It has been recognized that disturb

It has been recognized that disturbed regulation of the cell
cycle is a hallmark of tumor growth.15,22—24) After the treatment
of HeLa cells with 1, 3, 6 and 10 mM rhinacanthone for
4 and 8 h, the percentages of sub G1 hypodiploid cells were
rapidly increased in a dose-dependent manner, whereas the
appearances of the population of cells in the G2/M phase
were slightly increased at only the lowest concentration
(1 mM) in both of indicated time periods (Fig. 5). These results
are agreed with our previous report that rhinacanthins,
another naphthoquinone compounds found in this plant, inhibited
cell proliferation by G2/M cell cycle arrest, although
these compounds had a higher concentration and took a
longer period of time in HeLaS3-treated cells.12) Subsequently,
we confirmed rhinacanthone-induced apoptosis by
means of a biparametric cytofluorometric analysis using annexin
V-FITC and PI staining assay. Consistent with these results,
the percentages of early apoptotic cells (annexin-V
positive and PI negative) increased dose-dependently (2.93—
22.1%), compared to control group (0.88%) after 4 h of rhinacanthone
exposure. Extended time exposure to 8 h, the percentages
of late stage of apoptotic and/or dead cells (annexin-V
and PI-positive) reached about 96.1% at the highest
concentration of 10 mM rhinacanthone (Fig. 6). In view of our
observations, these data suggest that rhinacanthone-induced
apoptosis in HeLa cells led to cell cycle arrest at G2/M phase
at the earlier stage. When the DNA damage in this cell occurred,
it may be irreparable and therefore force the arrest
cells into apoptosis. Similarly, b-lapachone treatment also
caused large increase in sub G1 DNA contents as potent as
rhinacanthone under the same treatment conditions (Fig. 5C);
however its effect on specific phase of cell cycle was not observed.
This observation corresponds to the non-specific cell
cycle arrest caused by b-lapachone treatment in human
breast cancer (MCF-7),43) suggesting that its effect may depend
on the types of cancer cells. In addition, many previous
studies reported that b-lapachone induced cell cycle arrest at
G1 or S phase, unlike most of DNA damaging agents or DNA
topoisomerase poisons which always arrest cancer cells at
G2/M transition.44—46) Therefore, the presence of other pathways
may contribute to strong growth inhibitory effect of blapachone,
which has different actions from the rhinacanthone-treated
HeLa cells. Further studies are needed to determine
the mechanism of DNA damage and pinpoint the pivotal
regulator(s) of the pathway mediated by rhinacanthone
in HeLa cells.
In the mammalian cells, mitochondria are involved in the
apoptosis signal transduction pathway. Release of cytochrome
c and AIF from mitochondria to cytosol, followed by
induction of caspase-9 dependent activation of caspase has
been identified in the process of mitochondria-dependent
apoptosis.20—23) The Bcl-2 family proteins (pro-apoptotic and
anti-apoptotic proteins) and caspase protenases are critical
regulator of the apoptotic pathway.30) Many reports have
demonstrated that translocation of pro-apoptotic Bax to mitochondria
can alter the permeability of cytochrome c or caspases,
e.g., caspases-9, -8, and -3, then activate postmitochondrial
caspase cascade leading to apoptotic cell
death.31) Consistent with this process, our present study provided
that the treatment of HeLa cells by rhinacanthone
(6 mM) for 2, 4, and 8 h, markedly decreased in the expression
of Bcl-2 protein, whereas Bax protein expression was increased,
thereby increased in Bax/Bcl-2 ratio. Moreover, the
treatment reduced the levels of pro-caspase-9 and pro-caspase-3
proteins, whereas it increased levels of active forms of
caspase-9 and caspase-3 (Fig. 8). In the previous report, b-lapachone
also induced apoptosis in bladder cancer cells by
modulation of Bcl-2 family and caspases.47) These findings
imply the possible involvement of intrinsic pathway which is
mediated by caspase-dependent pathway.
