- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Fighting malaria with engineered sy
Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes
Sibao Wanga, Anil K. Ghosha, Nicholas Bongiob, Kevin A. Stebbingsb,1, David J. Lampeb, and Marcelo Jacobs-Lorenaa,2
aDepartment of Molecular Microbiology and Immunology, Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD 21205; and bDepartment of Biological Sciences, Duquesne University, Pittsburgh, PA 15282
Edited by Nancy A. Moran, Yale University, West Haven, CT, and approved June 7, 2012 (received for review March 9, 2012)
The most vulnerable stages of Plasmodium development occur in the lumen of the mosquito midgut, a compartment shared with symbiotic bacteria. Here, we describe a strategy that uses symbiotic bacteria to deliver antimalaria effector molecules to the midgut lumen, thus rendering host mosquitoes refractory to malaria infec- tion. The Escherichia coli hemolysin A secretion system was used to promote the secretion of a variety of anti-Plasmodium effector proteins by Pantoea agglomerans, a common mosquito symbiotic bacterium. These engineered P. agglomerans strains inhibited de- velopment of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and rodent malaria parasite Plasmodium berghei by up to 98%. Significantly, the proportion of mosquitoes carrying parasites (prev- alence) decreased by up to 84% for two of the effector molecules, scorpine, a potent antiplasmodial peptide and (EPIP)4, four copies of Plasmodium enolase–plasminogen interaction peptide that prevents plasminogen binding to the ookinete surface. We demonstrate the use of an engineered symbiotic bacterium to interfere with the de- velopment of P. falciparum in the mosquito. These findings provide the foundation for the use of genetically modified symbiotic bacte- ria as a powerful tool to combat malaria.
Anopheles gambiae | malaria control | paratransgenesis | transmission blocking
Malaria is one of the most lethal infectious diseases. Close to half of the population of the world is at risk, about 300–500 million contract the disease annually, and about 1.2 million people die of malaria every year (1). Continuous emergence of mosquito insecticide resistance and parasite drug resistance, combined with the lack of an effective malaria vaccine, severely limits our ability to counteract this intolerable burden (2, 3). New weapons to fight the disease are urgently needed.
Unlike the other two major infectious diseases (AIDS and tu- berculosis) that are transmitted directly from person to person, transmission of Plasmodium, the causative agent of malaria, strictly depends on the completion of a complex developmental cycle in vector mosquitoes (4). A mosquito may ingest on the order of 103 to 104 gametocytes from an infected human that quickly differen- tiate into male and female gametes that mate to produce zygotes, which, in turn, differentiate into ∼102 to 103 motile ookinetes. Ookinetes then migrate within the blood bolus until they reach the midgut epithelium, where they then traverse and differentiate into oocysts. Upon maturation, each oocyst releases thousands of sporozoites into the hemocoel, followed by invasion of the mos- quito salivary glands. The transmission cycle is completed when the infected mosquito bites the next vertebrate host and delivers some of the sporozoites with the saliva (5). Clearly, a severe bottleneck occurs during the mosquito midgut stages of parasite development: even in areas of high transmission, mosquitoes typically carry five or fewer oocysts (5). This bottleneck makes the mosquito midgut a prime target for intervention (6, 7).
One option to interfere with parasite transmission is to ge- netically modify mosquitoes for midgut expression of “effector genes” that inhibit parasite development. Past evidence suggests that this strategy works successfully in the laboratory (8–11). However, one unresolved challenge is how to drive transgenes
into wild mosquito populations. Various genetic drive mecha- nisms have been proposed to accomplish this goal (12, 13), but these are technically very challenging, and it is not clear in what time frame they will succeed. An important additional challenge faced by genetic drive approaches, in general, is that anopheline vectors frequently occur in the field as reproductively isolated populations, thus posing a barrier for gene flow from one pop- ulation to another.
An alternative strategy to deliver effector molecules is to en- gineer symbiotic bacteria from the mosquito midgut microbiome to produce the interfering proteins (paratransgenesis) (14). A key strategic consideration is that the mosquito microbiome (15, 16) resides in the same compartment where the most vulnerable stages of malaria parasite development occur (7). Moreover, bac- teria numbers increase dramatically (hundreds- to thousands-fold) after ingestion of a blood meal (15), and output of anti-Plasmodium effector molecules from engineered bacteria can be expected to increase proportionally.
Paratransgenesis has shown promise for the control of other insect-borne disease (14). Chagas disease caused by the parasitic protozoan Trypanosoma cruzi is transmitted by the triatomid bug, Rhodnius prolixus. In proof-of-concept experiments, an obligate commensal Gram-positive bacterium was genetically modified to secrete cecropin A, a peptide that kills T. cruzi, making the bug refractory to the parasite (14). Our previous study using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei and the Anopheles stephensi vector mosquito suggested that recombinant Escher- ichia coli expressing on their surface either a dimer of the salivary gland and midgut peptide 1 (SM1) or a modified phospholipase reduced oocyst formation (17). Yoshida et al. (18) also showed that recombinant E. coli expressing a single-chain immunotoxin significantly reduces P. berghei oocyst density in A. stephensi mosquitoes. One limitation of these earlier experiments is that they used E. coli, an attenuated laboratory bacterium that sur- vives poorly in the mosquito gut (17). A second limitation was that the recombinant effector molecules either remained attached to the bacterial surface (17) or formed an insoluble inclusion body within the bacterial cells (18), thus preventing diffusion of the effector molecules to their parasite or mosquito midgut targets.
Here, we describe a substantially improved strategy to deliver effector molecules by engineering a natural symbiotic bacterium Pantoea agglomerans (previously known as Enterobacter agglom- erans) to secrete antimalaria proteins in the mosquito midgut. We found that the development of the human parasite Plasmodium
Author contributions: S.W., A.K.G., D.J.L., and M.J.-L. designed research; S.W., A.K.G., N.B., and K.A.S. performed research; N.B., K.A.S., and D.J.L. contributed new reagents/ analytic tools; S.W., A.K.G., and M.J.-L. analyzed data; and S.W., A.K.G., and M.J.-L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
1Present address: Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana–Champaign, Urbana, IL 61801.
