Purification of Lysozyme Inhibitors

Purification of Lysozyme Inhibitors. Hexa-His tagged Ivyc,

Ivyp, and E. coli MliC proteins were obtained using similar procedures.

Genes coding for Ivyc and E. coli MliC were amplified from E. coli

JM105, and that for Ivyp from P. aeruginosa strain PA01. Expression

vectors pET26b-Ivyc-his, pET26b-Ivyp-his, and pET26b-MliC-his

were constructed and subsequently transformed into Shuffle T7

Express cells (New England Biolabs, USA) and produced as described

previously.42

GMD Production. GMD were produced as described in detail

elsewhere,27 with the exception that M. luteus, instead of Staphylococcus

aureus, was employed as the target bacteria. The stirred tank method of

GMD production was used here.

First Screen. The First Screen included two sequential rounds of

sorting (see Supporting Information Figure 4 for details). The GMDs

were grown in induction medium, containing purified Ivyc, at 30 °C

for 19 h, after which they were sieved over a 20 μm mesh and then

recovered from the sieve in fresh PBS. SYTOX Orange (Life

Technologies, USA) was added to a final concentration of 100 nM

just before sorting. GMD were sorted on an iCYT Synergy flow

cytometer equipped with a 126 μm nozzle and laser lines of 488 and

561 nm for excitation of yEGFP and SYTOX Orange, respectively.

Individual GMD isolated from high stringency plating sorts were

placed on M. luteus indicator plates (0.5 mg mL−1 M. luteus, 10 μg/mL

E. coli Ivy, 0.5% dextrose, 1.5% galactose, 0.71% Difco YNB without

(NH4)2SO4, 0.25% (NH4)2SO4, 0.077% CSM−ura) and grown 4 days at

30 °C. Prevalent halo-forming colonies were selected for sequencing.

Second Screen. The Second Screen followed the same general

methods as the first, with the exception that GMDs were incubated in

progressively more dilute concentrations at each round of sorting

(round 1 = 100 000 GMDs/mL, round 2 = 10 000 GMDs/mL, and

round 3 = 1000 GMDs/mL; see Supporting Information Figure 4 for

details).
Lysozyme Purification. Lysozyme variants were purified as

described in detail elsewhere.16,42

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำให้บริสุทธิ์ของ Lysozyme Inhibitors Hexa พระแท็ก IvycIvyp และ MliC E. coli โปรตีนได้รับโดยใช้วิธีคล้ายกันยีนที่กำหนดสำหรับ Ivyc และ MliC E. coli ถูกขยายจาก E. coliJM105 และที่สำหรับ Ivyp จาก P. aeruginosa สายพันธุ์ PA01 นิพจน์เวกเตอร์ pET26b-Ivyc-พระ pET26b-Ivyp-พระ และ pET26b-MliC-พระสร้าง และเปลี่ยนมาเป็นสลับ T7เอ็กซ์เพรสเซลล์ (นิวอิงแลนด์ Biolabs สหรัฐอเมริกา) และผลิตตามpreviously.42การผลิต GMD GMD ผลิตตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดอื่น ๆ 27 ยกเว้นที่ M. luteus แทน Staphylococcusหมอเทศข้างลาย ถูกจ้างเป็นแบคทีเรียเป้าหมาย วิธีการถังคนใช้ GMD ผลิตที่นี่หน้าจอแรก หน้าจอแรกรวมรอบลำดับสองเรียงลำดับ (ดูรูปข้อมูลที่สนับสนุน 4 สำหรับรายละเอียด) GMDsได้เติบโตในการเหนี่ยวนำ ประกอบด้วย Ivyc บริสุทธิ์ ที่ 30 ° Cสำหรับ 19 h หลังจากที่ที่พวกเขามี sieved มากกว่า 20 μm ประกบแล้วกู้คืนจากตะแกรงใน PBS สด SYTOX ส้ม (ชีวิตเทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา) ถูกเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 nMก่อนเรียงลำดับ GMD เรียงบน iCYT การไหล Synergycytometer พร้อม 126 μm หัวฉีดและเลเซอร์บรรทัด 488 และ561 nm สำหรับในการกระตุ้น yEGFP และ SYTOX สีส้ม ตามลำดับGMD ละโดดเดี่ยว stringency สูงชุบเรียงลำดับได้วางบน M. luteus แผ่นตัวบ่งชี้ (0.5 mg mL−1 M. luteus, μg 10 mLไอวี่ e. coli กาแล็กโทส 1.5%, 0.71%, 0.5% ขึ้น Difco YNB โดย(NH4) 2SO4, 0.25% (NH4) 2SO4, 0.077% CSM−ura) และเติบโต 4 วันที่30 องศาเซลเซียส อาณานิคม halo ขึ้นแพร่หลายถูกเลือกสำหรับการจัดลำดับหน้าจอที่สอง หน้าจอที่สองตามทั่วไปเดียวกันวิธีเป็นครั้งแรก มีข้อยกเว้นที่ GMDs ได้ incubated ในความก้าวหน้าเพิ่มเติม dilute ความเข้มข้นในแต่ละรอบของการเรียงลำดับ(รอบ 1 = 100 000 GMDs/mL รอบ 2 = GMDs 10 000/mL และรอบ 3 = 1000 GMDs/mL ดูสนับสนุนข้อมูลรูปที่ 4 สำหรับรายละเอียด)Lysozyme ฟอก Lysozyme ย่อยได้บริสุทธิ์เป็นอธิบายในรายละเอียด elsewhere.16,42

