มีตัวอย่างจากทุกวันรวมคอลเลกชัน d 10 วัดพื้น 15N และตัวอย่างจากการเก็บรวบรวมทุกวันจาก d 13 สำหรับวัดอุดมจำนวน 15N ปัสสาวะ (100 มล.)และมีตัวอย่างอุจจาระเปียก (470 mL) และในเวลาต่อมาแช่แข็ง (−20 ° C) สำหรับการวิเคราะห์ของ 15N enrichments ที่เวลาเดียวกัน 20 มิลลิลิตรของปัสสาวะถูกผสมกับ mL 80 ของ0.05 M กำมะถัน และแช่แข็ง (−20 ° C) สำหรับการวิเคราะห์ของ 15Nโดดเด่นของตราสารอนุพันธ์ purineบน d 14 อย่างละรอบ ruminal แบคทีเรียถูกรวบรวมสำหรับวัดบ่อ 15N ประมาณ400 mL ของ ruminal digesta รวบรวมจากต่อ dorsal และ ventral ผ่านการ ruminalcannula 1, 3, 5, 7, 9 และ 11 h หลังอาหาร ที่digesta ถูกย้ำผ่านชั้น 4 ทันทีcheesecloth และส่วนเป็นของเหลวมีวิเคราะห์ความpH ทันที 10 มล.ของเหลว ruminal เครียดได้ผสม ด้วย 1 mL ของ 6 M HCl และน้ำแข็งที่ −20 ° C สำหรับการวิเคราะห์ของ ruminal NH3 ML 8 อีกของที่เครียดruminal น้ำมันที่ผสมกับ 2 mL 25% (wt/wt)กรด metaphosphoric และหยุด −20 ° C สำหรับการวิเคราะห์ของ ruminal VFA เหลือย้ำน้ำมัน ruminalและเนื้อหา ruminal แบบผสมผสาน (1 นาที NuBlendWaring พาณิชย์ Torrington, CT) ด้วยน้ำเกลือ 0.5 Lโซลูชั่น (0.9% NaCl) จะแยกแบคทีเรีย ruminalหลังจากผสม เศษของเหลวที่แยกต่างหาก โดยการกรองผ่านชั้นที่ 4 ของ cheesecloth ได้ทันทีแช่แข็ง(−20 ° C) และเรื่องฝุ่นที่เหลือถูกแทนในต่อ บน d 14 ประมาณ 300 mLของ duodenal digesta ถูกรวบรวมจาก duodenalcannula 1, 3, 5, 7, 9 และ 11 h หลังจากให้อาหาร และน้ำแข็ง(−20 ° C)ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ภายในรอบระยะเวลา ตัวอย่างอาหารถูกทางถูกพูข้ามวันบนพื้นฐานน้ำหนักเท่ากัน ตัวอย่างของ ort ได้ compositedโดยคัดท้ายภายในระยะเวลา ตัวอย่างอาหารและ ort และsubsamples ของอุจจาระที่แห้งที่ 55° C ในการบังคับอากาศเตาอบสำหรับ 72 h, equilibrated อากาศใน 24 ชม และชั่งน้ำหนักเพื่อกำหนดตัวอย่าง digesta DM Duodenal บางส่วนได้อบแห้ง เมื่อแห้ง ตัวอย่างทั้งหมดมีพื้นดินให้ผ่านหน้าจอ 1 มม. (Thomas Wiley ห้องปฏิบัติการโรงสีรุ่น 4 สหรัฐอเมริกาวิทยาศาสตร์ Thomas, Swedesboro, NJ)มี DM ฟีด ort ตัวอย่าง fecal และ duodenalกำหนด โดยการอบแห้งใน 24 ชมที่ 105° C ในการ forcedairเตาอบ ออมถูกกำหนด โดย ashing สำหรับ 8 hในเตาเตาอบที่ 450 องศาเซลเซียส เนื้อหา N สาร ortduodenal digesta อุจจาระเปียก และตัวอย่างปัสสาวะได้กำหนด โดยการเผาไหม้ (ไนโตรเจนวิเคราะห์รูปแบบFP-2000 บริษัท Leco เซนต์โจเซฟ MI), และ CPมีคำนวณเป็น N × 6.25 ความเข้มข้นของโครเมียมของกำหนดตัวอย่าง fecal และ duodenal โดยอะตอมดูดซึมหลังจากที่มีเตรียมตัวอย่างดังที่โดยวิลเลียมส์ et al. (1962) Ruminal แบคทีเรียถูกแยกโดย thawing ตัวอย่างสารบัญ ruminal แล้วcentrifuging ตัวอย่างที่ซื้อ 500 กรัมสำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatantsมี centrifuged ที่ 20000 × g สำหรับ 20 นาทีที่ 4° C แบบเม็ดแบคทีเรีย เม็ดถูก resuspendedด้วยน้ำเกลือ (0.9% NaCl) และ centrifuged อีกที่ 20000 × g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ขี้แบคทีเรียแช่แข็ง และอบแห้งความเข้มข้นของต กรดยูริก และ creatinineถูกกำหนดในตัวอย่างปัสสาวะรวม (d 10-13)โดย HPLC กลับเฟส (ดัดแปลงจาก Shingfield และพิเศษ 1999) มีวิเคราะห์ตัวอย่างบน Hewlett--ระบบของเหลว chromatography ตี้ชุด Packard 1050(Hewlett-Packard ดัลลัส CA) พร้อมกับการเครื่องตรวจจับ UV เห็นที่ 218 nm (Acutect 500 UV /VIS เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ Inc., Waltham, MA)และ autosampler (เป็น 1000 SpectraSYSTEM เทอร์โมฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์ Inc.) แยกส่วนประกอบตัวอย่างสำเร็จ ด้วยชีวภาพค้นพบ 5 μm มากมายคอลัมน์ C18 รูขุมขน (250 × 4.6 มม.ประชาชน ซิก-AldrichSt. Louis, MO) กับแบบ 5 μm ค้นพบไบโอกว้างรูขุมขนC18 (20 × 4.6 มม.ประชาชน ซิก Aldrich) รักษาคอลัมน์เฟสเคลื่อนที่เตรียม โดยยุบ 1.01 gโซเดียม 1-heptane ลกรดและ g 0.86 ของแอมโมเนียฟอสเฟตเป็น H2O deionized กับ 35 L 1mL ของเมทานอลและ μL ของ triethylamine ที่เพิ่ม 70 ที่ถูกปรับ pH 3.2 กับ HCl โซลูชันทั้งหมดที่กรอง (Magna 0.45 μm-R, MSI, WestboroMA) และ degassed กับเขา มีผสมตัวอย่างปัสสาวะจะอยู่ในช่วงเชิงเส้นมาตรฐาน (20:1)ด้วย diluent ที่ถูกเตรียม โดยยุบ 0.86 กรัมของแอมโมเนียฟอสเฟตและ 1.01 กรัมของโซเดียม 1-heptaneลกรดเป็น 1 L ของ H2O (pH ปรับปรุง 2.1 ด้วยHCl) มีกรองตัวอย่างแตกออก (0.45-μm เข็ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไม่มีข้อความ / ชั่วโมงผ่านปั๊มหลอดฉีดยาโปรแกรม (BS-9000 แบบ Multi
Phaser, เบรนทรีวิทยาศาสตร์อิงค์เบรนทรี, แมสซาชูเซต)
แก้ปัญหา
15N15N-ยูเรียถูกจัดทำขึ้นโดยใช้เทคนิคที่ผ่านการฆ่าเชื้อในเครื่องดูดควันไหลโดยรวม3.6 กรัม
15N15N-ยูเรีย (99%, การแพทย์ไอโซโทปอิงค์เพล NH)
กับ 1 ลิตรน้ำเกลือปลอดเชื้อ (0.9% NaCl)
วิธีการแก้ปัญหาที่ถูกส่งผ่านตัวกรอง 0.22 ไมครอน (Sterivex,
คคอร์ปอเรชั่นบิลเลริกา, แมสซาชูเซต)
ลงในการฆ่าเชื้อภาชนะแก้ว กะบังยางได้รับการฆ่าเชื้อ crimped
บนภาชนะหลังจากการกรองและการแก้ปัญหาที่ถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน
วิธีการแก้ปัญหา
15N15N-ยูเรียได้รับการจัดเตรียมไว้ทันทีก่อนที่จะแช่ในแต่ละงวด.
