At the end of the trial, individual

At the end of the trial, individuals from each replicate were induced to spawn by injection of 1 M KCl (40 μL per g of body mass) into the coelom via the peristomial membrane (Kelly et al., 2000, Liu et al., 2007 and Carboni et al., 2012) and gametes from three females and three males from each replicate were collected and mixed before fertilization. Eggs were fertilized by addition of 10 mL of diluted sperm. Fertilization rate was assessed under the microscope for 2 h post fertilization. Fertilized eggs were incubated in static seawater without aeration for 24 h in the dark (Liu et al., 2007). Hatching rate was estimated for each batch as the proportion of swimming larvae (counted volumetrically) over the number of incubated eggs. A proportion of the offspring from each treatment (approximately 100,000 larvae per replicate) were reared in isolation in triplicate glass tanks of 2 L volume. Developing embryos from each treatment were sampled for 48 h post-fertilization for fatty acid analyses. Seawater used during the process of artificial fertilization, egg incubation and embryos rearing was filtered (4 μm) and UV treated, and water temperature was maintained at 18 ± 2 °C throughout the cultivation period.

2.2. Proximate composition

Diets were grounded prior to determination of proximate composition, moisture and ash contents according to standard protocols (AOAC, 2000). Crude protein contents were measured by determining nitrogen content (N × 6.25) using automated Kjeldahl analysis (Tecator Kjeltec Auto 1030 analyzer, Foss, Warrington, UK) according to Lynch and Barbano (1999). Crude lipid contents were determined using the Soxhlet method according to standard procedures (AOAC, 2000) with extraction in petroleum ether at 120 °C (Avanti Soxtec 2050 Auto Extraction apparatus, Foss, Warrington, UK). Fibers were analyzed using the Foss fibrecap system with 1 g samples being de-fatted with petroleum ether then boiled for 30 min in 350 mL 1.25% sulphuric acid and washed in boiling distilled water. Samples were then boiled for another 30 min in 350 mL 1.25% NaOH and washed again in water. Samples were incinerated at 600 °C for 4 h and finally re-weighed. Dietary fiber content was calculated as a percentage of the initial weight of the sample. Energy content of the diets was measured by bomb calorimetry using a Parr 6200 calorimeter according to standard procedures. The carbohydrate content was calculated as the difference between dry weight and the sum of protein, lipid, ash and fiber.

2.3. Histology

At the beginning of the feeding trial (day 0) and every 30 days, five sea urchins per replicate were cut outside the peristomial membrane and gonads separated from the other organs, blotted dry with paper towel. Samples were stored in 10% neutral buffered formalin and then dehydrated, embedded in paraffin and sectioned at 5 μm. Three branches from each individual were analyzed in order to confirm synchronization between branches. The sections were stained with haematoxylin and eosin (H/E) and analyzed under the binocular microscope (Olympus, BH2). Gametogenic stages were identified according to Byrne (1990). The two remaining branches from each individual were stored at − 20 °C in chloroform/methanol (2:1 by vol.) containing 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT) for lipid extraction and fatty acid analysis.

2.4. Total lipid and fatty acid contents and composition

After dissection, gonadal samples from each individual were independently stored in 5 mL chloroform/methanol (2:1 by vol.) containing 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT) as an antioxidant at − 20 °C prior to analyses. Gonad samples from each individual were analyzed separately. FA profiles of gonad samples from individuals showing the same gametogenic stage within each treatment were averaged to describe the FA profiles characteristic of each observed gametogenic stage.

Urchin eggs were collected from the five gonopores immediately after spawning using a pipette and stored in glass vials as above. Embryos from each replicate were collected by filtration onto a GF/F filter (Whatman Ltd, Maidstone, UK) before being placed in glass vials and stored as above.

Total lipids were extracted and quantified according to Folch et al. (1957). Fatty acid compositions were determined by gas chromatography of FA methyl esters (FAMEs) essentially according to Christie (2003) all as described in detail by Carboni et al. (2012). Individual FAMEs were identified by comparison with known standards and by reference to published data (Ackman, 1980 and Tocher and Harvie, 1988). Data were collected and processed using Chromcard for Windows (version 1.19), and FAMEs quantified through comparison with a heptadecanoic acid (17:0) internal standard.