2To whom correspondence should be addressed. E-mail: mlorena@jhsph.edu.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1204158109/-/DCSupplemental.
12734–12739 | PNAS | July 31, 2012 | vol. 109 | no. 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
Sibao Wanga, Anil K. Ghosha, Nicholas Bongiob, Kevin A. Stebbingsb,1, David J. Lampeb, and Marcelo Jacobs-Lorenaa,2
aDepartment of Molecular Microbiology and Immunology, Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD 21205; and bDepartment of Biological Sciences, Duquesne University, Pittsburgh, PA 15282
Edited by Nancy A. Moran, Yale University, West Haven, CT, and approved June 7, 2012 (received for review March 9, 2012)
The most vulnerable stages of Plasmodium development occur in the lumen of the mosquito midgut, a compartment shared with symbiotic bacteria. Here, we describe a strategy that uses symbiotic bacteria to deliver antimalaria effector molecules to the midgut lumen, thus rendering host mosquitoes refractory to malaria infec- tion. The Escherichia coli hemolysin A secretion system was used to promote the secretion of a variety of anti-Plasmodium effector proteins by Pantoea agglomerans, a common mosquito symbiotic bacterium. These engineered P. agglomerans strains inhibited de- velopment of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and rodent malaria parasite Plasmodium berghei by up to 98%. Significantly, the proportion of mosquitoes carrying parasites (prev- alence) decreased by up to 84% for two of the effector molecules, scorpine, a potent antiplasmodial peptide and (EPIP)4, four copies of Plasmodium enolase–plasminogen interaction peptide that prevents plasminogen binding to the ookinete surface. We demonstrate the use of an engineered symbiotic bacterium to interfere with the de- velopment of P. falciparum in the mosquito. These findings provide the foundation for the use of genetically modified symbiotic bacte- ria as a powerful tool to combat malaria.
Anopheles gambiae | malaria control | paratransgenesis | transmission blocking
Malaria is one of the most lethal infectious diseases. Close to half of the population of the world is at risk, about 300–500 million contract the disease annually, and about 1.2 million people die of malaria every year (1). Continuous emergence of mosquito insecticide resistance and parasite drug resistance, combined with the lack of an effective malaria vaccine, severely limits our ability to counteract this intolerable burden (2, 3). New weapons to fight the disease are urgently needed.
Unlike the other two major infectious diseases (AIDS and tu- berculosis) that are transmitted directly from person to person, transmission of Plasmodium, the causative agent of malaria, strictly depends on the completion of a complex developmental cycle in vector mosquitoes (4). A mosquito may ingest on the order of 103 to 104 gametocytes from an infected human that quickly differen- tiate into male and female gametes that mate to produce zygotes, which, in turn, differentiate into ∼102 to 103 motile ookinetes. Ookinetes then migrate within the blood bolus until they reach the midgut epithelium, where they then traverse and differentiate into oocysts. Upon maturation, each oocyst releases thousands of sporozoites into the hemocoel, followed by invasion of the mos- quito salivary glands. The transmission cycle is completed when the infected mosquito bites the next vertebrate host and delivers some of the sporozoites with the saliva (5). Clearly, a severe bottleneck occurs during the mosquito midgut stages of parasite development: even in areas of high transmission, mosquitoes typically carry five or fewer oocysts (5). This bottleneck makes the mosquito midgut a prime target for intervention (6, 7).
One option to interfere with parasite transmission is to ge- netically modify mosquitoes for midgut expression of “effector genes” that inhibit parasite development. Past evidence suggests that this strategy works successfully in the laboratory (8–11). However, one unresolved challenge is how to drive transgenes
into wild mosquito populations. Various genetic drive mecha- nisms have been proposed to accomplish this goal (12, 13), but these are technically very challenging, and it is not clear in what time frame they will succeed. An important additional challenge faced by genetic drive approaches, in general, is that anopheline vectors frequently occur in the field as reproductively isolated populations, thus posing a barrier for gene flow from one pop- ulation to another.
An alternative strategy to deliver effector molecules is to en- gineer symbiotic bacteria from the mosquito midgut microbiome to produce the interfering proteins (paratransgenesis) (14). A key strategic consideration is that the mosquito microbiome (15, 16) resides in the same compartment where the most vulnerable stages of malaria parasite development occur (7). Moreover, bac- teria numbers increase dramatically (hundreds- to thousands-fold) after ingestion of a blood meal (15), and output of anti-Plasmodium effector molecules from engineered bacteria can be expected to increase proportionally.
Paratransgenesis has shown promise for the control of other insect-borne disease (14). Chagas disease caused by the parasitic protozoan Trypanosoma cruzi is transmitted by the triatomid bug, Rhodnius prolixus. In proof-of-concept experiments, an obligate commensal Gram-positive bacterium was genetically modified to secrete cecropin A, a peptide that kills T. cruzi, making the bug refractory to the parasite (14). Our previous study using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei and the Anopheles stephensi vector mosquito suggested that recombinant Escher- ichia coli expressing on their surface either a dimer of the salivary gland and midgut peptide 1 (SM1) or a modified phospholipase reduced oocyst formation (17). Yoshida et al. (18) also showed that recombinant E. coli expressing a single-chain immunotoxin significantly reduces P. berghei oocyst density in A. stephensi mosquitoes. One limitation of these earlier experiments is that they used E. coli, an attenuated laboratory bacterium that sur- vives poorly in the mosquito gut (17). A second limitation was that the recombinant effector molecules either remained attached to the bacterial surface (17) or formed an insoluble inclusion body within the bacterial cells (18), thus preventing diffusion of the effector molecules to their parasite or mosquito midgut targets.
Here, we describe a substantially improved strategy to deliver effector molecules by engineering a natural symbiotic bacterium Pantoea agglomerans (previously known as Enterobacter agglom- erans) to secrete antimalaria proteins in the mosquito midgut. We found that the development of the human parasite Plasmodium
Author contributions: S.W., A.K.G., D.J.L., and M.J.-L. designed research; S.W., A.K.G., N.B., and K.A.S. performed research; N.B., K.A.S., and D.J.L. contributed new reagents/ analytic tools; S.W., A.K.G., and M.J.-L. analyzed data; and S.W., A.K.G., and M.J.-L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
1Present address: Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana–Champaign, Urbana, IL 61801.