Survivin is a member of the IAP protein family that regulates
cell division and suppresses apoptosis.33—35) It contains
1258 Vol. 32, No. 7
Fig. 8. Caspase Activation by the Treatment of HeLa Cells with Rhinacanthone
Cells were treated with 6 mM rhinacanthone for 2, 4 and 8 h and then harvested. Total
cell lysates were prepared and 25 mg of proteins were separated on 12% SDS-PAGE
and transferred to a nitrocellulose membrane. Protein levels of caspases were detected
by Western blot analysis using antibodies against procaspase-3, active caspase-3 and
caspase-9. b-Actin was used to confirm that equal amounts of protein were in each
lane. Data shown are from a representative of three independent experiments with similar
results.
a BIR-domain (Baculoviral IAP repeat) essential for interaction
with pro-apoptotic proteins, such as caspases (caspases-
3 and -7). Survivin is unique among the IAP proteins because
it exhibits cell cycle-regulated expression that peaks at
G2/M phase. Down-regul

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มันได้รับการยอมรับที่ถูกรบกวนของเซลล์รอบเป็นจุดเด่นของเนื้องอก growth.15,22—24) หลังการรักษาของเซลล์ HeLa กับ 1, 3, 6 และ 10 rhinacanthone มม.สำหรับ4 และ 8 h มีเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ย่อย G1 hypodiploidเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว โดยขึ้นอยู่กับปริมาณ ขณะลักษณะของประชากรของเซลล์ในระยะ G2/Mเพิ่มขึ้นเล็กน้อยที่ความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดเท่านั้น(1 mM) ในรอบระยะเวลาที่ระบุไว้ (รูป 5) ทั้งสอง ผลลัพธ์เหล่านี้เห็นด้วยกับเราก่อนหน้านี้รายงาน rhinacanthins ที่ยับยั้งสาร naphthoquinone อื่นที่พบในพืชนี้การแพร่กระจายของเซลล์ โดยการจับกุมรอบเซลล์ G2/M แม้ว่าสารเหล่านี้มีความเข้มข้นสูง และเอาการระยะเวลาในการรักษา HeLaS3 cells.12) ในเวลาต่อมาเรายืนยันเกิด rhinacanthone กันโดยวิธีการของการวิเคราะห์ cytofluorometric biparametric ใช้ annexinV-FITC และ PI คราบทดสอบ สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้เปอร์เซ็นต์ของต้น apoptotic เซลล์ (annexin Vค่าบวกและค่าลบ PI) เพิ่มยา dependently (2.93 —22.1%), เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (0.88%) หลังจาก 4 ชั่วโมงของ rhinacanthoneแสง ขยายเวลาแสง 8 h เปอร์เซ็นต์ระยะของสายของ apoptotic หรือเซลล์ที่ตายแล้ว (annexin Vและ บวก PI) ถึงประมาณ 96.1% สูงสุดความเข้มข้นของ rhinacanthone 10 มม. (6 รูป) ในมุมมองของเราสังเกต ข้อมูลเหล่านี้แนะนำที่ rhinacanthone เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ HeLa นำวงจรจับที่ระยะ G2/Mในขั้นตอนก่อนหน้านี้ เมื่อเกิดความเสียหายของดีเอ็นเอในเซลล์นี้มันอาจมีทั้ง และดังนั้นจึง บังคับให้จับกุมเซลล์เข้ากัน