3.1.2. LC–MS/MS analysisThe ionogen

3.1.2. LC–MS/MS analysis

The ionogenic nature of ergot alkaloid makes the polarity of both the stationary phase and the mobile phase an important factor to be considered during the development of the chromatographic method. Acidic (Mohamed et al., 2006 and Smith et al., 2009) as well as basic (Krska et al., 2008 and Müller et al., 2009) mobile phases have been used for reverse-phase LC of ergot alkaloids. Although better separation of these analytes is achieved on basic mobile phases, acidic mobile phases are often preferred because conventional silica-based stationary phases are degraded at high pH. XTerra C18 and XBridge C18 stationary phases have been reported to be stable in the pH range 1–12 (Jenkins, Diehl, Morrison, & Mazzeo, 2005) and were previously used for the analysis of other basic compounds (Diana Di Mavungu, 2005). In this study, the suitability of basic mobile phases in combination with the XTerra or the XBridge stationary phase was investigated. A mobile phase consisting of water, 0.1 M ammonium carbonate pH 8.5 and methanol, was used as it gave enhanced MS signal. The XBridge column gave an overall better chromatographic separation and proved to be stable over a long period of use. Therefore, this column was selected for further investigation. A gradient elution was needed to elute all analytes within reasonable time. A good separation of the analytes was achieved; however, a shift of retention was observed during analysis. This was overcome by replacing the ammonium carbonate salt with ammonium bicarbonate and by further adjusting the buffer pH at 10. The pKa values of the ergot alkaloids vary from 4.8 to 6.2 ( Krska & Crews, 2008). Therefore, under the pH conditions of the mobile phase applied, nearly 100% of the molecules are neutral, leading to a more efficient interaction of the analyte with the stationary phase. As a consequence, well-resolved peaks and good peak shape were achieved for almost all components within 15 min, the total run time being 23 min ( Fig. 2). Ergokryptine and ergocristine are not baseline separated, but this is of minor importance as they have different SRM transitions. Moreover the overall good separation allowed the SRM detection of the ergot alkaloids in five different time window functions, thereby leading to an enhanced sensitivity. An investigation into the analyte stability under the selected analytical conditions revealed that epimerization occurred when samples dissolved in the mobile phase were allowed to stand in the autosampler for several hours before the LC–MS/MS analysis. Ergosine showed the highest tendency to epimerize while ergometrine proved to be the most stable compound among the ergot alkaloids investigated. It has been reported that the epimerization of ergot alkaloids is minimal when standard solutions are prepared in aprotic solvents such as chloroform or acetonitrile ( Hafner, Sulyok, Schuhmacher, Crews, & Krska, 2008). However, the use of a sample solvent that is stronger than the mobile phase leads to peak distortion. A careful investigation of different solvent mixtures indicated that a sample solvent consisting of methanol/acetonitrile/water (20/40/40, v/v/v) delivers a good peak shape while keeping the epimerization negligible. Finally, it was shown that by using this sample solvent, maintaining the autosampler temperature at 4 °C and limiting the sample sequence to a maximum of 24 h, no epimerization occurred during the LC–MS/MS analysis (data not shown).