2To whom correspondence should be addressed. E-mail: mlorena@jhsph.edu.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1204158109/-/DCSupplemental.
12734–12739 | PNAS | July 31, 2012 | vol. 109 | no. 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
0/5000
Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoesSibao Wanga, Anil K. Ghosha, Nicholas Bongiob, Kevin A. Stebbingsb,1, David J. Lampeb, and Marcelo Jacobs-Lorenaa,2aDepartment of Molecular Microbiology and Immunology, Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD 21205; and bDepartment of Biological Sciences, Duquesne University, Pittsburgh, PA 15282Edited by Nancy A. Moran, Yale University, West Haven, CT, and approved June 7, 2012 (received for review March 9, 2012)The most vulnerable stages of Plasmodium development occur in the lumen of the mosquito midgut, a compartment shared with symbiotic bacteria. Here, we describe a strategy that uses symbiotic bacteria to deliver antimalaria effector molecules to the midgut lumen, thus rendering host mosquitoes refractory to malaria infec- tion. The Escherichia coli hemolysin A secretion system was used to promote the secretion of a variety of anti-Plasmodium effector proteins by Pantoea agglomerans, a common mosquito symbiotic bacterium. These engineered P. agglomerans strains inhibited de- velopment of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and rodent malaria parasite Plasmodium berghei by up to 98%. Significantly, the proportion of mosquitoes carrying parasites (prev- alence) decreased by up to 84% for two of the effector molecules, scorpine, a potent antiplasmodial peptide and (EPIP)4, four copies of Plasmodium enolase–plasminogen interaction peptide that prevents plasminogen binding to the ookinete surface. We demonstrate the use of an engineered symbiotic bacterium to interfere with the de- velopment of P. falciparum in the mosquito. These findings provide the foundation for the use of genetically modified symbiotic bacte- ria as a powerful tool to combat malaria.Anopheles gambiae | malaria control | paratransgenesis | transmission blocking
Malaria is one of the most lethal infectious diseases. Close to half of the population of the world is at risk, about 300–500 million contract the disease annually, and about 1.2 million people die of malaria every year (1). Continuous emergence of mosquito insecticide resistance and parasite drug resistance, combined with the lack of an effective malaria vaccine, severely limits our ability to counteract this intolerable burden (2, 3). New weapons to fight the disease are urgently needed.
Unlike the other two major infectious diseases (AIDS and tu- berculosis) that are transmitted directly from person to person, transmission of Plasmodium, the causative agent of malaria, strictly depends on the completion of a complex developmental cycle in vector mosquitoes (4). A mosquito may ingest on the order of 103 to 104 gametocytes from an infected human that quickly differen- tiate into male and female gametes that mate to produce zygotes, which, in turn, differentiate into ∼102 to 103 motile ookinetes. Ookinetes then migrate within the blood bolus until they reach the midgut epithelium, where they then traverse and differentiate into oocysts. Upon maturation, each oocyst releases thousands of sporozoites into the hemocoel, followed by invasion of the mos- quito salivary glands. The transmission cycle is completed when the infected mosquito bites the next vertebrate host and delivers some of the sporozoites with the saliva (5). Clearly, a severe bottleneck occurs during the mosquito midgut stages of parasite development: even in areas of high transmission, mosquitoes typically carry five or fewer oocysts (5). This bottleneck makes the mosquito midgut a prime target for intervention (6, 7).
One option to interfere with parasite transmission is to ge- netically modify mosquitoes for midgut expression of “effector genes” that inhibit parasite development. Past evidence suggests that this strategy works successfully in the laboratory (8–11). However, one unresolved challenge is how to drive transgenes
into wild mosquito populations. Various genetic drive mecha- nisms have been proposed to accomplish this goal (12, 13), but these are technically very challenging, and it is not clear in what time frame they will succeed. An important additional challenge faced by genetic drive approaches, in general, is that anopheline vectors frequently occur in the field as reproductively isolated populations, thus posing a barrier for gene flow from one pop- ulation to another.
An alternative strategy to deliver effector molecules is to en- gineer symbiotic bacteria from the mosquito midgut microbiome to produce the interfering proteins (paratransgenesis) (14). A key strategic consideration is that the mosquito microbiome (15, 16) resides in the same compartment where the most vulnerable stages of malaria parasite development occur (7). Moreover, bac- teria numbers increase dramatically (hundreds- to thousands-fold) after ingestion of a blood meal (15), and output of anti-Plasmodium effector molecules from engineered bacteria can be expected to increase proportionally.
Paratransgenesis has shown promise for the control of other insect-borne disease (14). Chagas disease caused by the parasitic protozoan Trypanosoma cruzi is transmitted by the triatomid bug, Rhodnius prolixus. In proof-of-concept experiments, an obligate commensal Gram-positive bacterium was genetically modified to secrete cecropin A, a peptide that kills T. cruzi, making the bug refractory to the parasite (14). Our previous study using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei and the Anopheles stephensi vector mosquito suggested that recombinant Escher- ichia coli expressing on their surface either a dimer of the salivary gland and midgut peptide 1 (SM1) or a modified phospholipase reduced oocyst formation (17). Yoshida et al. (18) also showed that recombinant E. coli expressing a single-chain immunotoxin significantly reduces P. berghei oocyst density in A. stephensi mosquitoes. One limitation of these earlier experiments is that they used E. coli, an attenuated laboratory bacterium that sur- vives poorly in the mosquito gut (17). A second limitation was that the recombinant effector molecules either remained attached to the bacterial surface (17) or formed an insoluble inclusion body within the bacterial cells (18), thus preventing diffusion of the effector molecules to their parasite or mosquito midgut targets.