อาหารเก็บตัวอย่าง (100 กรัม / วัน)
ในขณะที่พวกเขากำลังชั่งน้ำหนักและตัวอย่างถูกแช่แข็ง(-20 ° C) หาก Orts
ใดมีปัจจุบันพวกเขาถูกถอดออกมาที่0,455
ชั่วโมงทุกวันชั่งน้ำหนักและแช่แข็ง(-20 ° C) เรือสำหรับการเก็บปัสสาวะและอุจจาระที่ถูกถอดออก 0530 ชั่วโมงทุกวันและชั่งน้ำหนัก
ปัสสาวะตัวอย่างที่ถูกผสมแล้ว 1% ของทุกวันเอาท์พุทเป็นตัวอย่างและแช่แข็ง ในเวลาเดียวกันเป็นส่วนหนึ่งตัวแทนของปัสสาวะผสมกับ 0.05 M H2SO4 (ปัสสาวะส่วนที่ 1 กับ 4 ส่วน H2SO4) เช่นว่าน้ำหนักทางออกสุดท้ายเท่ากับ1% ของชีวิตประจำวันการส่งออกปัสสาวะและถูกแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ปัสสาวะอนุพันธ์purine และ creatinine ตัวอย่างอุจจาระที่ถูกผสมด้วยมือและ 5% เป็นตัวอย่างและแช่แข็ง ตัวอย่างอุจจาระและปัสสาวะจาก d 10 ถึง13 ถูกรวบรวมโดยมีแขนและใช้ในการวัดความสมดุลไม่มี. อาหารเครื่องดื่มเกลือแร่และตัวอย่างที่เก็บได้จาก d 9 ถึง12 ตรงกับปัสสาวะและอุจจาระที่เก็บรวบรวมจากd 10 ถึง 13 ปัสสาวะและอุจจาระที่ใช้สำหรับหาความ 15N เป็นตัวอย่างจากในชีวิตประจำวันรวมคอลเลกชันจากd 10 สำหรับการวัด 15N พื้นหลังและตัวอย่างจากคอลเลกชันในชีวิตประจำวันรวมจากd 13 สำหรับการวัดปริมาณที่อุดมของ15N ปัสสาวะ (100 มิลลิลิตร) และอุจจาระเปียก (470 มิลลิลิตร) เก็บตัวอย่างและต่อมาแช่แข็ง(-20 ° C) สำหรับการวิเคราะห์ 15N enrichments ในเวลาเดียวกัน 20 มลปัสสาวะถูกเจือจางด้วย 80 มล 0.05 M H2SO4 และแช่แข็ง (-20 ° C) สำหรับการวิเคราะห์ 15N เพิ่มคุณค่าของสัญญาซื้อขายล่วงหน้า purine. เมื่อวันที่ 14 งของแต่ละช่วงเวลาตัวอย่างแบคทีเรียในกระเพาะรูเมนที่ถูกเก็บรวบรวมสำหรับการวัดการตกแต่ง 15N ประมาณ400 มิลลิลิตร digesta กระเพาะรูเมนที่ถูกเก็บรวบรวมจากหลังและหน้าท้องกระเพาะผ่านกระเพาะรูเมนcannula 1, 3, 5, 7, 9, และ 11 ชั่วโมงหลังจากการให้อาหาร digesta เครียดทันทีถึง 4 ชั้นของผ้าและส่วนของเหลวที่ได้มาวิเคราะห์หาค่าความเป็นกรด ทันที 10 มิลลิลิตรของของเหลวในกระเพาะรูเมนที่ทำให้เครียดได้รับการผสมกับ1 มิลลิลิตร 6 M HCl และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์NH3 กระเพาะรูเมน อีก 8 มิลลิลิตรเครียดของของเหลวในกระเพาะรูเมนผสมกับ2 มิลลิลิตร 25% (น้ำหนัก / น้ำหนัก) กรด metaphosphoric และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์ของกระเพาะรูเมนVFA ส่วนที่เหลืออีกตึงเครียดในกระเพาะรูเมนของเหลวเนื้อหาและกระเพาะรูเมนถูกผสม (1 นาที; NuBlend, Waring พาณิชย์, ทอร์, CT) 0.5 ลิตรน้ำเกลือวิธีการแก้ปัญหา(0.9% โซเดียมคลอไรด์) เพื่อแยกเชื้อแบคทีเรียในกระเพาะรูเมน. หลังจากการผสมของเหลวแยกโดยการกรองผ่าน 