2.3. PCR amplificationPrimers PBFD-

2.3. PCR amplification
Primers PBFD-F GCCCACGTGACTTCAAGACT and PBFD-R ACGGAGCATTTCGCAATAAG
(Metabion, Germany) were designed using
Primer 3 express software to amplify a 194-bp region of the
replication associated protein gene (V1) (Gene bank accession
DQ397817.1) of beak and feather disease virus isolate AFG5-ZA.
These were used in conjunction with the Taqman probe FamTCGTGGGGACCTCGATCTCACTCG-Tamra.
The real-time PCR was
performed usingRoche Light Cycler 2.0 (Manheim, Germany) under
the following conditions: initial denaturation at 95 ◦C for 8 min,
amplification at 95 ◦C for 10 s, 51 ◦C for 20 s and 72 ◦C for 30 s for
45 cycles. A Circovirus positive amplification control and negative
control without DNA was included in the PCR. Samples that showed
a Ct value of ≤40 and an exponential fluorescence were scored as
positive and samples that did not fulfill these criteria were scored
as negative.
2.4. Duplex PCR with internal control
To ensure the success of our extraction protocol, we incorporated
an internal DNA extraction control (DEC) (Bioline, UK) in the
sample. 4 L of DEC was added to the sample or PBS (negative
extraction control) at the lysis stage and extraction was done as
above using the Qiagen DNeasy blood and tissue kit. Duplex PCR
with internal control primer (control mix) (Bioline, UK) was setup
with the same cycling conditions as above.
2.5. Sensitivity
Sensitivity of the test was determined by making 10-fold serial
dilutions of DNA obtained from positive blood and feather samples
with an initial concentration of 86 and 35 ng/L, respectively. PCR
amplification was performed using at least 8 log dilutions and a
standard curve was prepared.
2.6. Sequencing
Circovirus positive DNA from 7 African Grey Parrots, 3 Macaws
and 2Cockatoos were selected for sequencing. Forward andReverse
primers were: PBFD-F and PBFD-R. Sequencing was done using
dideoxy Sanger method and run on the ABI 3730 XL (USA).
Sequences were analyzed using sequencing analysis software (Version
5.1.1) and aligned using DNAMAN.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 โดยเพิ่มจำนวนไพรเมอร์ pbfd-f gcccacgtgacttcaagact pbfd-r acggagcatttcgcaataag และ( metabion , เยอรมนี ) ถูกออกแบบมาโดยใช้ไพรเมอร์ 3 บริการซอฟต์แวร์เพื่อขยายขอบเขตของการเกิด BPคำตอบที่ยีนโปรตีน ( V1 ) ( ธนาคารยีนสูdq397817.1 ) ของไวรัสโรคปาก และขนแยก afg5-za .เหล่านี้ถูกใช้ร่วมกับ taqman โพรบ famtcgtggggacctcgatctcactcg Tamra .ส่วน PCR แบบเรียลไทม์ คือแสดง usingroche แสงรอบ 2.0 ( Manheim , เยอรมนี ) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : เริ่มต้นที่ 95 ( ◦ C เป็นเวลา 8 นาที( 95 ◦ C 10 , 51 ◦ C 20 และ 72 ◦เป็นเวลา 30 วินาที45 รอบ เซอร์โคไวรัสแบบการควบคุมและลบเป็นบวกการควบคุมโดยไม่ต้องถูกรวมอยู่ใน DNA PCR ตัวอย่างที่แสดงCT ค่า≤ 40 และการให้คะแนนเป็นเลขชี้กำลังบวกและตัวอย่างที่ไม่ปฏิบัติตามหลักเกณฑ์เหล่านี้ได้เป็นลบ2.4 . Duplex PCR กับการควบคุมภายในเพื่อความสำเร็จของขั้นตอนการสกัดของเราเรารวมภายในการสกัดดีเอ็นเอควบคุม ( ธ.ค. ) ( bioline , UK ) ในตัวอย่าง 4 ลิตรธ.ค. คือเพิ่มตัวอย่างหรือ PBS ( ลบควบคุมการสกัด ) ในการสลายเวทีและสกัดเป็นข้างต้นที่ใช้เพิ่มเลือดและชุด dneasy เนื้อเยื่อ เพล็กซ์พีซีอาร์กับแนวทางการควบคุมภายใน ( ผสมควบคุม ) ( bioline , UK ) ได้ติดตั้งกับจักรยานเงื่อนไขข้างต้น2.5 ความไวความไวของการทดสอบถูกกำหนดโดยให้ 10 เท่า อนุกรมวิธีการของดีเอ็นเอที่ได้จากตัวอย่างเลือดบวก และขนนกมีความเข้มข้นเริ่มต้นของ 86 และ 35 กรัม / ลิตร ตามลำดับ ดีเอ็นเอขยายการใช้อย่างน้อย 8 เข้าสู่ระบบวิธีการ และมาตรฐานเส้นโค้งที่เตรียมไว้2.6 ลำดับดีเอ็นเอบวกเซอร์โคไวรัสจาก 7 แอฟริกาสีเทาแก้ว 3 มา คอว์และ 2cockatoos สุ่มของ ส่งต่อ andreverseโดย : pbfd-f pbfd-r. ลำดับและได้ใช้dideoxy Sanger ) วิ่งบน ABI 940 XL ( USA )ลําดับ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ระบบซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ ( รุ่น5.1.1 ) และสามารถใช้ dnaman .