Here, we describe a substantially improved strategy to deliver effector molecules by engineering a natural symbiotic bacterium Pantoea agglomerans (previously known as Enterobacter agglom- erans) to secrete antimalaria proteins in the mosquito midgut. We found that the development of the human parasite Plasmodium
Author contributions: S.W., A.K.G., D.J.L., and M.J.-L. designed research; S.W., A.K.G., N.B., and K.A.S. performed research; N.B., K.A.S., and D.J.L. contributed new reagents/ analytic tools; S.W., A.K.G., and M.J.-L. analyzed data; and S.W., A.K.G., and M.J.-L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
1Present address: Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana–Champaign, Urbana, IL 61801.
2To whom correspondence should be addressed. E-mail: mlorena@jhsph.edu.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1204158109/-/DCSupplemental.
12734–12739 | PNAS | July 31, 2012 | vol. 109 | no. 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
Malaria is one of the most lethal infectious diseases. Close to half of the population of the world is at risk, about 300–500 million contract the disease annually, and about 1.2 million people die of malaria every year (1). Continuous emergence of mosquito insecticide resistance and parasite drug resistance, combined with the lack of an effective malaria vaccine, severely limits our ability to counteract this intolerable burden (2, 3). New weapons to fight the disease are urgently needed.
Unlike the other two major infectious diseases (AIDS and tu- berculosis) that are transmitted directly from person to person, transmission of Plasmodium, the causative agent of malaria, strictly depends on the completion of a complex developmental cycle in vector mosquitoes (4). A mosquito may ingest on the order of 103 to 104 gametocytes from an infected human that quickly differen- tiate into male and female gametes that mate to produce zygotes, which, in turn, differentiate into ∼102 to 103 motile ookinetes. Ookinetes then migrate within the blood bolus until they reach the midgut epithelium, where they then traverse and differentiate into oocysts. Upon maturation, each oocyst releases thousands of sporozoites into the hemocoel, followed by invasion of the mos- quito salivary glands. The transmission cycle is completed when the infected mosquito bites the next vertebrate host and delivers some of the sporozoites with the saliva (5). Clearly, a severe bottleneck occurs during the mosquito midgut stages of parasite development: even in areas of high transmission, mosquitoes typically carry five or fewer oocysts (5). This bottleneck makes the mosquito midgut a prime target for intervention (6, 7).
One option to interfere with parasite transmission is to ge- netically modify mosquitoes for midgut expression of “effector genes” that inhibit parasite development. Past evidence suggests that this strategy works successfully in the laboratory (8–11). However, one unresolved challenge is how to drive transgenes
into wild mosquito populations. Various genetic drive mecha- nisms have been proposed to accomplish this goal (12, 13), but these are technically very challenging, and it is not clear in what time frame they will succeed. An important additional challenge faced by genetic drive approaches, in general, is that anopheline vectors frequently occur in the field as reproductively isolated populations, thus posing a barrier for gene flow from one pop- ulation to another.
An alternative strategy to deliver effector molecules is to en- gineer symbiotic bacteria from the mosquito midgut microbiome to produce the interfering proteins (paratransgenesis) (14). A key strategic consideration is that the mosquito microbiome (15, 16) resides in the same compartment where the most vulnerable stages of malaria parasite development occur (7). Moreover, bac- teria numbers increase dramatically (hundreds- to thousands-fold) after ingestion of a blood meal (15), and output of anti-Plasmodium effector molecules from engineered bacteria can be expected to increase proportionally.
Paratransgenesis has shown promise for the control of other insect-borne disease (14). Chagas disease caused by the parasitic protozoan Trypanosoma cruzi is transmitted by the triatomid bug, Rhodnius prolixus. In proof-of-concept experiments, an obligate commensal Gram-positive bacterium was genetically modified to secrete cecropin A, a peptide that kills T. cruzi, making the bug refractory to the parasite (14). Our previous study using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei and the Anopheles stephensi vector mosquito suggested that recombinant Escher- ichia coli expressing on their surface either a dimer of the salivary gland and midgut peptide 1 (SM1) or a modified phospholipase reduced oocyst formation (17). Yoshida et al. (18) also showed that recombinant E. coli expressing a single-chain immunotoxin significantly reduces P. berghei oocyst density in A. stephensi mosquitoes. One limitation of these earlier experiments is that they used E. coli, an attenuated laboratory bacterium that sur- vives poorly in the mosquito gut (17). A second limitation was that the recombinant effector molecules either remained attached to the bacterial surface (17) or formed an insoluble inclusion body within the bacterial cells (18), thus preventing diffusion of the effector molecules to their parasite or mosquito midgut targets.
Here, we describe a substantially improved strategy to deliver effector molecules by engineering a natural symbiotic bacterium Pantoea agglomerans (previously known as Enterobacter agglom- erans) to secrete antimalaria proteins in the mosquito midgut. We found that the development of the human parasite Plasmodium
Author contributions: S.W., A.K.G., D.J.L., and M.J.-L. designed research; S.W., A.K.G., N.B., and K.A.S. performed research; N.B., K.A.S., and D.J.L. contributed new reagents/ analytic tools; S.W., A.K.G., and M.J.-L. analyzed data; and S.W., A.K.G., and M.J.-L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
1Present address: Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana–Champaign, Urbana, IL 61801.
2To whom correspondence should be addressed. E-mail: mlorena@jhsph.edu.
This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1204158109/-/DCSupplemental.
12734–12739 | PNAS | July 31, 2012 | vol. 109 | no. 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
การแปล กรุณารอสักครู่..