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.1.2 การวิเคราะห์ LC-MS / MS ธรรมชาติ ionogenic ของอัลคาลอย ergot ทำให้ขั้วของทั้งสองเฟสและเฟสเคลื่อนที่เป็นปัจจัยสำคัญที่จะพิจารณาในระหว่างการพัฒนาวิธีโครมา ที่เป็นกรด (โมฮาเหม็ et al., 2006 สมิ ธ และ et al., 2009) เช่นเดียวกับโรงแรมระดับล่าง (Krska et al., 2008 และMüller et al., 2009) ขั้นตอนโทรศัพท์มือถือมีการใช้ LC เฟสย้อนกลับของลคาลอยด์ ergot แม้ว่าการแยกที่ดีขึ้นของสารเหล่านี้จะประสบความสำเร็จในขั้นตอนถือขั้นพื้นฐานขั้นตอนถือเป็นกรดเป็นที่ต้องการมักจะเพราะซิลิกาตามขั้นตอนเดิมนิ่งจะสลายตัวที่ pH สูง Xterra C18 และ C18 XBridge ขั้นตอนนิ่งได้รับรายงานจะมีเสถียรภาพในช่วงค่า pH 1-12 (เจนกิ้นส์ Diehl, มอร์ริสันและ Mazzeo 2005) และถูกนำมาใช้ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์สารประกอบอื่น ๆ (ไดอาน่าดิ Mavungu 2005) . ในการศึกษานี้เหมาะสมของขั้นตอนถือขั้นพื้นฐานในการรวมกันกับ Xterra หรือเฟส XBridge ถูกตรวจสอบ เฟสมือถือประกอบด้วยน้ำ 0.1 M แอมโมเนียมคาร์บอเนต pH 8.5 และเมทานอลถูกนำมาใช้ในขณะที่มันให้เพิ่มสัญญาณ MS คอลัมน์ XBridge ให้การแยกสารโดยรวมดีขึ้นและพิสูจน์แล้วว่าจะมีเสถียรภาพในระยะเวลานานในการใช้ ดังนั้นคอลัมน์นี้ได้รับเลือกให้ตรวจสอบต่อไป ชะลาดเป็นสิ่งที่จำเป็นที่จะชะวิเคราะห์ทั้งหมดภายในเวลาที่เหมาะสม แยกที่ดีของการวิเคราะห์ก็ประสบความสำเร็จ; แต่การเปลี่ยนแปลงของการเก็บรักษาพบว่าระหว่างการวิเคราะห์ นี้ได้รับการเอาชนะโดยการเปลี่ยนเกลือแอมโมเนียมคาร์บอเนตที่มีแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตและต่อไปการปรับค่า pH บัฟเฟอร์ที่ 10 ค่า pKa ของลคาลอยด์ ergot แตกต่างกันไป 4.8-6.2 (Krska และทีมงาน 2008) ดังนั้นภายใต้เงื่อนไขที่พีเอชของเฟสเคลื่อนที่ที่ใช้เกือบ 100% ของโมเลกุลที่มีความเป็นกลางที่นำไปสู่การทำงานร่วมกันมีประสิทธิภาพมากขึ้นด้วยการวิเคราะห์เฟส เป็นผลให้ยอดการแก้ไขที่ดีและรูปร่างที่ดียอดเขาก็ประสบความสำเร็จสำหรับส่วนประกอบเกือบทั้งหมดภายใน 15 นาทีที่เวลาทำงานรวมเป็น 23 นาที (รูปที่. 2) Ergokryptine และ ergocristine ไม่ได้พื้นฐานแยกออกจากกัน แต่มีความสำคัญรองลงมาที่พวกเขามีการเปลี่ยน SRM ที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ยังมีการแยกที่ดีโดยรวมได้รับอนุญาตการตรวจสอบของ SRM ลคาลอยด์ ergot ในห้าฟังก์ชั่นหน้าต่างเวลาที่แตกต่างกันจึงนำไปสู่ความไวที่เพิ่มขึ้น การสืบสวนวิเคราะห์เสถียรภาพภายใต้เงื่อนไขที่เลือกการวิเคราะห์พบว่า epimerization เกิดขึ้นเมื่อกลุ่มตัวอย่างที่ละลายในเฟสเคลื่อนที่ได้รับอนุญาตให้ยืนอยู่ในเครื่องฉีดตัวอย่างอัตโนมัติเป็นเวลาหลายชั่วโมงก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ LC-MS / MS Ergosine แสดงให้เห็นแนวโน้มที่จะสูงที่สุดในขณะที่ epimerize ergometrine พิสูจน์แล้วว่าเป็นสารที่มีเสถียรภาพมากที่สุดในหมู่คาลอยด์ ergot การตรวจสอบ มันได้รับรายงานว่า epimerization ของลคาลอยด์ ergot มีน้อยเมื่อการแก้ปัญหาที่มีการจัดทำมาตรฐานในตัวทำละลาย aprotic เช่นคลอโรฟอร์มหรือ acetonitrile (Hafner, Sulyok, Schuhmacher, ทีมงานและ Krska 2008) อย่างไรก็ตามการใช้ตัวทำละลายตัวอย่างที่จะแข็งแกร่งกว่าเฟสเคลื่อนที่จะนำไปสู่จุดสูงสุดบิดเบือน การตรวจสอบอย่างระมัดระวังของตัวทำละลายผสมที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่าตัวทำละลายตัวอย่างประกอบด้วยเมทานอล / acetonitrile / น้ำ (20/40/40, v / v / v) ให้มีรูปร่างที่ดีสูงสุดในขณะที่เก็บ epimerization เล็กน้อย ในที่สุดมันก็แสดงให้เห็นว่าตัวทำละลายโดยใช้ตัวอย่างนี้รักษาอุณหภูมิฉีดตัวอย่างอัตโนมัติที่ 4 ° C และการ จำกัด ลำดับตัวอย่างสูงสุด 24 ชั่วโมงที่ epimerization ไม่เกิดขึ้นในช่วง LC-MS / MS วิเคราะห์ (ไม่ได้แสดงข้อมูล)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.1.2 . LC MS / MS และการวิเคราะห์

