2. Material and methods2.1. Isolati

2. Material and methods
2.1. Isolation of probiotic bacteria
Three lactic acid bacteria (LAB) designated as FB2, FF2 and FG1
used in this study were isolated from barley, fermented olive and
traditional dried meat respectively. Briefly, ten grams of each
sample were homogenized in 90 mL of Man Rogosa and Sharpe
(MRS) broth and incubated at 37 C for 48 h. Then, 0.1 mL of the
culture was spread on MRS agar and incubated for 48 h at 37 C. The
obtained colony was selected using positive Gram stain, production
of catalase and cytochrome oxidase. The biochemical characterization
of the isolates was determined using the API 50 CHL (BioMerieux,
France). The potential probiotic strains were conserved at
80 C in MRS broth with 30% glycerol.
2.2. Molecular identification of the selected strains
Bacterial DNA was extracted using a Wizard Genomic Purification
Kit (Promega, Lyon, France) according to the manufacturer’s
recommendations. The bacterial 16S rRNA gene sequence (1.5 Kb)
was amplified by polymerase chain reaction using universal
primers [22]. DNA sequencing reactions were performed in the
DNA Engine Tetrad 2 Peltier thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA) using the ABI BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Finally, DNA sequence
homology search within the GenBank database was performed
using BLAST.
2.3. Test for safety considerations of LAB
2.3.1. DNase test
The selected LAB were grown in MRS broth than transferred
onto DNase Agar containing toluidine blue. The DNase activity was
described by observing a clear zone around the colonies.
2.3.2. Hemolytic activity
Fresh cultures of LAB were streaked on Columbia agar plates,
containing 5% (w/v) sheep blood, and incubated for 48 h at 37 C
[23]. Plates were examined for signs of b-hemolysis (clear zones
around colonies), a-hemolysis (green-hued zones around colonies)
or g-hemolysis (no clear zones around colonies). Staphylococcus
aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 35218 were used as
positive control for b - and for a -hemolysis respectively. The assay
was performed twice.
2.3.3. Antibiotics susceptibility of the selected strains
The antibiotic susceptibility of LAB was tested against Penicillin
(6 mg), Amoxycillin (20 mg), Piperacillin (10 mg), Streptomycin
(10 mg), Streptomycin (500 mg), Kanamycin (30 mg), Novobiocin
(5 mg), Rifampicin (30 mg), Ofloxacin (5 mg), Aztreonam (30 mg) and
Cefalotin (30 mg) using the agar disc diffusion assay [24].
Bacterial suspensions (108 CFU/mL) were inoculated in Muller
Hinton agar using sterile cotton swabs. The plates were air dried for
15 min, then discs containing antibiotics were deposited on the
plates.
After 18 h of incubation at 37 C, inhibition zone diameters
around each disc were measured and the strains were categorized
as resistant, intermediate resistant, or susceptible to the antimicrobial
agents based on the inhibition zone size [24,25]. Mean
values of three independent assays were reported.