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของสารยับยั้ง Lysozyme เฮกซ่าของเขาที่ติดแท็ก Ivyc, Ivyp และเชื้อ E. coli โปรตีน MliC ที่ได้รับโดยใช้วิธีการที่คล้ายกัน. ยีนเข้ารหัสสำหรับ Ivyc และเชื้อ E. coli MliC ถูกขยายจากเชื้อ E. coli JM105 และว่าสำหรับ Ivyp จากความเครียด P. aeruginosa PA01 การแสดงออกเวกเตอร์ pET26b-Ivyc ของเขา pET26b-Ivyp ของเขาและ pET26b-MliC ของเขาถูกสร้างขึ้นและเปลี่ยนไปในสลับ T7 เซลล์ด่วน (นิวอิงแลนด์ Biolabs, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และผลิตตามที่อธิบายไว้previously.42 ผลิต GMD GMD มีการผลิตตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดอื่น ๆ 27 ยกเว้นว่า M. luteus แทนที่จะ Staphylococcus aureus, ถูกจ้างมาเป็นแบคทีเรียเป้าหมาย วิธีถังกวนจากการผลิต GMD ถูกนำมาใช้ที่นี่. หน้าจอแรก หน้าจอแรกรวมสองรอบต่อเนื่องของการเรียงลำดับ (ดูข้อมูลสนับสนุนรูปที่ 4 สำหรับรายละเอียด) GMDs มีปลูกอยู่ในสื่อเหนี่ยวนำที่มีบริสุทธิ์ Ivyc ที่ 30 องศาเซลเซียส19 ชั่วโมงหลังจากที่พวกเขาถูกร่อนผ่านตะแกรง 20 ไมครอนแล้วหายจากตะแกรงในพีบีเอสสด SYTOX สีส้ม (ชีวิตTechnologies ประเทศสหรัฐอเมริกา) ถูกบันทึกอยู่ในความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 นาโนเมตรก่อนที่จะเรียงลำดับ GMD ถูกจัดเรียงในการไหลเวียนของ Synergy iCyt cytometer พร้อมกับหัวฉีด 126 ไมโครเมตรและเส้นเลเซอร์ 488 และ561 นาโนเมตรสำหรับการกระตุ้นของ yEGFP และ SYTOX สีส้มตามลำดับ. GMD บุคคลที่แยกได้จากทุกประเภทชุบเข้มงวดสูงถูกวางไว้บนแผ่นตัวบ่งชี้ M. luteus ( 0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1 M. luteus, 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเชื้อ E. coli Ivy, เดกซ์โทรส 0.5%, กาแลคโต 1.5%, 0.71% Difco YNB โดยไม่ต้อง(NH4) 2SO4, 0.25% (NH4) 2SO4, 0.077% CSM-ยู) และ เติบโตขึ้น 4 วันที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส อาณานิคมรัศมีขึ้นรูปที่แพร่หลายได้รับการคัดเลือกสำหรับลำดับ. หน้าจอที่สอง หน้าจอที่สองตามทั่วไปที่เหมือนกันวิธีการเป็นครั้งแรกที่มีข้อยกเว้นที่ GMDs ถูกบ่มในความเข้มข้นเจือจางก้าวหน้ามากขึ้นในแต่ละรอบของการเรียงลำดับ(รอบที่ 1 = 100 000 GMDs / mL, รอบ 2 = 10 000 GMDs / mL และรอบ 3 = 1000 GMDs / mL ดูข้อมูลสนับสนุนสำหรับรูปที่ 4 . รายละเอียด) Lysozyme บริสุทธิ์ สายพันธุ์ Lysozyme ถูกบริสุทธิ์เป็นอธิบายในรายละเอียด elsewhere.16,42