ในทำนองเดียวกัน b lapachone รักษายังขนาดใหญ่สาเหตุย่อยเนื้อหา G1 ดีเอ็นเอที่มีศักยภาพเป็นrhinacanthone ภายใต้เงื่อนไขการรักษาเดียวกัน (รูป 5C);อย่างไรก็ตาม ผลในระยะใดระยะหนึ่งของวงจรถูกตรวจสอบสังเกตนี้สอดคล้องกับเซลล์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงรอบ b lapachone รักษาในมนุษย์เกิดจากการจับกุมป้องกันโรคมะเร็ง (MCF-7), 43) บอกว่า ผลของมันอาจขึ้นกับชนิดของเซลล์มะเร็ง นอกจากนี้ หลายคนก่อนหน้านี้ศึกษารายงานการจับกุมที่วงจร b-lapachone เกิดที่ระยะที่เป็น G1 หรือ S ซึ่งแตกต่างจากส่วนใหญ่ของดีเอ็นเอหรือดีเอ็นเอที่เสียหายแทนสารพิษ topoisomerase ซึ่งจะจับเซลล์มะเร็งที่G2/M transition.44—46) ดังนั้น การปรากฏตัวของทางเดินอื่น ๆอาจนำไปสู่ผล inhibitory เติบโตแข็งแกร่งของ blapachoneซึ่งมีการกระทำแตกต่างกันถือว่า rhinacanthoneมีเซลล์ HeLa ศึกษาต่อจะต้องตรวจสอบกลไกของความเสียหายของดีเอ็นเอและแน่นอนที่สำคัญregulator(s) ของทางเดินที่มี โดย rhinacanthoneในเซลล์ HeLaในเซลล์ไว mitochondria มีส่วนร่วมในการกันสัญญาณคือ รุ่นที่เจาะจงc และ AIF จาก mitochondria เพื่อไซโตซอล ตามด้วยมีการเหนี่ยวนำของ caspase-9 ขึ้นอยู่กับงานของ caspaseระบุในกระบวนการขึ้นอยู่กับ mitochondriaโปรตีน apoptosis.20—23) ครอบครัว Bcl-2 (apoptotic โป และanti-apoptotic proteins) and caspase protenases are criticalregulator of the apoptotic pathway.30) Many reports havedemonstrated that translocation of pro-apoptotic Bax to mitochondriacan alter the permeability of cytochrome c or caspases,e.g., caspases-9, -8, and -3, then activate postmitochondrialcaspase cascade leading to apoptotic celldeath.31) Consistent with this process, our present study providedthat the treatment of HeLa cells by rhinacanthone(6 mM) for 2, 4, and 8 h, markedly decreased in the expressionof Bcl-2 protein, whereas Bax protein expression was increased,thereby increased in Bax/Bcl-2 ratio. Moreover, thetreatment reduced the levels of pro-caspase-9 and pro-caspase-3proteins, whereas it increased levels of active forms ofcaspase-9 and caspase-3 (Fig. 8). In the previous report, b-lapachonealso induced apoptosis in bladder cancer cells bymodulation of Bcl-2 family and caspases.47) These findingsimply the possible involvement of intrinsic pathway which ismediated by caspase-dependent pathway.Survivin is a member of the IAP protein family that regulatescell division and suppresses apoptosis.33—35) It contains1258 Vol. 32, No. 7Fig. 8. Caspase Activation by the Treatment of HeLa Cells with RhinacanthoneCells were treated with 6 mM rhinacanthone for 2, 4 and 8 h and then harvested. Totalcell lysates were prepared and 25 mg of proteins were separated on 12% SDS-PAGEand transferred to a