HFF cells were seeded in six-well p

HFF cells were seeded in six-well plates and grown to con¯uency in DMEM containing 10% (v/v) FBS, 10mgmlÿ1 gentamicin, 10mM HEPES and 1mM glutamine. Microneme proteins were diluted to a concentration of 20mgmlÿ1 in PBS containing 1mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2 (CM-PBS). Approximately 5% of the protein content of the micronemes is MIC2; thus, this concentration is roughly equivalent to 1mgmlÿ1 MIC2 (data not shown). To block non-speci®c binding, monolayers were treated for 30min at 128C with 1% (w/v) BSA in CM-PBS. Excess BSA was removed by rinsing in CM-PBS, and microneme proteins were added in a volume of 1ml of CM-PBS and incubated at 128C for 1h. The unbound fraction (referred to as supernatant or SUP) was removed, and the monolayers were rinsed four times in cold CM-PBS. The cell-bound fraction (CBF) was collected by lysing the monolayer in 1ml of RIPA (50mM Tris, pH 7.5, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.2% SDS, 100mM NaCl 5mM EDTA). Fractions were acetone precipitated and resuspended in 100ml of SDS±PAGE sample buffer containing 2% (v/v) 2-mercaptoethanol. Samples were boiled for 5min and electrophoresed on 10% (w/v) polyacrylamide gels, transferred and Western blotted according to standard procedures (Laemmli, 1970; Towbin et al., 1979). Dilution standards of the microneme protein preparations were loaded in parallel to simulate the contents of 1%, 5% and 10% of the total ESA input material.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์ HFF ถูก seeded ในดี 6 แผ่น และโต con¯uency ใน DMEM ที่ประกอบด้วย 10% (v/v) FBS, 10mgmlÿ1 gentamicin, 10 มม. HEPES และ glutamine มม. 1 Microneme โปรตีนถูกทำให้เจือจางให้ความเข้มข้นของ 20mgmlÿ1 ใน PBS มี 1 มม. CaCl2 และ 0.5mM MgCl2 (CM-PBS) ประมาณ 5% ของโปรตีนของ micronemes เป็น MIC2 ดังนั้น สมาธินี้เป็นประมาณเท่ากับ 1mgmlÿ1 MIC2 (ข้อมูลไม่แสดง) บล็อกไม่ใช่ speci ® c ผูก monolayers ได้รับการรักษาใน 30 นาทีที่ C 128 1% (w/v) บีเอสเอใน CM PBS บีเอสเอส่วนเกินถูกเอาออก โดยการล้างใน CM PBS และเพิ่มปริมาณของ 1ml ของ PBS ซม.โปรตีน microneme และ incubated ที่ C 128 สำหรับ 1h เศษส่วนไม่ถูกผูกไว้ (เรียกว่า supernatant หรือผู้จำหน่าย) ถูกเอาออก ก monolayers การถูก rinsed ครั้งที่สี่ในเย็น CM-PBS เศษเซลล์ผูก (CBF) ถูกรวบรวม โดย lysing monolayer ใน 1ml ของริป้าราคา (50 มม.