การต่อสู้กับมาลาเรียชนิดแบคทีเรียจากวิศวกรรมเวกเตอร์ยุง
sibao wanga Anil , K . ghosha นิโคลัส bongiob เควิน . stebbingsb 1 , เดวิด เจ. lampeb และมาร์เซโล เจคอบ lorenaa 2
adepartment ภูมิคุ้มกันวิทยาจุลชีววิทยาโมเลกุล และ สถาบันวิจัยมาลาเรีย , Johns Hopkins Bloomberg โรงเรียนสาธารณสุข , Baltimore , MD 21205 และ bdepartment ของ วิทยาศาสตร์ชีวภาพดูเควสน์มหาวิทยาลัย Pittsburgh , PA 15282
แก้ไขโดย แนนซี่ เอ มอแรน มหาวิทยาลัยเยล ตะวันตกยัง , CT และอนุมัติ วันที่ 7 มิถุนายน 2555 ( รับทบทวนมีนาคม 9 , 2012 )
ขั้นตอนเสี่ยงมากที่สุดของการพัฒนาการเกิดขึ้นในลำไส้ของยุงที่มีประสิทธิภาพและเหมาะสม , ช่องที่อาศัยแบคทีเรีย ที่นี่เราอธิบายถึงกลยุทธ์ที่ใช้อาศัยแบคทีเรียที่จะส่งมอบรต้านมาลาเรีย ( โมเลกุลเพื่อประสิทธิภาพและเหมาะสม ลูเมน ดังนั้น ภาพยุงเจ้าภาพวัสดุทนไฟเพื่อมาลาเรีย infec - tion . และ Escherichia coli ตรงระบบการใช้เพื่อส่งเสริมการหลั่งของความหลากหลายของการต่อต้าน ( โปรตีนโดยทั่วไปยุงชนิด agglomerans pantoea , แบคทีเรีย เหล่านี้ออกแบบหน้าagglomerans สายพันธุ์ยับยั้ง de - velopment ปรสิตมาลาเรีย พลาสโมเดียม ฟัลซิปารัมของมนุษย์และหนูปรสิตมาลาเรียพลาสโมเดียม berghei ได้ถึง 98% เมื่อเปรียบเทียบสัดส่วนของยุงแบกปรสิต ( ก่อนหน้า - alence ) ลดลงถึง 84% ( สองของโมเลกุล scorpine ส่วนต้า antiplasmodial เปปไทด์ ( epip ) 4สี่เล่มของพลาสโมเดียมอีนอเลส–หาปฏิสัมพันธ์เปปไทด์ที่ช่วยหาผูกกับพื้นผิว ookinete . เราแสดงให้เห็นถึงการใช้วิศวกรรมชนิดแบคทีเรียรบกวน de velopment ของพี - เชื้อในยุง การค้นพบนี้ให้มูลนิธิเพื่อใช้ดัดแปรพันธุกรรมชนิด bacte - Ria เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพเพื่อต่อสู้กับโรคมาลาเรีย
นอฟีเล็ส แกมบิเ | การควบคุมโรคมาลาเรีย | paratransgenesis | ส่งบล็อก
มาลาเรียเป็นหนึ่งในโรคที่ติดเชื้อที่ร้ายแรงที่สุด . ใกล้เคียงกับครึ่งหนึ่งของประชากรของโลกมีความเสี่ยงประมาณ 300 - 500 ล้านสัญญาโรคต่อปี และประมาณ 1.2 ล้านคน ตายด้วยโรคมาลาเรียทุกปี ( 1 ) วิวัฒนาการอย่างต่อเนื่องของความต้านทานแมลงยุงและต้านยา พยาธิรวมกับการขาดวัคซีนมาลาเรียที่มีขอบเขตความสามารถของเราในการต่อต้านอย่างรุนแรงภาระเหลือทน ( 2 , 3 ) อาวุธใหม่ในการต่อสู้กับโรค จำเป็นเร่งด่วน
แตกต่างจากอื่น ๆสองหลักติดเชื้อ ( เอดส์และตู - berculosis ) ที่ถูกถ่ายทอดโดยตรงจากคนสู่คน ส่งของ พลาสโมเดียม ตัวแทนที่เป็นสาเหตุของโรคมาลาเรียอย่างเคร่งครัดขึ้นอยู่กับความสมบูรณ์ของรอบการพัฒนาที่ซับซ้อนในยุงเวกเตอร์ ( 4 ) ยุงจะกินลำดับที่ 103 104 gametocytes จากมนุษย์ที่ติดเชื้อได้อย่างรวดเร็วคิด - tiate เป็นชายและหญิง gametes ที่เพื่อนผลิต zygotes ซึ่ง จะแยกเป็น∼ 102 103 เคลื่อนที่ ookinetes .ookinetes แล้วโยกย้ายภายในเลือดเพิ่มจนกว่าจะถึงประสิทธิภาพและเหมาะสมเยื่อบุผิวที่พวกเขาแล้วเดินข้ามแยกไป oocysts . เมื่ออายุ แต่ละโอโอซิสรุ่นพันสปอโรซอยต์เข้าสู่ฮีโมซีล ตามด้วยการรุกรานของ MOS - กีโต ต่อมน้ำลายวงจรการส่งเสร็จสมบูรณ์เมื่อยุงติดเชื้อกัดโฮสต์ต่อไปของสัตว์มีกระดูกสันหลังและให้บางส่วนของ สปอโรซอยต์กับน้ำลาย ( 5 ) ชัดเจน , คอขวดที่รุนแรงเกิดขึ้นในระหว่างขั้นตอนของการพัฒนาประสิทธิภาพและเหมาะสมยุงปรสิต : แม้ในพื้นที่ของการส่งผ่านสูง , ยุงมักจะพก 5 หรือน้อยกว่า oocysts ( 5 )ปัญหาคอขวดประสิทธิภาพและเหมาะสม ทำให้ยุงเป็นเป้าหมายหลักสำหรับการแทรกแซง ( 6 , 7 ) .
ตัวเลือกหนึ่งที่จะแทรกแซงกับการส่งปรสิตคือ GE - netically ปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยุงเพื่อประสิทธิภาพและเหมาะสม " ( ยีนที่ยับยั้งการพัฒนา " ปรสิต หลักฐานที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์นี้ทำงานประสบความสำเร็จในปฏิบัติการ ( 8 – 11 ) อย่างไรก็ตามหนึ่งที่แก้ไม่ตก ท้าทาย วิธีการขับรถ transgenes
ในป่ายุงตามจำนวนประชากร หุ่นยนต์ - พันธุกรรมต่าง ๆ nisms ไดรฟ์ได้รับการเสนอเพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ ( 12 , 13 ) แต่เหล่านี้เป็นเทคนิคที่ท้าทายมาก และยังไม่มีความชัดเจนในกรอบเวลาที่พวกเขาจะประสบความสำเร็จ ความท้าทายเพิ่มเติมสำคัญที่เผชิญ โดยพันธุกรรมขับรถวิธีการ ทั่วไปเป็นเวกเตอร์ไข่บ่อยเกิดขึ้นในสนามได้ reproductively ประชากรจึงวางตัวเป็นอุปสรรคสำหรับการไหลของยีนจากพ่อ - ulation อื่น .