2.4.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. การแยกแบคทีเรีย3 แบคทีเรียกรดแลคติ (แล็บ) กำหนดเป็น FB2, FF2 และ fg1 เท่านั้นใช้ในการศึกษาได้แยกจากข้าวบาร์เลย์ หมักมะกอก และแบบแห้งเนื้อตามลำดับ สั้น ๆ สิบกรัมของแต่ละตัวอย่างถูก homogenized ใน 90 mL Rogosa คนและ Sharpeน้ำซุป (MRS) และรับการกกที่ 37 C สำหรับ 48 ชั่วโมง แล้ว 0.1 mL ของการวัฒนธรรมกระจายอยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS และ 48 ชั่วโมงที่ 37 c ได้รับการกกอาณานิคมที่ได้รับการเลือกใช้สีย้อมแกรมบวก การผลิตคาและ cytochrome oxidase สมบัติทางชีวเคมีของการแยกกำหนดใช้ CHL 50 API (BioMerieuxฝรั่งเศส) มีอนุรักษ์สายพันธุ์โปรไบโอติกที่มีศักยภาพที่80 C ในซุป MRS 30% กลีเซอรอล2.2. รหัสโมเลกุลของสายพันธุ์ที่เลือกแบคทีเรียดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้การฟอกออกตัวช่วยสร้างชุด (Promega ลียง ฝรั่งเศส) ตามผู้ผลิตคำแนะนำ ลำดับยีนใน rRNA 16S แบคทีเรีย (1.5 Kb)ถูกขยาย โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่ใช้มาตรฐานสากลไพรเมอร์ [22] ปฏิกิริยาลำดับดีเอ็นเอถูกดำเนินการในการดีเอ็นเอเครื่องยนต์ Tetrad 2 อาศัยความร้อน Cycler (Bio-ล้อ เฮอร์คิวลิส CAสหรัฐอเมริกา) โดยใช้ชุดการจัดลำดับวงจร ABI BigDye V3.1 เทอร์มิเนเตอร์(ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ เมืองฟอสเตอร์ CA, USA) ลำดับดีเอ็นเอในที่สุดทำ homology search จากฐานข้อมูล GenBankใช้ระเบิด2.3. ทดสอบสำหรับข้อควรพิจารณาด้านความปลอดภัยของห้องปฏิบัติการ2.3.1. DNase ทดสอบห้องปฏิบัติการเลือกที่ปลูกในน้ำซุป MRS กว่าโอนลง DNase วุ้นที่ประกอบด้วย toluidine สีฟ้า แก้ไขกิจกรรม DNaseอธิบาย โดยสังเกตโซนใสรอบโคโลนี2.3.2. กิจกรรมที่ hemolyticวัฒนธรรมใหม่ของห้องปฏิบัติได้ลายบนแผ่นวุ้นโคลัมเบียที่ประกอบด้วยเลือดแกะ 5% (w/v) และรับการกก 48 ชั่วโมงที่ 37 C[23] . แผ่นถูก examined สัญญาณของ b-hemolysis (โซนที่ชัดเจนทั่วอาณานิคม), มีเม็ดเลือดแดง (สีเขียวจัดโซนทั่วอาณานิคม)หรือ g-hemolysis (โซนไม่ชัดเจนทั่วอาณานิคม) Staphylococcusหมอเทศข้างลาย ATCC 25923 และ Escherichia coli ATCC 35218 ถูกใช้เป็นบวกควบคุม สำหรับ b - และ-เม็ดเลือดแดงตามลำดับ การทดสอบทำสองครั้ง2.3.3. ยาปฏิชีวนะความอ่อนแอของสายพันธุ์ที่เลือกความไวต่อยาปฏิชีวนะของห้องปฏิบัติทดสอบกับยาเพนนิซิลลิน(6 mg), Amoxycillin (20 mg), เดนท์ (10 มิลลิกรัม) Streptomycin(10 มิลลิกรัม), Streptomycin (500mg), กานามัยซิน (30 mg) Novobiocin(5 mg), Rifampicin (30 mg), Ofloxacin (5 mg) Aztreonam (30 มิลลิกรัม) และCefalotin (30 มิลลิกรัม) โดยใช้การกระจายแผ่นวุ้น assay [24]สารแขวนลอยแบคทีเรีย (108 CFU/mL) ถูก inoculated ในมูลเลอร์Hinton วุ้นที่ใช้ฝ้ายที่ผ่านการฆ่าเชื้อ แผ่นถูกอากาศแห้งสำหรับ15 นาที จากนั้นดิสก์ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะถูกฝากไว้ในการแผ่นหลังจาก h 18 ของบ่มที่ 37 C เส้นผ่านศูนย์กลางเขตการยับยั้งรอบแต่ละดิสก์ที่มีวัด และมีแบ่งสายพันธุ์ทน ทนปานกลาง หรือไวต่อสารต้านจุลชีพตัวแทนที่ขึ้นอยู่กับขนาดโซนยับยั้ง [24,25] หมายถึงอะไรมีรายงานค่าของ assays อิสระสาม2.4

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การแยกเชื้อแบคทีเรียโปรไบโอติก
สามแบคทีเรียกรดแลคติก (LAB) กำหนดให้เป็น FB2, FF2 และ FG1
ใช้ในการศึกษาครั้งนี้แยกได้จากข้าวบาร์เลย์มะกอกหมักและ
เนื้อแห้งแบบดั้งเดิมตามลำดับ สั้น ๆ , สิบกรัมของแต่ละ
ตัวอย่างถูกปั่นใน 90 มลแมน Rogosa และชาร์ป
(MRS) น้ำซุปและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้น 0.1 มิลลิลิตรของ
วัฒนธรรมได้รับการแพร่กระจายบน MRS agar และบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ได้รับอาณานิคมได้รับเลือกโดยใช้คราบแบคทีเรียแกรมบวกการผลิต
ของ catalase และ cytochrome oxidase ลักษณะทางชีวเคมี
ของเชื้อถูกกำหนดโดยใช้ API 50 CHL (Biomerieux,
ฝรั่งเศส) โปรไบโอติกสายพันธุ์ที่มีศักยภาพได้รับการอนุรักษ์ที่
80 ซีในน้ำซุป MRS กับ 30% กลีเซอรอล.