4 ชั้นของผ้าถูกแช่แข็งทันที (-20 ° C) และอนุภาคที่เหลือก็ถูกแทนที่ในกระเพาะรูเมน ในวันที่ 14 ประมาณ 300 มิลลิลิตรของdigesta ลำไส้ถูกเก็บรวบรวมจากลำไส้cannula 1, 3, 5, 7, 9, และ 11 ชั่วโมงหลังจากกินอาหารแช่แข็ง(-20 ° C). การวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการภายในระยะเวลาตัวอย่างอาหารที่ได้รวบรวมข้ามวันบนพื้นฐานของน้ำหนักที่เท่ากัน ตัวอย่าง Ort ถูก composited โดยตักภายในระยะเวลาที่ ฟีดและตัวอย่างดื่มเกลือแร่และsubsamples อุจจาระแห้งที่ 55 องศาเซลเซียสในบังคับอากาศเตาอบ72 ชั่วโมงเครื่อง equilibrated เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและชั่งน้ำหนักเพื่อตรวจสอบบางส่วนDM ลำไส้ตัวอย่าง digesta ถูกแห้ง เมื่อแห้งตัวอย่างทั้งหมดถูกพื้นดินที่จะผ่านหน้าจอ 1 มิลลิเมตร (ห้องปฏิบัติการโทมัสไวลีย์มิลล์รุ่น4 โทมัสทางวิทยาศาสตร์สหรัฐอเมริกา, เวดส์, นิวเจอร์ซีย์). DM อาหาร, เครื่องดื่มเกลือแร่, อุจจาระและตัวอย่างลำไส้เล็กส่วนต้นถูกกำหนดโดยการอบแห้ง24 ชั่วโมงที่ 105 ° C ใน forcedair เตาอบ กล้อง OM ถูกกำหนดโดย ashing เป็นเวลา 8 ชั่วโมงในเตาเผาที่450 องศาเซลเซียส เนื้อหาที่ไม่มีอาหาร, เครื่องดื่มเกลือแร่, digesta ลำไส้อุจจาระเปียกและตัวอย่างปัสสาวะที่ถูกกำหนดโดยการเผาไหม้(วิเคราะห์ไนโตรเจนรุ่นFP-2000 Leco คอร์ปอเรชั่นเซนต์โจเซฟ, มิชิแกน) และซีพีที่คำนวณได้เป็นไม่มี× 6.25 ความเข้มข้นของโครเมี่ยมของอุจจาระและลำไส้เล็กส่วนต้นถูกกำหนดโดยอะตอมดูดซึมหลังจากที่ตัวอย่างได้จัดทำตามที่อธิบายไว้โดยวิลเลียมส์และอัล (1962) แบคทีเรียในกระเพาะรูเมนที่แยกได้โดยละลายตัวอย่างของเนื้อหาในกระเพาะรูเมนแล้วเหวี่ยงตัวอย่างที่500 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C supernatants ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 20,000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่4 ° C ในรูปแบบเม็ดแบคทีเรีย เม็ดถูก resuspended ด้วยน้ำเกลือ (0.9% NaCl) และหมุนเหวี่ยงอีก20,000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C เม็ดแบคทีเรียถูกแช่แข็งและแห้ง. ความเข้มข้นของ Allantoin, กรดยูริคและครีได้รับการพิจารณาในการรวบรวม(ง 10-13) ตัวอย่างปัสสาวะโดยย้อนกลับเฟสHPLC (ดัดแปลงมาจาก Shingfield และเสนอ, 1999) ตัวอย่างที่ได้มาวิเคราะห์ใน Hewlett-Packard 1050 Ti-Series ระบบของเหลว chromatography (Hewlett-Packard, พาโลอัลโต) พร้อมกับเครื่องตรวจจับรังสียูวีที่มองเห็นได้ตั้งไว้ที่218 นาโนเมตร (500 Acutect UV / VIS, เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์อิงค์วอลแทม