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บริสุทธิ์ไลโซไซม์ตัวยับยั้ง หกของเขาแท็ก ivyc

ivyp , และ E . coli mlic โปรตีนได้โดยใช้ขั้นตอนเหมือนกัน

ยีนและการเข้ารหัสสำหรับ ivyc E . coli mlic ถูกขยายจาก E . coli

jm105 และว่า สำหรับ ivyp จากพี aeruginosa สายพันธุ์ pa01 . การแสดงออกของเวกเตอร์ pet26b

ivyc ของเขา pet26b ivyp ของเขาและ pet26b mlic ของเขา

ถูกสร้างและเปลี่ยนแปลงในภายหลัง * * 3

เป็น สับเปลี่ยนแสดงเซลล์ ( อังกฤษ biolabs , USA ) และการผลิตตามที่อธิบายไว้

ก่อนหน้านี้ การผลิต GMD 42

GMD ถูกผลิตตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด

ที่อื่น 27 กับข้อยกเว้นที่ ม. luteus แทน Staphylococcus

( ใช้เป็นเป้าหมายของแบคทีเรีย ถังกวนแบบ

GMD การผลิตถูกใช้มา หน้าจอแรก

หน้าจอแรกรวม 2 นัดต่อเนื่อง

การเรียงลำดับ ( ดูรูปที่ 4 สนับสนุนข้อมูลเพื่อดูรายละเอียด ) การ gmds

โตในสื่อเหนี่ยวนำที่มี ivyc ชำระ 30 ° C

19 ชั่วโมงหลังจากที่พวกเขามีขนาดกว่า 20 μเมตรตาข่ายแล้ว

หายจากตะแกรงใน PBS สด sytox สีส้ม ( ชีวิต

เทคโนโลยี , USA ) คือเพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 100 nm

ก่อนการเรียงลำดับ GMD ถูกเรียงบน icyt Synergy ไหล

ใช้โมโนพร้อมกับ 126 μ M หัวเลเซอร์เส้นแล้ว

560 nm สำหรับความตื่นเต้นของ yegfp และ sytox สีส้มตามลำดับ

แต่ละ GMD แยกจากสูง stringency ชุบประเภทถูก

อยู่ใน luteus บ่งชี้แผ่น ( 0.5 mg mL − 1 เมตร luteus 10 μ g / ml

E ( ไอวี่ , 0.5 % dextrose , 1.5% กาแลคโตส 0.71 % difco ynb ไม่มี

( NH4 ) 2so4 0.25 % ( NH4 ) 2so4 , 0 .077 % CSM −ปานเจริญ ) และโต 4 วัน

30 องศา ที่แพร่หลาย รัศมีเป็นอาณานิคมสุ่มลำดับ หน้าจอที่สอง

หน้าจอที่สองตามวิธีการทั่วไป

เหมือนกันเป็นครั้งแรก ด้วยข้อยกเว้นที่ gmds ถูกบ่มใน

ค่อยๆเจือจางความเข้มข้นมากขึ้นในแต่ละรอบ

เรียง ( 1 รอบ = 100 , 000 gmds / มิลลิลิตร รอบ 2 = 10 , 000 gmds / ml และ

รอบที่ 3 = 1000 gmds / มิลลิลิตร ;ดูข้อมูลประกอบรูปที่ 4 สำหรับ

รายละเอียด ) .
ไลโซไซม์บริสุทธิ์ ไลโซไซม์พันธุ์มีความบริสุทธิ์เป็น

อธิบายในรายละเอียดอื่น 16,42