2.5. Statistical analysis

Statistical analysis was performed with MINITAB ® version 15.0. Normality and homogeneity of variance were confirmed using Kolmogorov–Smirnov test. Gonadal LC-PUFA contents were compared using a General Linear Model (GLM) with all interactions being analyzed by Tukey post hoc test to identify significant differences (Table 2 for GLM outputs). Egg, embryo and diet LC-PUFA, expressed as percentages of total fatty acids, and moisture, ash, carbohydrate, fiber, protein and lipid as well as fertilization and hatching rates were arcsine transformed and analyzed by one-way ANOVA. The non-parametric multivariate analysis ANOSIM (analysis of similarities) was used to identify significant differences in FA profiles between gametogenic stages in the gonads, eggs and embryos. SIMPER (similarity percentage) test was used to identify which FAs were primarily responsible for the observed differences (Clarke and Warwick, 1994). Data were untransformed and Euclidian distance was used as the metric. In all cases, significant differences were determined at P < 0.05.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในตอนท้ายของการพิจารณาคดีที่บุคคลจากการทำซ้ำแต่ละชักนำให้ไข่โดยการฉีด 1 M KCl (40 ไมโครลิตรต่อกรัมของร่างกายมวล) ลง coelom ผ่านเมมเบรน peristomial (เคลลี่ et al., 2000 หลิว et al., ปี 2007 และ Carboni et al., 2012) และเซลล์สืบพันธุ์จากสามเพศหญิงและเพศที่สามจากการทำซ้ำแต่ละถูกเก็บรวบรวมและผสมก่อนการปฏิสนธิ ไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิโดยการเติม 10 มิลลิลิตรของตัวอสุจิเจือจาง อัตราการปฏิสนธิได้รับการประเมินภายใต้กล้องจุลทรรศน์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงปฏิสนธิโพสต์ ไข่ถูกบ่มในน้ำทะเลคงที่โดยไม่ต้องเติมอากาศเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในที่มืด (Liu et al., 2007) เป็นที่คาดอัตราการฟักไข่สำหรับแต่ละชุดเป็นสัดส่วนของการว่ายน้ำตัวอ่อน (นับ volumetrically) มากกว่าจำนวนของไข่ฟัก สัดส่วนของลูกหลานจากแต่ละรักษา (ประมาณ 100,000 ตัวอ่อนต่อซ้ำ) ได้รับการเลี้ยงดูในการแยกในถังกระจกเพิ่มขึ้นสามเท่าของปริมาณ 2 ลิตร การพัฒนาตัวอ่อนจากการรักษาแต่ละตัวอย่างเป็นเวลา 48 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิสำหรับการวิเคราะห์กรดไขมัน น้ำทะเลที่ใช้ในระหว่างขั้นตอนของการปฏิสนธิเทียมไข่และตัวอ่อนเลี้ยงดูถูกกรอง (4 ไมครอน) และรังสียูวีได้รับการรักษาและอุณหภูมิของน้ำที่ถูกเก็บรักษาไว้ ณ วันที่ 18 ± 2 องศาเซลเซียสตลอดระยะเวลาการเพาะปลูก. 2.2 องค์ประกอบใกล้เคียงอาหารถูกลงดินก่อนที่จะมีการกำหนดองค์ประกอบใกล้เคียงความชื้นและเถ้าตามโปรโตคอลมาตรฐาน (AOAC, 2000) เนื้อหาโปรตีนถูกวัดโดยการกำหนดปริมาณไนโตรเจน (N × 6.25) โดยใช้การวิเคราะห์ Kjeldahl อัตโนมัติ (Auto Tecator Kjeltec 1030 