ธรรมชาติด้าน ionogenic ของอัลคาลอยด์ ทำให้ขั้วของทั้งเครื่องเขียน เฟส และเฟสเคลื่อนที่เป็นปัจจัยสําคัญที่จะต้องพิจารณาในการพัฒนาวิธีการทางโครมาโทกราฟี กรด ( Mohamed et al . , 2006 และ Smith et al . , 2009 ) รวมทั้งพื้นฐาน ( krska et al . , 2008 และ M ü ller et al . ,2009 ) ระยะที่เคลื่อนที่ได้ใช้กลับเฟสด้าน LC ของอัลคาลอยด์ . แม้ว่าการแยกดีกว่าสารเหล่านี้ได้บนพื้นฐานระยะระยะเคลื่อนที่ , มือถือที่เป็นกรดมักต้องการเนื่องจากซิลิกาจากเฟสคงที่อยู่ที่ pH สูงและเสื่อมโทรม xterra c18 xbridge c18 นิ่งระยะได้รับรายงานจะมีเสถียรภาพในระดับ pH 1 – 12 ( Diehl เจนกินส์ ,มอร์ริสัน , & mazzeo , 2005 ) และถูกใช้ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์สารประกอบพื้นฐานอื่น ๆ ( ไดอาน่า ดิ mavungu , 2005 ) ในการศึกษาความเหมาะสมของเฟสเคลื่อนที่พื้นฐานในการรวมกันกับ xterra หรือ xbridge นิ่งระยะที่ถูกตรวจสอบ เป็นเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยน้ำ 0.1 M แอมโมเนียมคาร์บอเนต pH 8.5 และเมทานอล ถูกใช้เป็น MS ให้เพิ่มสัญญาณการ xbridge คอลัมน์ให้แยกโครมโดยรวมดีขึ้นและพิสูจน์ให้มีเสถียรภาพในระยะยาวของการใช้ ดังนั้นคอลัมน์นี้ถูกเลือกเพื่อทำการสืบสวนต่อไป การไล่ระดับสี ( คือต้อง elute สารภายในเวลาที่เหมาะสม การแยกของสารทำ อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงของการเก็บรักษาพบว่าในการวิเคราะห์นี้ถูกเอาชนะโดยการเปลี่ยนแอมโมเนียคาร์บอเนตเกลือแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต และต่อไปการปรับบัฟเฟอร์ pH 10 ในด้านคุณค่า pKa ของอัลคาลอยด์ แตกต่างจาก 4.8 6.2 ( krska &ลูกเรือ , 2008 ) ดังนั้น ภายใต้เงื่อนไขของเฟสเคลื่อนที่อ ใช้ เกือบ 100% ของโมเลกุลที่เป็นกลางนำไปสู่การปฏิสัมพันธ์ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นของครูกับเฟสอยู่กับที่ เป็นผลดีรูปร่างดีและแก้ไขยอดสูงสุดเป็นส่วนประกอบเกือบทั้งหมดได้ภายใน 15 นาที รวมวิ่งเวลา 23 นาที ( รูปที่ 2 ) และ ergokryptine โกคริสทีนไม่เส้นคั่น แต่นี่คือของเล็กน้อยที่สำคัญพวกเขามีการเปลี่ยนโครงสร้างที่แตกต่างกันนอกจากนี้การแยกที่ดีโดยรวมที่ได้รับอนุญาตสำหรับการตรวจสอบของอัลคาลอยด์ในห้าที่แตกต่างกันในด้านเวลาหน้าต่างการทำงานจึงนำไปสู่การเพิ่มความไวสอบสวนครูความมั่นคงภายใต้เงื่อนไขที่วิเคราะห์พบว่าตัวอย่าง epimerization เกิดขึ้นเมื่อละลายในเฟสเคลื่อนที่ได้รับอนุญาตให้ยืนใน autosampler เป็นเวลาหลายชั่วโมงก่อน LC MS / MS และการวิเคราะห์ergosine พบแนวโน้มสูงสุด epimerize ในขณะที่โกเมทรีนพิสูจน์เป็นสารประกอบอัลคาลอยด์ที่มีเสถียรภาพมากที่สุดในด้านนี้ มันได้รับรายงานว่าในด้าน epimerization ของอัลคาลอยด์น้อยที่สุดเมื่อโซลูชั่นมาตรฐานที่เตรียมไว้ในตัวทำละลาย aprotic เช่นคลอโรฟอร์มหรือไน ( ฮาฟเนอร์ sulyok schuhmacher ลูกเรือ , , , , & krska , 2008 ) อย่างไรก็ตามการใช้ตัวอย่างของตัวทำละลายที่แข็งแกร่งกว่าเฟสเคลื่อนที่ไปสู่จุดสูงสุดที่บิดเบือน การตรวจสอบระวังผสมตัวทำละลายที่แตกต่างกัน พบว่า กลุ่มตัวอย่างประกอบด้วยตัวทำละลายเมทานอล / ไน / น้ำ ( 20 / 40 / 40 v / v / v ) มอบรูปร่างยอดที่ดีในขณะที่การรักษา epimerization กระจอก ในที่สุดก็พบว่าตัวอย่างนี้โดยใช้ตัวทำละลายการรักษา autosampler อุณหภูมิ 4 องศา C และ จำกัด การใช้ลำดับสูงสุด 24 ชั่วโมง ไม่ epimerization เกิดขึ้นในระหว่าง LC MS / MS และการวิเคราะห์ ( ข้อมูลไม่แสดง )