2.2 บัตรประจำตัวกับโมเลกุลของสายพันธุ์ที่คัด
แบคทีเรียดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ตัวช่วยสร้างจีโนมฟอก
Kit (Promega, ลียง, ฝรั่งเศส) ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำ แบคทีเรีย 16S rRNA ยีนลำดับ (1.5 Kb)
ถูกขยายโดยวิธี Polymerase chain reaction ใช้ Universal
ไพรเมอร์ [22] ปฏิกิริยาลำดับดีเอ็นเอได้ดำเนินการใน
ดีเอ็นเอเครื่องยนต์ Tetrad 2 Peltier Cycler ความร้อน (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA) โดยใช้ ABI BigDye Terminator V3.1 ชุดวงจรลำดับ
(Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) สุดท้ายลำดับดีเอ็นเอ
ค้นหาที่คล้ายคลึงกันในฐานข้อมูลของ GenBank ได้ดำเนินการ
โดยใช้ระเบิด.
2.3 การทดสอบสำหรับการพิจารณาความปลอดภัยของ LAB
2.3.1 DNase ทดสอบ
แบคทีเรียแลคที่เลือกปลูกในน้ำซุป MRS กว่าโอน
บน DNase วุ้นที่มีสีฟ้า toluidine กิจกรรม DNase ถูก
อธิบายโดยการสังเกตวงใสรอบอาณานิคม.
2.3.2 กิจกรรม hemolytic
วัฒนธรรมสดของ LAB ถูกลายโคลัมเบียแผ่นวุ้น
ที่มี 5% (w / v) เลือดแกะและบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37 C
[23] แผ่นตรวจหาสัญญาณของ B-ภาวะเม็ดเลือดแดงแตก (โซนที่ชัดเจน
รอบอาณานิคม), A-ภาวะเม็ดเลือดแดงแตก (โซนสีเขียว hued รอบอาณานิคม)
หรือ G-ภาวะเม็ดเลือดแดงแตก (ไม่โซนที่ชัดเจนรอบอาณานิคม) Staphylococcus
aureus ATCC 25923 และ Escherichia coli ATCC 35218 ถูกนำมาใช้เป็น
ตัวควบคุมในเชิงบวกสำหรับ B - และ -hemolysis ตามลำดับ การทดสอบ
ได้ดำเนินการสองครั้ง.
2.3.3 ยาปฏิชีวนะไวของสายพันธุ์ที่คัด
อ่อนแอยาปฏิชีวนะในห้องปฏิบัติการได้รับการทดสอบกับ Penicillin
(6 มก.), อะม็อกซีซิลลิน (20 mg) piperacillin (10 มก.) นี้ streptomycin
(10 มก.) นี้ streptomycin (500 มก.), กานามัยซิ (30 มก.) Novobiocin
(5 มก.) Rifampicin (30 มก.) Ofloxacin (5 มก.) aztreonam (30 mg) และ
เซฟาโลติน (30 มก.) โดยใช้การทดสอบวุ้นแผ่นดิสก์การแพร่กระจาย [24].
แขวนลอยแบคทีเรีย (108 CFU / มิลลิลิตร) ถูกเชื้อใน มุลเลอร์
Hinton agar ใช้สำลีก้อนผ่านการฆ่าเชื้อ แผ่นถูกอากาศแห้งสำหรับ
15 นาทีแล้วแผ่นที่มียาปฏิชีวนะวางบน
แผ่น.
หลังจาก 18 ชั่วโมงของการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางบริเวณยับยั้ง
แต่ละรอบแผ่นดิสก์ถูกวัดและสายพันธุ์ที่ถูกแบ่ง
เป็นทนกลางทนหรือความเสี่ยงที่จะ ยาต้านจุลชีพ
ตัวแทนขึ้นอยู่กับขนาดโซนยับยั้ง [24,25] หมายถึง
ค่านิยมของสามการวิเคราะห์อิสระได้รับรายงาน.