กลยุทธ์ทางเลือกให้โต้ง โมเลกุล คือ en - gineer symbiotic เชื้อโรคจากยุงประสิทธิภาพและเหมาะสมเพื่อผลิตโปรตีน ( ไมโครไบโ รบกวน paratransgenesis ) ( 14 )คีย์เชิงกลยุทธ์การพิจารณาว่ายุงไมโครไบโ ( 15 , 16 ) อยู่ในช่องเดียวกันที่ระยะเสี่ยงมากที่สุดของการพัฒนาไข้มาลาเรียเกิดขึ้น ( 7 ) นอกจากนี้ บัคเทเรีย - ตัวเลขเพิ่มขึ้นอย่างมาก ( ร้อย - พันพับ ) หลังจากกินเลือดป่น ( 15 )และผลผลิตของการต่อต้านแบคทีเรียสามารถสร้างโมเลกุล ( จากที่คาดว่าจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วน
paratransgenesis มีแสดงสัญญาสำหรับควบคุมแมลงพาหะโรคอื่นๆ ( 14 ) ชากัสโรคที่เกิดจากพยาธิโปรโตซัวทริปาโนโซมา cruzi จะถูกส่งโดยแมลง triatomid rhodnius prolixus . ในหลักฐานของแนวคิดนี้การบังคับที่อยู่แบบพึ่งพาอาศัยกัน แกรมบวกแบคทีเรียถูกดัดแปลงพันธุกรรมหลั่ง cecropin , เปปไทด์ที่ฆ่า ต. cruzi ทำให้แมลงทนกับปรสิต ( 14 )การศึกษาก่อนหน้านี้ที่เราใช้ หนู berghei ปรสิตมาลาเรียพลาสโมเดียมและยุงก้นปล่อง stephensi ยุงพาหะพบว่า recombinant เชอร์ - ichia coli แสดงบนพื้นผิวของพวกเขาไม่ว่าจะเป็น dimer ของต่อมน้ำลายและประสิทธิภาพและเหมาะสม เปปไทด์ 1 ( SM1 ) หรือดัดแปลงชิ้นลดการก่อตัวโอโอซิส ( 17 ) โยชิดะ et al . ( 18 ) ยังพบว่า recombinant E( แสดง immunotoxin โซ่เดี่ยวลดหน้า berghei โอโอซิสความหนาแน่น . stephensi ยุง เป็นข้อจำกัดของการทดลองก่อนหน้านี้ เหล่านี้คือการ ที่พวกเขาใช้ E . coli , เป็นห้องปฏิบัติการแบคทีเรีย ซูร์ - vives ไม่ดียุงกัส ( 17 )ข้อที่สอง คือ โมเลกุล ( recombinant ให้ยังคงยึดติดกับพื้นผิวของแบคทีเรีย ( 17 ) หรือเกิดขึ้นในร่างกายที่ไม่รวมภายในเซลล์แบคทีเรีย ( 18 ) จึงป้องกันการแพร่กระจายของปรสิตหรือยุง ( โมเลกุลเป้าหมายประสิทธิภาพและเหมาะสมของพวกเขา .
ที่นี่เลยเราอธิบายการปรับปรุงมากกลยุทธ์การส่งมอบ ( โมเลกุลโดยวิศวกรรมกะพรุนธรรมชาติแบคทีเรีย pantoea agglomerans ( ที่รู้จักกันก่อนหน้านี้เป็น Enterobacter agglom - erans ) หลั่งโปรตีนรต้านมาลาเรียในยุงประสิทธิภาพและเหมาะสม . เราพบว่า พัฒนาการของมนุษย์ปรสิตพลาสโมเดียม
เขียนเขียน : S.W . a.k.g. d.j.l. , , , และเอ็มเจ - L . การออกแบบการวิจัย a.k.g. S.W . , ,หมายเหตุ และ k.a.s. ดำเนินการวิจัย หมายเหตุ k.a.s. , และ d.j.l. สนับสนุนใหม่ 10 / เครื่องมือวิเคราะห์ ; S.W . a.k.g. , และเอ็มเจ - แอล วิเคราะห์ข้อมูล และ S.W . a.k.g. , และเอ็มเจ - ฉันเขียนในกระดาษ เขียนประกาศ
ไม่มีความขัดแย้งที่น่าสนใจ บทความนี้เป็นสารโพลีนิวเคลียร์โดยตรงส่ง .
ที่อยู่ 1present : โปรแกรมวิชาประสาทวิทยา , มหาวิทยาลัยออริกอนสเตต , Urbana , IL 61801 .
2to ที่จดหมายควรจะ addressed อีเมล : mlorena @ JHSPH . edu .
บทความนี้ประกอบด้วยข้อมูลสนับสนุนออนไลน์ที่ www.pnas . org / การค้นหา / Suppl / ดอย : 10 .
1018 / พีเอ็นเอ . 1204158109 / - / dcsupplemental .