nitrocellulose membrane. Protein levels of caspases were detectedby Western blot analysis using antibodies against procaspase-3, active caspase-3 andcaspase-9. b-Actin was used to confirm that equal amounts of protein were in eachlane. Data shown are from a representative of three independent experiments with similarresults.a BIR-domain (Baculoviral IAP repeat) essential for interactionwith pro-apoptotic proteins, such as caspases (caspases-3 and -7). Survivin is unique among the IAP proteins becauseit exhibits cell cycle-regulated expression that peaks atG2/M phase. Down-regul

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มันได้รับการยอมรับว่ารบกวนการควบคุมเซลล์วงจรคือจุดเด่นของการเจริญเติบโตของมะเร็ง 15,22-24 ) หลังจากการรักษาล่าเซลล์ของ 1 , 3 , 6 และ 10 มม. rhinacanthone สำหรับ4 และ 8 ชั่วโมง ค่าซับ G1 hypodiploid เซลล์คือเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในลักษณะรายงาน ขณะที่ลักษณะของประชากรของเซลล์ในเฟส G2 / Mมีเพิ่มขึ้นเล็กน้อยเพียงความเข้มข้นต่ำสุด( 1 เดือน ) ทั้งแบบช่วงเวลา ( ภาพที่ 5 ) ผลลัพธ์เหล่านี้ก็เห็นด้วยกับรายงานก่อนหน้านี้ว่า รนาแคนทินของเรา ,แนพโทควิโนน สารอื่นพบในพืชนี้ ห้ามเซลล์โดยเซลล์ proliferation G2 / M รอบจับ แม้ว่าสารประกอบเหล่านี้มีความเข้มข้นสูงขึ้น และเอาระยะเวลาของการรักษาใน helas3 เซลล์ 12 ) ภายหลังเรายืนยัน rhinacanthone ชักนำอะพอพโทซิสโดยความหมายของ biparametric cytofluorometric ของเซลล์ การ ใช้v-fitc ปี่ staining และการทดสอบ สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้กลุ่มที่มีเปอร์เซ็นต์เซลล์แรก ( annexin-vพีบวกและลบ ) เพิ่มปริมาณ dependently ( 2.93 -ร้อยละ 22.1 ) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ( 0.88 % ) หลังจาก 4 ชั่วโมงของ rhinacanthoneการเปิดรับแสง ขยายเวลาเปิดรับ 8 h , ค่าเวทีของกลุ่มที่มีสายและ / หรือเซลล์ที่ตายแล้ว ( annexin-vและ พีบวก ) ถึงประมาณ 96.1 % ที่สูงสุดความเข้มข้น 10 mM rhinacanthone ( ภาพที่ 6 ) ในมุมมองของเราสังเกต ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า rhinacanthone ชักนำการตายแบบ apoptosis ในเซลล์ Hela นำไปสู่วัฏจักรเซลล์จับที่เฟส G2 / Mในขั้นตอนก่อนหน้านี้ เมื่อความเสียหายของดีเอ็นเอในเซลล์นี้เกิดขึ้นมันอาจจะไม่สามารถแก้ไขได้ จึงบังคับให้จับกุมเซลล์ในเซลล์ . ในทํานองเดียวกัน b-lapachone รักษายังทำให้เพิ่มขึ้นมากในเนื้อหา เป็นต้า เป็น Sub G1 ดีเอ็นเอrhinacanthone ภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน ( รูปที่ 5 )อย่างไรก็ตามผลกระทบต่อขั้นตอนที่เฉพาะเจาะจงของวัฏจักรเซลล์ก็ไม่ได้สังเกตการสังเกตนี้สอดคล้องกับเซลล์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงวงจรการจับกุมที่เกิดจากการรักษา b-lapachone ในมนุษย์มะเร็งเต้านม ( mcf-7 ) 43 ) แนะนำว่า ผลของมันอาจจะขึ้นอยู่กับในชนิดของเซลล์มะเร็ง