วิเคราะห์ฟอสส์, วอร์ริงสหราชอาณาจักร) ตามลินช์และ Barbano (1999) เนื้อหาไขมันน้ำมันดิบได้รับการพิจารณาโดยใช้วิธีการวิธีการสกัดแบบตามขั้นตอนมาตรฐาน (AOAC, 2000) กับการสกัดในปิโตรเลียมอีเทอร์ที่ 120 ° C (Avanti Soxtec 2,050 เครื่องสกัดอัตโนมัติ, ฟอสส์, วอร์ริงสหราชอาณาจักร) เส้นใยที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้ระบบ fibrecap ฟอสส์ 1 ตัวอย่างกรัมถูกยกเลิกการ fatted กับปิโตรเลียมอีเทอร์ต้มแล้วเป็นเวลา 30 นาทีใน 350 มิลลิลิตร 1.25% และกรดกำมะถันเดือดล้างในน้ำกลั่น ตัวอย่างแล้วต้มอีก 30 นาทีใน NaOH 350 มิลลิลิตร 1.25% และล้างน้ำอีกครั้งใน ตัวอย่างถูกเผาที่ 600 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมงและในที่สุดก็ชั่งน้ำหนักอีกครั้ง เนื้อหาใยอาหารที่คำนวณได้เป็นร้อยละของน้ำหนักเริ่มต้นของกลุ่มตัวอย่างที่ ปริมาณพลังงานของอาหารโดยวัดจาก calorimetry ระเบิดโดยใช้พาร์ร้อน 6200 ตามขั้นตอนมาตรฐาน เนื้อหาคาร์โบไฮเดรตที่คำนวณได้เป็นความแตกต่างระหว่างน้ำหนักแห้งและผลรวมของโปรตีนไขมันเถ้าและเส้นใย. 2.3 จุลที่จุดเริ่มต้นของการทดลองให้อาหาร (วันที่ 0) และทุก 30 วันห้าเม่นทะเลต่อซ้ำถูกตัดออกไปข้างนอกเยื่อ peristomial และอวัยวะเพศที่แยกออกมาจากอวัยวะอื่น ๆ ที่เปื้อนให้แห้งด้วยผ้ากระดาษ ตัวอย่างที่เก็บไว้ในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์กลาง 10% และแห้งแล้วฝังตัวอยู่ในพาราฟินและแบ่ง 5 ไมครอน สาขาที่สามจากแต่ละบุคคลที่ได้มาวิเคราะห์เพื่อยืนยันตรงกันระหว่างสาขา ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสี haematoxylin และ Eosin (H / E) และวิเคราะห์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์กล้องสองตา (โอลิมปั BH2) ขั้นตอนเซลล์สืบพันธุ์ถูกระบุตามที่เบิร์น (1990) ทั้งสองสาขาที่เหลือจากแต่ละถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียสในคลอโรฟอร์ม / เมทานอล (2: 1 โดยปริมาตร.) ที่มี 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT) การสกัดไขมันและกรดไขมันวิเคราะห์. 2.4 ปริมาณกรดไขมันและไขมันรวมและองค์ประกอบหลังจากผ่าตัวอย่างอวัยวะสืบพันธุ์จากแต่ละบุคคลที่ถูกเก็บไว้อย่างเป็นอิสระใน 5 มิลลิลิตรคลอโรฟอร์ม / เมทานอล (2: 1 โดยปริมาตร.) ที่มี 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT) เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่ - 20 องศาเซลเซียสก่อน เพื่อการวิเคราะห์ อวัยวะสืบพันธุ์ตัวอย่างจากแต่ละบุคคลที่ได้มาวิเคราะห์แยกต่างหาก โปรไฟล์เอฟเอของกลุ่มตัวอย่างอวัยวะสืบพันธุ์จากบุคคลแสดงเดียวกันขั้นตอนที่เซลล์สืบพันธุ์ภายในการรักษาแต่ละเฉลี่ยเพื่ออธิบายโปรไฟล์เอฟเอคัลักษณะของแต่ละข้อสังเกตขั้นตอนเซลล์สืบพันธุ์. ไข่ Urchin ถูกเก็บรวบรวมจากห้า gonopores ทันทีหลังจากที่วางไข่โดยใช้ปิเปตและเก็บไว้ในขวดแก้วดังกล่าวข้างต้น . ตัวอ่อนจากการทำซ้ำแต่ละถูกเก็บรวบรวมโดยการกรองบน ​​GF / F กรอง (Whatman จำกัด เมดสโตนสหราชอาณาจักร) ก่อนที่จะถูกวางไว้ในขวดแก้วและเก็บไว้ข้างต้น. ไขมันทั้งหมดถูกสกัดและปริมาณตาม Folch et