12734 – 12739 | พีเอ็นเอ | กรกฎาคม 31 , 2012 | ฉบับที่ 109 | ไม่ใช่ 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
sibao wanga Anil , K . ghosha นิโคลัส bongiob เควิน . stebbingsb 1 , เดวิด เจ. lampeb และมาร์เซโล เจคอบ lorenaa 2
adepartment ภูมิคุ้มกันวิทยาจุลชีววิทยาโมเลกุล และ สถาบันวิจัยมาลาเรีย , Johns Hopkins Bloomberg โรงเรียนสาธารณสุข , Baltimore , MD 21205 และ bdepartment ของ วิทยาศาสตร์ชีวภาพดูเควสน์มหาวิทยาลัย Pittsburgh , PA 15282
แก้ไขโดย แนนซี่ เอ มอแรน มหาวิทยาลัยเยล ตะวันตกยัง , CT และอนุมัติ วันที่ 7 มิถุนายน 2555 ( รับทบทวนมีนาคม 9 , 2012 )
ขั้นตอนเสี่ยงมากที่สุดของการพัฒนาการเกิดขึ้นในลำไส้ของยุงที่มีประสิทธิภาพและเหมาะสม , ช่องที่อาศัยแบคทีเรีย ที่นี่เราอธิบายถึงกลยุทธ์ที่ใช้อาศัยแบคทีเรียที่จะส่งมอบรต้านมาลาเรีย ( โมเลกุลเพื่อประสิทธิภาพและเหมาะสม ลูเมน ดังนั้น ภาพยุงเจ้าภาพวัสดุทนไฟเพื่อมาลาเรีย infec - tion . และ Escherichia coli ตรงระบบการใช้เพื่อส่งเสริมการหลั่งของความหลากหลายของการต่อต้าน ( โปรตีนโดยทั่วไปยุงชนิด agglomerans pantoea , แบคทีเรีย เหล่านี้ออกแบบหน้าagglomerans สายพันธุ์ยับยั้ง de - velopment ปรสิตมาลาเรีย พลาสโมเดียม ฟัลซิปารัมของมนุษย์และหนูปรสิตมาลาเรียพลาสโมเดียม berghei ได้ถึง 98% เมื่อเปรียบเทียบสัดส่วนของยุงแบกปรสิต ( ก่อนหน้า - alence ) ลดลงถึง 84% ( สองของโมเลกุล scorpine ส่วนต้า antiplasmodial เปปไทด์ ( epip ) 4สี่เล่มของพลาสโมเดียมอีนอเลส–หาปฏิสัมพันธ์เปปไทด์ที่ช่วยหาผูกกับพื้นผิว ookinete . เราแสดงให้เห็นถึงการใช้วิศวกรรมชนิดแบคทีเรียรบกวน de velopment ของพี - เชื้อในยุง การค้นพบนี้ให้มูลนิธิเพื่อใช้ดัดแปรพันธุกรรมชนิด bacte - Ria เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพเพื่อต่อสู้กับโรคมาลาเรีย
นอฟีเล็ส แกมบิเ | การควบคุมโรคมาลาเรีย | paratransgenesis | ส่งบล็อก
มาลาเรียเป็นหนึ่งในโรคที่ติดเชื้อที่ร้ายแรงที่สุด . ใกล้เคียงกับครึ่งหนึ่งของประชากรของโลกมีความเสี่ยงประมาณ 300 - 500 ล้านสัญญาโรคต่อปี และประมาณ 1.2 ล้านคน ตายด้วยโรคมาลาเรียทุกปี ( 1 ) วิวัฒนาการอย่างต่อเนื่องของความต้านทานแมลงยุงและต้านยา พยาธิรวมกับการขาดวัคซีนมาลาเรียที่มีขอบเขตความสามารถของเราในการต่อต้านอย่างรุนแรงภาระเหลือทน ( 2 , 3 ) อาวุธใหม่ในการต่อสู้กับโรค จำเป็นเร่งด่วน
แตกต่างจากอื่น ๆสองหลักติดเชื้อ ( เอดส์และตู - berculosis ) ที่ถูกถ่ายทอดโดยตรงจากคนสู่คน ส่งของ พลาสโมเดียม ตัวแทนที่เป็นสาเหตุของโรคมาลาเรียอย่างเคร่งครัดขึ้นอยู่กับความสมบูรณ์ของรอบการพัฒนาที่ซับซ้อนในยุงเวกเตอร์ ( 4 ) ยุงจะกินลำดับที่ 103 104 gametocytes จากมนุษย์ที่ติดเชื้อได้อย่างรวดเร็วคิด - tiate เป็นชายและหญิง gametes ที่เพื่อนผลิต zygotes ซึ่ง จะแยกเป็น∼ 102 103 เคลื่อนที่ ookinetes .ookinetes แล้วโยกย้ายภายในเลือดเพิ่มจนกว่าจะถึงประสิทธิภาพและเหมาะสมเยื่อบุผิวที่พวกเขาแล้วเดินข้ามแยกไป oocysts . เมื่ออายุ แต่ละโอโอซิสรุ่นพันสปอโรซอยต์เข้าสู่ฮีโมซีล ตามด้วยการรุกรานของ MOS - กีโต ต่อมน้ำลายวงจรการส่งเสร็จสมบูรณ์เมื่อยุงติดเชื้อกัดโฮสต์ต่อไปของสัตว์มีกระดูกสันหลังและให้บางส่วนของ สปอโรซอยต์กับน้ำลาย ( 5 ) ชัดเจน , คอขวดที่รุนแรงเกิดขึ้นในระหว่างขั้นตอนของการพัฒนาประสิทธิภาพและเหมาะสมยุงปรสิต : แม้ในพื้นที่ของการส่งผ่านสูง , ยุงมักจะพก 5 หรือน้อยกว่า oocysts ( 5 )ปัญหาคอขวดประสิทธิภาพและเหมาะสม ทำให้ยุงเป็นเป้าหมายหลักสำหรับการแทรกแซง ( 6 , 7 ) .
ตัวเลือกหนึ่งที่จะแทรกแซงกับการส่งปรสิตคือ GE - netically ปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยุงเพื่อประสิทธิภาพและเหมาะสม " ( ยีนที่ยับยั้งการพัฒนา " ปรสิต หลักฐานที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์นี้ทำงานประสบความสำเร็จในปฏิบัติการ ( 8 – 11 ) อย่างไรก็ตามหนึ่งที่แก้ไม่ตก ท้าทาย วิธีการขับรถ transgenes
ในป่ายุงตามจำนวนประชากร หุ่นยนต์ - พันธุกรรมต่าง ๆ nisms ไดรฟ์ได้รับการเสนอเพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ ( 12 , 13 ) แต่เหล่านี้เป็นเทคนิคที่ท้าทายมาก และยังไม่มีความชัดเจนในกรอบเวลาที่พวกเขาจะประสบความสำเร็จ ความท้าทายเพิ่มเติมสำคัญที่เผชิญ โดยพันธุกรรมขับรถวิธีการ ทั่วไปเป็นเวกเตอร์ไข่บ่อยเกิดขึ้นในสนามได้ reproductively ประชากรจึงวางตัวเป็นอุปสรรคสำหรับการไหลของยีนจากพ่อ - ulation อื่น .