แมสซาชูเซต) และฉีดตัวอย่างอัตโนมัติ (AS 1000 SpectraSYSTEM, เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์อิงค์) แยกส่วนประกอบตัวอย่างก็ประสบความสำเร็จด้วย 5 ไมครอนค้นพบ BIO กว้างรูขุมขนC18 คอลัมน์ (250 × 4.6 มมรหัส, Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์) กับ 5 ไมครอนค้นพบรูขุมขนกว้าง BIO C18 (20 × 4.6 มม รหัส, Sigma-Aldrich) คอลัมน์ยาม. ระยะที่มือถือถูกจัดทำขึ้นโดยการละลาย 1.01 กรัมโซเดียมกรดซัลโฟ1 heptane และ 0.86 กรัมของแอมโมเนียมฟอสเฟตเป็น1 ลิตร H2O ปราศจากไอออน 35 มิลลิลิตรและเมทานอล 70 ไมโครลิตรของ triethylamine เพิ่ม ค่า pH ปรับ 3.2 กับ HCl และวิธีการแก้ปัญหาทั้งหมดถูกกรอง(0.45 ไมครอน Magna-R, MSI, Westboro, MA) และ degassed กับเขา ตัวอย่างปัสสาวะที่ถูกปรับลดให้อยู่ในช่วงเชิงเส้นของมาตรฐาน (20: 1) ที่มีการเจือจางที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการละลาย 0.86 กรัมของแอมโมเนียมฟอสเฟตและ1.01 กรัมโซเดียม 1 heptane กรดซัลโฟเป็น 1 ลิตร H2O (pH ปรับให้ 2.1 HCl) ตัวอย่างที่ถูกปรับลดกรอง (0.45 ไมครอนเข็ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

N / H ผ่านปั๊มเข็ม ( bs-9000 โปรแกรม multi -
Phaser เบรนทรี Braintree , วิทยาศาสตร์ , Inc . , MA )
15n15n สารละลายยูเรีย เตรียมใช้เทคนิคในการไหลแบบราบเรียบปราศจาก
กระโปรงโดยรวม 3.6 กรัม
15n15n ยูเรีย ( 99% แพทย์ไอโซโทปอิงค์ Pelham , NH )
1 ลิตรปลอดเชื้อน้ำเกลือ ( 0.9% NaCl )
สารละลายที่ผ่านการกรอง 0.22 - M (
sterivex มิลลิμ , บริษัทโตเกียว , MA ) เข้าไปฆ่าเชื้อ
แก้วภาชนะ ฆ่าเชื้อยางกั้นคือ crimped
ลงบนภาชนะหลังจากการกรอง และสารละลายที่อุณหภูมิ 4 องศา C
จนใช้ การ 15n15n สารละลายยูเรีย
เตรียมไว้ทันที ก่อนที่จะฉีดในแต่ละช่วงเวลา
อาหารจำนวน 100 กรัม / วัน ) ตามที่พวกเขาชั่งน้ำหนัก
และตัวอย่างถูกแช่แข็ง ( − 20 ° C ) ถ้ามีก่อตั้งเป็น
ปัจจุบันพวกเขาถูกลบออกใน 0455 H ทุกวัน หนัก
และแช่แข็ง ( − 20 ° C ) ภาชนะสำหรับเก็บปัสสาวะและอุจจาระออกตอน 0530
H ทุกวัน และชั่งน้ำหนัก ตัวอย่างปัสสาวะ
ปะปนกันอย่างละเอียดแล้ว 1 % ของผลผลิตทุกวัน
ตัวอย่าง และแช่แข็ง ในเวลาเดียวกัน ,
ตัวแทนส่วนของปัสสาวะผสมกับ 0.05 M
กรดซัลฟิวริก ( 1 ส่วน 4 ส่วนปัสสาวะกับกรดซัลฟิวริก ) เช่น
น้ำหนักสารละลายเท่ากับ 1 % ของผลผลิตในปัสสาวะทุกวัน
และถูกแช่แข็งเพื่อวิเคราะห์ปริมาณอนุพันธ์พิวรีนในปัสสาวะ
และครี . ตัวอย่างอุจจาระถูก
ละเอียดผสมด้วยมือ และ 5% ตัวอย่างและ
แช่แข็ง ตัวอย่างอุจจาระและปัสสาวะจาก D 10 ผ่าน
13 ถูกรวมโดยคัดท้ายและใช้วัด N สมดุล .