al, (1957) องค์ประกอบของกรดไขมันที่ถูกกำหนดโดยแก๊ส chromatography ของเอสเทอเมธิลเอฟเอ (FAMEs) เป็นหลักตามที่คริสตี้ (2003) ทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดโดย Carboni et al, (2012) FAMEs ส่วนบุคคลที่ถูกระบุโดยเปรียบเทียบกับมาตรฐานที่รู้จักและโดยอ้างอิงจากข้อมูลที่เผยแพร่ (Ackman 1980 และ Tocher และ Harvie, 1988) เก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลโดยใช้ Chromcard สำหรับ Windows (เวอร์ชั่น 1.19) และ FAMEs ผ่านวัดเปรียบเทียบกับกรด heptadecanoic (17: 0). มาตรฐานภายใน2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการกับ MINITAB ®รุ่น 15.0 ปกติและความสม่ำเสมอของความแปรปรวนได้รับการยืนยันการใช้การทดสอบ Kolmogorov-Smirnov อวัยวะสืบพันธุ์เนื้อหา LC-PUFA ถูกนำมาเปรียบเทียบโดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไป (GLM) ที่มีการปฏิสัมพันธ์ทั้งหมดจะถูกวิเคราะห์โดยโพสต์ทูกีทดสอบนักเรียนในการระบุความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 2 สำหรับผล GLM) ไข่ตัวอ่อนและอาหาร LC-PUFA แสดงเป็นร้อยละของกรดไขมันทั้งหมดและความชื้นเถ้าคาร์โบไฮเดรตเส้นใยโปรตีนและไขมันเช่นเดียวกับการปฏิสนธิและอัตราการฟักไข่ถูกเปลี่ยน arcsine และวิเคราะห์โดยทางเดียว ANOVA การวิเคราะห์หลายตัวแปรที่ไม่ใช่พารา ANOSIM (การวิเคราะห์ความคล้ายคลึงกัน) ถูกใช้ในการระบุความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในโปรไฟล์เอฟเอระหว่างขั้นตอนเซลล์สืบพันธุ์ในอวัยวะสืบพันธุ์ไข่และตัวอ่อน simper (คล้ายคลึงกันร้อยละ) การทดสอบถูกใช้ในการระบุว่า FAs มีความรับผิดชอบหลักในการสังเกตความแตกต่าง (คลาร์กและวอร์วิก, 1994) ข้อมูลคือ untransformed และระยะทาง Euclidian ถูกใช้เป็นตัวชี้วัด ในทุกกรณีแตกต่างที่สำคัญได้รับการพิจารณาที่ P <0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อสิ้นสุดการทดลอง บุคคลจากแต่ละซ้ําถูกชักนำเพื่อวางไข่โดยการฉีด 1 m . ( 40 μ L / กรัมของมวลร่างกาย ) ในมาตงค์ผ่านเยื่อ peristomial ( Kelly et al . , 2000 , Liu et al . , 2007 และ carboni et al . , 2012 ) และ gametes จากสาม เพศหญิงและชายสามคนจากแต่ละซ้ําคือข้อมูลผสมก่อนการปฏิสนธิ .ไข่ไข่โดยนอกเหนือจาก 10 มิลลิลิตรอสุจิเจือจาง อัตราการผสมพันธุ์ที่ได้รับภายใต้กล้องจุลทรรศน์สำหรับการโพสต์ 2 H . ไข่ที่ถูกบ่มในน้ำโดยไม่มีการเติมอากาศคงที่ 24 H ในที่มืด ( Liu et al . , 2007 ) อัตราการฟักประมาณสำหรับแต่ละชุดของสัดส่วนอ่อนว่าย ( นับด้วยการวัดปริมาตร ) มากกว่าจำนวนของเชื้อที่ไข่สัดส่วนของลูกหลานจากการรักษาแต่ละครั้ง ( ประมาณ 100000 ตัวต่อจำลอง ) ที่เลี้ยงในการแยกทั้งสามใบแก้ว ถัง 2 ลิตร ปริมาตร การพัฒนาเอ็มบริโอจากการรักษาแต่ละครั้ง จำนวน 48 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิกรดไขมันเป็นองค์ประกอบ น้ำทะเลที่ใช้ในระหว่างกระบวนการของการประดิษฐ์ไข่ตัวอ่อนและบ่มเพาะเลี้ยงมีกรอง ( 4 μ M ) และ ยูวี และรักษาอุณหภูมิของน้ำไว้ที่ 18 ± 2 องศา C ตลอดระยะเวลาการเพาะปลูก .