กลยุทธ์ทางเลือกให้โต้ง โมเลกุล คือ en - gineer symbiotic เชื้อโรคจากยุงประสิทธิภาพและเหมาะสมเพื่อผลิตโปรตีน ( ไมโครไบโ รบกวน paratransgenesis ) ( 14 )คีย์เชิงกลยุทธ์การพิจารณาว่ายุงไมโครไบโ ( 15 , 16 ) อยู่ในช่องเดียวกันที่ระยะเสี่ยงมากที่สุดของการพัฒนาไข้มาลาเรียเกิดขึ้น ( 7 ) นอกจากนี้ บัคเทเรีย - ตัวเลขเพิ่มขึ้นอย่างมาก ( ร้อย - พันพับ ) หลังจากกินเลือดป่น ( 15 )และผลผลิตของการต่อต้านแบคทีเรียสามารถสร้างโมเลกุล ( จากที่คาดว่าจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วน
paratransgenesis มีแสดงสัญญาสำหรับควบคุมแมลงพาหะโรคอื่นๆ ( 14 ) ชากัสโรคที่เกิดจากพยาธิโปรโตซัวทริปาโนโซมา cruzi จะถูกส่งโดยแมลง triatomid rhodnius prolixus . ในหลักฐานของแนวคิดนี้การบังคับที่อยู่แบบพึ่งพาอาศัยกัน แกรมบวกแบคทีเรียถูกดัดแปลงพันธุกรรมหลั่ง cecropin , เปปไทด์ที่ฆ่า ต. cruzi ทำให้แมลงทนกับปรสิต ( 14 )การศึกษาก่อนหน้านี้ที่เราใช้ หนู berghei ปรสิตมาลาเรียพลาสโมเดียมและยุงก้นปล่อง stephensi ยุงพาหะพบว่า recombinant เชอร์ - ichia coli แสดงบนพื้นผิวของพวกเขาไม่ว่าจะเป็น dimer ของต่อมน้ำลายและประสิทธิภาพและเหมาะสม เปปไทด์ 1 ( SM1 ) หรือดัดแปลงชิ้นลดการก่อตัวโอโอซิส ( 17 ) โยชิดะ et al . ( 18 ) ยังพบว่า recombinant E( แสดง immunotoxin โซ่เดี่ยวลดหน้า berghei โอโอซิสความหนาแน่น . stephensi ยุง เป็นข้อจำกัดของการทดลองก่อนหน้านี้ เหล่านี้คือการ ที่พวกเขาใช้ E . coli , เป็นห้องปฏิบัติการแบคทีเรีย ซูร์ - vives ไม่ดียุงกัส ( 17 )ข้อที่สอง คือ โมเลกุล ( recombinant ให้ยังคงยึดติดกับพื้นผิวของแบคทีเรีย ( 17 ) หรือเกิดขึ้นในร่างกายที่ไม่รวมภายในเซลล์แบคทีเรีย ( 18 ) จึงป้องกันการแพร่กระจายของปรสิตหรือยุง ( โมเลกุลเป้าหมายประสิทธิภาพและเหมาะสมของพวกเขา .
ที่นี่เลยเราอธิบายการปรับปรุงมากกลยุทธ์การส่งมอบ ( โมเลกุลโดยวิศวกรรมกะพรุนธรรมชาติแบคทีเรีย pantoea agglomerans ( ที่รู้จักกันก่อนหน้านี้เป็น Enterobacter agglom - erans ) หลั่งโปรตีนรต้านมาลาเรียในยุงประสิทธิภาพและเหมาะสม . เราพบว่า พัฒนาการของมนุษย์ปรสิตพลาสโมเดียม
เขียนเขียน : S.W . a.k.g. d.j.l. , , , และเอ็มเจ - L . การออกแบบการวิจัย a.k.g. S.W . , ,หมายเหตุ และ k.a.s. ดำเนินการวิจัย หมายเหตุ k.a.s. , และ d.j.l. สนับสนุนใหม่ 10 / เครื่องมือวิเคราะห์ ; S.W . a.k.g. , และเอ็มเจ - แอล วิเคราะห์ข้อมูล และ S.W . a.k.g. , และเอ็มเจ - ฉันเขียนในกระดาษ เขียนประกาศ
ไม่มีความขัดแย้งที่น่าสนใจ บทความนี้เป็นสารโพลีนิวเคลียร์โดยตรงส่ง .
ที่อยู่ 1present : โปรแกรมวิชาประสาทวิทยา , มหาวิทยาลัยออริกอนสเตต , Urbana , IL 61801 .
2to ที่จดหมายควรจะ addressed อีเมล : mlorena @ JHSPH . edu .
บทความนี้ประกอบด้วยข้อมูลสนับสนุนออนไลน์ที่ www.pnas . org / การค้นหา / Suppl / ดอย : 10 .
1018 / พีเอ็นเอ . 1204158109 / - / dcsupplemental .
12734 – 12739 | พีเอ็นเอ | กรกฎาคม 31 , 2012 | ฉบับที่ 109 | ไม่ใช่ 31
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1204158109
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- If you miss me you will meet me
- วันนี้ฉันไม่สบาย รู้สึกเหนื่อยมาก ฉันนอน
- Obstacles
- คุณเสร็จธุระหรือยัง
- Your English is fine na ...me not Farang
- Radioisotope studies of the farmville me
- ฉันคิดถึงบ้าน
- Im busy right now. Just chat me to my li
- ทอด
- No,just the one who I love~~I do believe
- Firstly, many students travel to and fro
- Hot winter hat for man or woman warm hea
- I have worn the water.
- horny
- He has comeback
- Depending
- Can i go to the disco?
- I have newer Been in a mountain or Done
- FREE SHIPPNG new style headscarf cycling
- infinite money
- Party
- I have worn the water.
- One of the limitations affecting this st
- กระเทียม