อาหารและตัวอย่างสถานที่รวบรวมจาก D
9 ผ่าน12 ของ ปัสสาวะ และอุจจาระ จากการเก็บตัวอย่าง
D 10 ถึง 13 ตัวอย่างปัสสาวะและอุจจาระใช้
15N determinations การวิจัยจากคอลเลกชันทุกวัน
D 10 วัดรวมจาก 15 และหลัง
ตัวอย่างจากคอลเลกชันประจําวัน จาก D 13
วัดอุดมจํานวน 15 . ปัสสาวะ ( 100 ml )
และเปียกอุจจาระ ( 470 มิลลิลิตรและต่อมา
ตัวอย่างแช่แข็ง ( − 20 ° C ) สำหรับการวิเคราะห์ 15 enrichments . ที่
เวลาเดียวกัน 20 ml ของปัสสาวะเจือจางด้วย 80 มิลลิลิตร 0.05 M
กรดซัลฟิวริกและแช่แข็ง ( − 20 ° C ) สำหรับการวิเคราะห์การอนุพันธ์พิวรีน 15
.
บน D 14 ของแต่ละช่วงเวลาในช่วงที่มีการเก็บตัวอย่าง
สำหรับการวัด 15N เสริมสมรรถนะ ประมาณ 400 มิลลิลิตร และ digesta

รวบรวมครีบหลังและครีบท้องจากอาหารผ่านกระเพาะ
cannula 1 , 3 , 5 , 7 , 9 , และ 11 ชั่วโมงหลังการให้อาหาร
digesta ทันทีตึงผ่าน 4 ชั้นของ
ผ้าและส่วนของเหลวใช้
. ทันที , 10 ml ของของเหลวในกระเพาะรูเมนี่
ผสม 1 มิลลิลิตร 6 M HCl และแช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 ° C −
การวิเคราะห์และ nh3 . อื่นของตึง
8 มล.และของเหลวผสม 2 มิลลิลิตร 25 % ( wt / wt )
เมตทาฟอสฟอริกแอซิดและแช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 ° C −การวิเคราะห์
ของกระเพาะลดลง . เหลือตึงและของเหลว
และเนื้อหาและผสม ( 1 นาที ; nublend
สินค้า , พาณิชย์ , ทอร์ , CT ) 0.5 ลิตร เกลือ
โซลูชั่น ( 0.9% NaCl ) เพื่อแยกแบคทีเรียในกระเพาะรูเมน .