. . วิเคราะห์องค์ประกอบ

อาหารถูกกักบริเวณก่อนการหาปริมาณวิเคราะห์องค์ประกอบ ความชื้นและเถ้าตามโปรโตคอลมาตรฐาน ( โปรตีน , 2000 )ระดับโปรตีนที่วัดได้โดยการหาปริมาณไนโตรเจน ( N × 6.25 ) โดยใช้การวิเคราะห์แบบอัตโนมัติ ( tecator 0 kjeltec อัตโนมัติ 1030 วิเคราะห์ ฟอส Warrington , สหราชอาณาจักร ) ตาม ลินช์ และ barbano ( 1999 ) เนื้อหาไขมันดิบคำนวณโดยใช้วิธี Soxhlet ตามขั้นตอน ( ไม่มาตรฐาน ,2000 ) กับการสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ที่ 120 ° C ( ลุกขึ้น soxtec 2050 การสกัดอัตโนมัติเครื่องมือ ฟอส Warrington , สหราชอาณาจักร ) เส้นใยโดยใช้ระบบ fibrecap ฟอสกับ 1 กรัมตัวอย่างการ de อ้วนกับปิโตรเลียมอีเทอร์ แล้วต้มประมาณ 30 นาทีใน 350 ml 1.25 % กรดล้างและต้มในน้ำกลั่น จำนวน แล้วต้มต่ออีก 30 นาทีใน 350 ml 1โซเดียมไฮดรอกไซด์ 25% และล้างอีกครั้งในน้ำ ตัวอย่างที่เผาที่อุณหภูมิ 600 องศา C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และสุดท้าย กำลังชั่งน้ำหนัก ได้รับใยอาหารคือคำนวณเป็นร้อยละของน้ำหนักเริ่มต้นของตัวอย่าง พลังงานที่ได้จากอาหารที่วัดโดยอุปกรณ์ควบคุมระเบิดใช้พาร์ 200 แคลอริมิเตอร์ ตามขั้นตอนมาตรฐานคาร์โบไฮเดรตปริมาณคำนวณเป็นความแตกต่างระหว่างน้ำหนักแห้ง และผลรวมของโปรตีน ไขมัน เถ้าและเยื่อใย

2.3 จุลกายวิภาคศาสตร์

ที่จุดเริ่มต้นของการให้ทดลอง ( วันที่ 0 ) และทุก 30 วัน ห้าเม่นทะเลต่อทำซ้ำโดยตัดเยื่อและนอก peristomial พัฒนาแยกออกจากอวัยวะอื่น เปื้อนแห้งด้วยผ้าขนหนูกระดาษ .ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ใน 10% ฟอร์มาลินและเป็นกลางในน้ำแล้วฝังในพาราฟิน และคุณสมบัติที่ 5 μม. 3 สาขาจากแต่ละคนมาวิเคราะห์เพื่อยืนยันการประสานระหว่างสาขา ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสีฮีมาท๊อกซีลินและ eosin ( H / E ) และศึกษาภายใต้กล้องจุลทรรศน์กล้องส่องทางไกล ( Olympus , bh2 )ขั้นตอนที่เหมาะสมถูกระบุตามเบิร์น ( 1990 ) อีกสองสาขาจากแต่ละที่อุณหภูมิ 20 ° C / เมทานอลคลอโรฟอร์ม− ( 2 : 1 โดยปริมาตร ) ที่ 0.01 % จักรภพ ( บาท ) ในการสกัดและวิเคราะห์ไขมันกรดไขมัน