นอกจากนี้หลาย ก่อนหน้านี้การศึกษารายงานว่าสามารถจับกุม b-lapachone วัฏจักรของเซลล์ที่G1 หรือ S เฟส ซึ่งแตกต่างจากส่วนใหญ่ของตัวแทนหรือดีเอ็นเอดีเอ็นเอเสียหายยาพิษชนิดที่มักจะจับเซลล์มะเร็งG2 / M เปลี่ยน 44-46 ) ดังนั้น การปรากฏตัวของเส้นทางอื่น ๆอาจช่วยยับยั้งผลของ blapachone การเจริญเติบโตที่แข็งแกร่ง ,ซึ่งมีการกระทำที่แตกต่างจาก rhinacanthone ปฏิบัติล่าเซลล์ การศึกษาเพิ่มเติมจะต้องตรวจสอบกลไกความเสียหาย DNA และระบุลงไปควบคุม ( s ) ของเส้นทาง โดย rhinacanthone คนกลางในล่าเซลล์ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม , ไมโตคอนเดรียที่เกี่ยวข้องในเกิดสัญญาณผ่านทาง ปลดปล่อยไซโตโครมองศาเซลเซียส และเกิดจากไมโตคอนเดรียเพื่อออกไป ตามด้วยการเหนี่ยวนำการกระตุ้น caspase-9 ของแคสเปสได้ขึ้นอยู่กับได้รับการระบุในกระบวนการของ mitochondria ขึ้นอยู่ปกติ 20-23 ) โปรตีน ( กลุ่มที่มีครอบครัว bcl-2 Pro และกลุ่มที่มีโปรตีนต่อต้าน ) และมี protenases แคสเปสควบคุมของทางกลุ่มที่มี 30 ) มีรายงานหลายพบว่าในกลุ่มที่มีการเคลื่อนย้ายของ BAX ) โปรสามารถเปลี่ยนค่าการซึมผ่านของไซโตโครม หรือ caspases C ,เช่น caspases-9 - 8 และ - 3 แล้วเปิดใช้งาน postmitochondrialแคสเปสน้ำตกนำไปสู่กลุ่มที่มีเซลล์ความตาย . 31 ) สอดคล้องกับกระบวนการนี้ ปัจจุบันการศึกษาให้ที่การรักษาโดย rhinacanthone ล่าเซลล์( 6 มม. ) 2 , 4 และ 8 ชั่วโมง ลดลงในการแสดงออกของ bcl-2 โปรตีน ในขณะที่การแสดงออกของโปรตีน BAX เพิ่มขึ้นจึงเพิ่มขึ้นใน bcl-2 BAX / อัตราส่วน นอกจากนี้การลดระดับของ pro-caspase-9 และ pro-caspase-3โปรตีน ส่วนระดับที่เพิ่มขึ้นของรูปแบบงานการศึกษาลักษณะและ caspase-9 ( รูปที่ 8 ) ในรายงานก่อนหน้านี้ , b-lapachoneยังชักนำอะพอพโทซิสในเซลล์มะเร็งกระเพาะปัสสาวะโครงสร้างของครอบครัวและ bcl-2 caspases 47 ) ผลนี้บ่งบอกถึงการมีส่วนร่วมที่แท้จริงที่สุดของทางเดินซึ่งเป็นโดยแคสเปส ( ขึ้นอยู่กับเส้นทางดิก เป็นสมาชิกของครอบครัวของโปรตีนที่ควบคุมการเข้าเป็นสมาชิกการแบ่งเซลล์และยับยั้งปกติไม่เกิน 30 ) ประกอบด้วย1 ฉบับที่ 32 , หมายเลข 7รูปที่ 8 แคสเปสการกระตุ้นโดยการรักษาด้วย rhinacanthone ล่าเซลล์เซลล์จะถูก rhinacanthone 6 มม. 2 , 4 และ 8 ชั่วโมง และการเก็บเกี่ยว รวมเซลล์ lysates เตรียมและ 25 มิลลิกรัม โปรตีน 12 % ถูกแยกกันและย้ายไปเป็นไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน ระดับโปรตีนของ caspases ถูกตรวจพบโดยการใช้แอนติบอดีต่อ procaspase-3 Western blot analysis , การศึกษาลักษณะงานและcaspase-9 . b-actin ถูกใช้เพื่อยืนยันว่าปริมาณที่เท่ากันของโปรตีน คือ ในแต่ละเลน ข้อมูลที่แสดงจากตัวแทนของ 3 การทดลองอิสระคล้ายผลลัพธ์เป็นเบอร์ของโดเมน ( baculoviral IAP ย้ำ ) ที่จำเป็นสำหรับการปฏิสัมพันธ์กับโปรในกลุ่มที่มีโปรตีน เช่น caspases ( caspases -3 - 7 ) ดิก เป็นเอกลักษณ์ของโปรตีน เพราะเข้าเป็นสมาชิกมันแสดงวงจรควบคุมการแสดงออกที่ยอดเขาที่เฟส G2 / M .