หลังจากผสม ของเหลวส่วนแยกโดยการกรอง
ผ่าน 4 ชั้นของผ้าถูกแช่แข็งทันที
( − 20 ° C ) และที่เหลืออนุภาคถูกแทนที่
ในกระเพาะ ใน D 14 ประมาณ 300 ml
ของลำไส้ digesta รวบรวมจากลำไส้
cannula 1 , 3 , 5 , 7 , 9 , และ 11 ชั่วโมงหลังการให้อาหารและแช่แข็ง
( − 20 ° C )

ภายในห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ตัวอย่างอาหารมีระยะเวลารวมข้ามวัน
ในน้ำหนักที่เท่ากันตัวอย่างสถานเป็น composited
โดยคัดท้ายภายในระยะเวลาที่ อาหารและตัวอย่างสถานและ
subsamples มูลอุณหภูมิ 55 องศา C ในบังคับอากาศ
เตาอบเป็นเวลา 72 ชั่วโมง อากาศ equilibrated 24 H และหนัก

หา DM บางส่วน ตัวอย่าง digesta ลำไส้ถูก
แห้ง . เมื่อแห้งตัวอย่างดิน

ผ่าน 1-mm จอ ( โทมัส ไวลี่ย์ปฏิบัติการโรงงาน
แบบจำลองที่ 4 โทมัส วิทยาศาสตร์สหรัฐอเมริกา swedesboro
, NJ )DM ของอาหารส่งออก อุจจาระ และตัวอย่าง , ลำไส้ถูก
กำหนดโดยการอบแห้งเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ที่ 105 ° C ใน forcedair
เตาอบ การพิจารณาจากแบบ 8 H
ใน muffle เตาอบที่ 450 องศา ปริมาณของอาหารส่งออก N ,
digesta , ลำไส้ อึเปียก และตัวอย่างปัสสาวะถูกกำหนดโดยการเผาไหม้ (

fp-2000 LECO แบบวิเคราะห์ไนโตรเจน , บริษัท เซนต์โยเซฟ มิ ) และ CP
n คำนวณเป็น × 6.25 .ความเข้มข้นของโครเมียม และลำไส้
อุจจาระตัวอย่างดินจากอะตอม
การดูดซึมหลังจากจำนวนที่เตรียมไว้
วิลเลียมส์ et al . ( 1962 ) และแบคทีเรียที่แยกได้จากตัวอย่างและเนื้อหาการ

สารแล้วตัวอย่างที่ 500 × G สำหรับ 20 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา supernatants
เป็นระดับที่ 20 , 000 × g
ที่ 4 ° C 20 นาทีในรูปแบบเม็ดแบคทีเรียเม็ดเป็น resuspended
ด้วยน้ำเกลือ ( 0.9% NaCl ) ไฟฟ้าอีก
ที่ 20 , 000 × G สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ° C ถูกแช่แข็งและอบแห้ง แบคทีเรีย เม็ด
.
ความเข้มข้นของกรดยูริคจึงชโลมและครี
ถูกกำหนดใน pooled ( D 10 ถึง 13 ) ตัวอย่างปัสสาวะ
โดยกลับเฟส HPLC ( ดัดแปลงจาก shingfield และ
เสนอ , 1999 ) วิเคราะห์ใน Hewlett -
Packard 1050 Ti แบบ liquid chromatography ระบบ
( Hewlett Packard , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย ) พร้อมกับ
UV มองเห็นตรวจจับไว้ที่ 218 nm ( acutect 500 UV /
3 , เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ( เพิ่งมา ) และ ( 1 , 000 autosampler

spectrasystem เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ Inc . ) การแยกของตัวอย่างส่วนประกอบ
สําเร็จ ด้วย 5 - คอลัมน์μ M
รูขุมขนกว้างค้นพบไบโอ c18 ( 250 × 4.6 มม. บัตรประจำตัวซิกม่า Aldrich
St . Louis , MO ) กับ 5 - μ M ค้นพบไบกว้างรูขุมขน
c18 ( 20 × 4.6 มม. บัตร ซิกม่า Aldrich ) คอลัมน์ รปภ.
เฟสเคลื่อนที่ถูกเตรียมโดยละลาย 1.01 กรัม
โซเดียม 1-heptane ลาร์โซเดียมคาร์บอเนตและ 0.86 กรัมของแอมโมเนียมฟอสเฟต 1
l คล้ายเนื้อเยื่อประสาน H2O กับ 35
มิลลิลิตรและμเมทานอล 70 ลิตรไตรเอตทิลามีนเพิ่ม
pH ปรับ 3.2 กับ HCl และโซลูชั่นทั้งหมดถูกกรอง (
045 - μ M magna-r , MSI westboro
, , MA ) และ degassed กับเขา ตัวอย่างปัสสาวะลด
อยู่ภายในช่วงเชิงเส้นของมาตรฐาน ( 20 : 1 )
กับเตรียมที่เตรียมโดยละลาย 0.86 กรัมของแอมโมเนียมฟอสเฟตและ 1.01 กรัม

เรียน 1-heptane โซเดียมกรดเป็น 1 ลิตรของ H2O ( ปรับ pH 2.1 กับ
HCl ) เจือจางตัวอย่างกรอง ( 0.45 - μเมตร เข็มฉีดยา