2.4 . รวมไขมันและกรดไขมันและส่วนประกอบ

หลังจากการชำแหละจากการศึกษาตัวอย่างจากแต่ละคนเป็นอิสระเก็บไว้ในเมทานอลคลอโรฟอร์ม / 5 ml ( 2 : 1 โดยปริมาตร ) ที่ 0.01 % จักรภพ ( บาท ) เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่ 20 °− C ก่อนที่จะวิเคราะห์ข้อมูล ทำการวิเคราะห์ตัวอย่างจากแต่ละแยกฟาโปรไฟล์ของตัวอย่างจากบุคคลทำการแสดงเวทีเดียวกันในการรักษาแต่ละครั้งเป็นจำนวนที่เหมาะสมเพื่ออธิบายลักษณะของแต่ละสังเกตฟ้าโปรไฟล์ที่เหมาะสมบนเวที

เม่นทะเลไข่ที่เก็บจากห้า gonopores ทันทีหลังจากวางไข่ใช้ปิเปตและเก็บไว้ในขวดแก้วเป็นข้างต้นตัวอ่อนจากแต่ละซ้ำมีจำนวนกรองบนกรอง GF / F ( whatman Ltd Maidstone , สหราชอาณาจักร ) ก่อนที่จะถูกวางไว้ในขวดแก้วและเก็บไว้ข้างบน

รวมไขมันสกัดและปริมาณตามฟอล์ช et al . ( 1957 )องค์ประกอบของกรดไขมันถูกกำหนดโดยแก๊สโครมาโตกราฟีของเอฟเอ เมทิลเอสเทอร์ ( FAMEs ) เป็นหลักตามคริสตี้ ( 2546 ) ตามที่อธิบายในรายละเอียดโดย carboni et al . ( 2012 ) บุคคลที่ถูกระบุโดยเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอ้างอิงที่รู้จักและเผยแพร่ข้อมูล ( ackman 1980 และ และ tocher harvie , 1988 )การเก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลการใช้ chromcard สำหรับ Windows ( รุ่นที่ 10 ) และสาร quantified ผ่านการเปรียบเทียบกับกรด heptadecanoic ( 17:0 ) มาตรฐานภายใน

2.5 สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ด้วย

เพลง®รุ่น 15.0 . ปกติค่าความแปรปรวนและการเปลี่ยนแปลงเพื่อใช้สำหรับทดสอบเนื้อหา lc-pufa เปรียบเทียบ จากการศึกษาโดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไป ( glm ) กับการโต้ตอบทั้งหมดถูกวิเคราะห์ โดยทดสอบ Post Hoc ทดสอบเพื่อระบุความแตกต่างที่สำคัญ ( ตารางที่ 2 สำหรับผล glm ) ไข่ ตัวอ่อน และอาหาร lc-pufa แสดงเป็นร้อยละของกรดไขมันทั้งหมด , และความชื้น , เถ้า , คาร์โบไฮเดรต เส้นใยโปรตีน และไขมัน รวมทั้งการปฏิสนธิอัตราการฟักอยู่ arcsine แปลง และวิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว การวิเคราะห์ตัวแปรหลายตัวแปรที่ไม่ anosim ( การวิเคราะห์ความเหมือน ) ถูกใช้เพื่อระบุความแตกต่างระหว่างขั้นตอนที่เหมาะสมในฟ้าโปรไฟล์อยู่หมัด ไข่ และตัวอ่อน .คนโง่ ( ความเหมือนร้อยละ ) การทดสอบเพื่อศึกษาซึ่งมีหน้าที่หลัก ) สำหรับความแตกต่างที่สังเกต ( คลาร์กและ Warwick , 1994 ) ข้อมูล untransformed euclidian และระยะทางที่ใช้เป็นตัวชี้วัด ในทุกกรณี , เปรียบเทียบการกำหนดที่ P < 0.05