2.4

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . การคัดเลือกโปรไบโอติกแบคทีเรีย3 ) แบคทีเรียแลกติก เขต ff2 fg1 fb2 , และที่ใช้ในการศึกษา คือ แยกจากข้าวบาร์เลย์หมักน้ำมันมะกอกและแบบดั้งเดิม เนื้อแห้ง ตามลำดับ สั้น ๆ , 10 กรัมแต่ละจำนวน 90 มิลลิลิตร rogosa บดในชาย และ ชาร์ป( นาง ) broth บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้น 0.1 มิลลิลิตรของวัฒนธรรมการกระจายในนางวุ้นและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงได้รับอาณานิคมถูกเลือกใช้คราบกรัมบวก การผลิตของสามารถและ นกลุมพู . มีลักษณะทางชีวเคมีของสายพันธุ์ถูกกำหนดใช้ API 50 biomerieux CHL ( ,ฝรั่งเศส ) ศักยภาพของโปรไบโอติกที่อนุรักษ์สายพันธุ์80 C ใน MRS broth กับกลีเซอรอล 30 % .2.2 . การเลือกสายพันธุ์ระดับโมเลกุลแบคทีเรียที่ใช้จีโนมดีเอ็นเอช่วยบำบัดน้ำเสียชุด ( promega Lyon , ฝรั่งเศส ) ตามที่ผู้ผลิตแนะนํา ลำดับเบส 16S rRNA ยีนจากแบคทีเรีย ( 1.5 กิโล )ถูกขยายโดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบสากลไพรเมอร์ [ 22 ] ดีเอ็นเอลำดับปฏิกิริยาแสดงในเครื่องยนต์ความร้อน Peltier ดีเอ็นเอเตแตรด 2 รอบ ( ไบโอ ราด , Hercules , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) ใช้อบิ bigdye Terminator v3.1 ลำดับชุดวงจร( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา สุดท้ายดับดีเอ็นเอเป็นฐานข้อมูลการค้นหาภายในขนาดการใช้ระเบิด2.3 ทดสอบความปลอดภัยของแล็บ2.3.1 . ทดสอบตรวจหา ADNaseห้องปฏิบัติการที่ถูกปลูกใน MRS broth กว่าโอนไปตรวจหา ADNase วุ้นที่มีโทลูอิดีนสีฟ้า การตรวจหา ADNase กิจกรรมอธิบายการสังเกตบริเวณใสรอบโคโลนี .2.3.2 . หลังกิจกรรมวัฒนธรรมใหม่ของแลปลายบนแผ่นวุ้น โคลัมเบียที่ประกอบด้วย 5% ( w / v ) เลือดแกะและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง[ 23 ] แผ่นทดสอบสัญญาณของ b-hemolysis ( โซนใสรอบโคโลนี ) , ( โซนสีเขียว a-hemolysis hued รอบโคโลนี )หรือ g-hemolysis ( ไม่ล้างโซนรอบโคโลนี ) สแตฟิโลคอคคัสaureus ATCC 25923 และ Escherichia coli ATCC 35218 ถูกใช้เป็นบวกการควบคุมสำหรับ B - และ - การตามลำดับ แบคทีเรียแบ่งเป็น 2 ครั้ง2.3.3 . ยาปฏิชีวนะกลุ่มของเลือกสายพันธุ์ความไวของห้องปฏิบัติการทดสอบกับยาปฏิชีวนะเพนนิซิลิน( ลิน ( 6 มก. ) 20 มก. ) , พิเพอราซิลลิน ( 10 mg ) , สเตร็ปโตมัยซิน( 10 mg ) , สเตร็ปโตมัยซิน ( 500 mg ) , kanamycin ( 30 มิลลิกรัม ) โนโวไบโอซิน( 5 มิลลิกรัม ) , rifampicin ( 30 มิลลิกรัม ) ออฟลอกซาซิน ( 5 มิลลิกรัม ) , แอซทรีโอนัม ( 30 มิลลิกรัม ) และเซฟาโลติน ( 30 มิลลิกรัม ) โดยใช้แผ่นวุ้นกระจาย ) [ 24 ]จุลินทรีย์แขวนลอย ( 108 CFU / ml ) ข้ มูลเลอร์วุ้น ฮินตัน โดยใช้ผ้าฝ้าย swabs หมัน แผ่นแห้งสำหรับ15 นาที จากนั้นแผ่นดิสก์ที่มียาปฏิชีวนะเป็นฝากบนแผ่นหลังจาก 18 H บ่มที่อุณหภูมิ 37 บริเวณยับยั้งเส้นผ่าศูนย์กลาง ,รอบแต่ละแผ่นจะถูกวัดและจำแนกสายพันธุ์เป็นป้องกัน ต้านทานปานกลาง หรือเสี่ยงต่อการต้านจุลชีพตัวแทนตามขนาด [ การยับยั้ง 24,25 ] หมายถึง3 ) ค่าอิสระคือ รายงาน2.4 .