ตรี pH 7.5, 1% ไตรตั้น X 100, deoxycholate โซเดียม 0.5%, 0.2% SDS, 100 มม. NaCl 5mM EDTA) เศษมีอะซีโตนตกตะกอน และ resuspended ใน 100ml ของบัฟเฟอร์อย่าง SDS±PAGE ประกอบด้วย 2% (v/v) 2-mercaptoethanol ตัวอย่างต้มใน 5 นาที และ electrophoresed ใน 10% (w/v) polyacrylamide gels โอนย้าย และเวสเทิร์ blotted ตามขั้นตอนมาตรฐาน (Laemmli, 1970 Towbin et al., 1979) มาตรฐานการเจือจางของเตรียมโปรตีน microneme ถูกโหลดพร้อมกันเพื่อจำลองเนื้อหา 1%, 5% และ 10% ของวัสดุที่นำเข้าประเทศรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เซลล์ HFF เมล็ดในแผ่นหกดีและเติบโตขึ้นในcon¯uency DMEM ที่มี 10% (v / v) FBS, 10mgmlÿ1 gentamicin, 10 mM HEPES และ glutamine 1 mM โปรตีน Microneme ถูกเจือจางความเข้มข้นของ20mgmlÿ1ในพีบีเอสที่มี 1 mM CaCl2 และ 0.5 มม MgCl2 (ที่ CM-พีบีเอส) ประมาณ 5% ของปริมาณโปรตีนของ micronemes เป็น MIC2; ดังนั้นความเข้มข้นนี้ประมาณเทียบเท่ากับ1mgmlÿ1 MIC2 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เพื่อป้องกันการที่ไม่speci®cผูกพัน monolayers ได้รับการรักษา 30 นาทีที่ 128C 1% (w / v) บีเอสเอใน CM-พีบีเอส ส่วนเกิน BSA ถูกลบออกโดยการล้างใน CM-พีบีเอสและโปรตีน microneme เสริมในปริมาณของ 1ml ของ CM-พีบีเอสและบ่มที่ 128C สำหรับ 1h ส่วนที่ไม่ได้ผูกไว้ (เรียกว่าใสหรือ SUP) จะถูกลบออกและ monolayers ถูกล้างสี่ครั้งในเย็น CM-พีบีเอส ส่วนเซลล์ที่ถูกผูกไว้ (CBF) ถูกเก็บรวบรวมโดย lysing monolayer ใน 1ml ของ RIPA นี้ (50 มมทริสพีเอช 7.5, 1% Triton X-100, Deoxycholate โซเดียม 0.5%, 0.2% SDS, โซเดียมคลอไรด์ 100 มม 5mm EDTA) เศษส่วนถูกอะซีโตนตกตะกอนและ resuspended ใน 100ml ของ SDS ±หน้ากันชนตัวอย่างที่มี 2% (v / v) 2-mercaptoethanol ตัวอย่างต้ม 5 นาทีและ electrophoresed เมื่อวันที่ 10% (w / v) เจลอะคริเลตโอนและตะวันตกเปื้อนตามขั้นตอนมาตรฐาน (Laemmli 1970. Towbin, et al, 1979) มาตรฐานการลดสัดส่วนของการเตรียมโปรตีน microneme ถูกโหลดในแบบคู่ขนานเพื่อจำลองเนื้อหา 1%, 5% และ 10% ของวัตถุดิบนำเข้ารวมอีเอสเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

hff เซลล์ถูก seeded ในหกดีจานโต คอน¯ uency ใน dmem ผสม 10% ( v / v ) FBS 10mgml ÿ 1 ยาฮีเปส 10mm และ glutamine , 1mm . โปรตีน microneme เพื่อลดความเข้มข้นของ 20mgml ÿ 1 ใน PBS ที่มี 1 mm ผลิตไอโซโทป ( 0.5 cm-pbs ) ประมาณ 5% ของปริมาณโปรตีนของ micronemes เป็น mic2 ; ดังนั้นสมาธินี้เป็นประมาณเทียบเท่ากับ 1mgml ÿ 1 mic2 ( ข้อมูลไม่แสดง ) เพื่อป้องกันไม่กา® C ผูก monolayers ได้รับการรักษาสำหรับ 30 นาทีที่ 128c ด้วย 1% ( w / v ) ( ใน cm-pbs . BSA ส่วนเกินออกด้วย ล้างใน cm-pbs และโปรตีน microneme เพิ่มในปริมาณ 1ml ของ cm-pbs บ่มที่ 128c สำหรับ 1 . หลุดส่วน ( เรียกว่าสูงหรือ sup ) ถูกเอาออกและ monolayers ถูกล้างสี่ครั้งใน cm-pbs เย็น เซลล์จำกัดเศษส่วน ( มูลนิธิสายธารพระพร ) เพื่อต่ออย่างใน 1ml RIPA ( 50mm ของบริษัท พีเอช 7.5 , 1% Triton X-100 , 0.5 % โซเดียมดี กซีโชเลต , 0.2 % SDS , 100 มม. ขนาด 5mm EDTA ) เศษส่วนคือ อะซิโตนตกตะกอน และ resuspended ใน 100ml ของ SDS ±หน้าตัวอย่างบัฟเฟอร์ที่มี 2% ( v / v ) อย่างเดียว .ต้มประมาณ 5 นาที และ electrophoresed จำนวน 10 % ( w / v ) โพลีอะคริลาไมด์เจล , การโอนย้ายและตะวันตกที่เปื้อนตามขั้นตอนมาตรฐาน ( laemmli 1970 ; towbin et al . , 1979 ) มาตรฐานการเจือจางของ microneme โปรตีนการเตรียมถูกโหลดในขนานกับจำลองเนื้อหา 1% , 5% และ 10% ของทั้งหมดใส่
ESA วัสดุ