Methods and ProceduresAnimal and hu

Methods and Procedures
Animal and human experiments
Male C57BL/6 mice were used in this study. All experimental procedures were approved by the University of Ulsan Animal Care and Use Committee and conformed to National Institutes of Health guidelines. The mice were fed a 60% HFD (Research Diets, New Brunswick, NJ) and were split into two groups: a control group (n = 7), and an experimental group (n = 7) treated once a day with 0.075% capsaicin cream. The capsaicin cream was prepared by mixing capsaicin into a hydrophilic cream base (Sigma, St. Louis, MO), and 100 mg was applied to shaved abdominal skin on each occasion. For capsaicin posttreatment, obese mice were fed a 60% HFD for 7 weeks and then received either a control cream (n = 8) or the 0.075% capsaicin cream (n = 7) for a further 7 weeks while still on the HFD. Then mice were weighed and killed by cervical dislocation. The mesenteric fat epididymal fat of each mouse were pooled and weighed, and blood was collected from the heart.

Histological analysis
Visceral fat tissue was fixed in 10% neutral buffered formalin for 24 h, cut into small pieces, and embedded in paraffin for histological analysis. The samples were cut by microtome, mounted on D-polylysine-coated glass slides, deparaffinized in xylene, and stained with hematoxylin and eosin to evaluate adipocyte size. The area occupied by adipocytes was calculated using float morphology in the Image J program (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

RNA isolation and analysis
Visceral fat tissues were homogenized with TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). RT-PCR was used to measure levels of gene expression, which were normalized to the amount of GAPDH mRNA. cDNAs were synthesized with Go Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI) in a MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad). Polymerase chain reaction products were analyzed by electrophoresis in agarose gels and staining with ethidium bromide to verify that single amplicons of the expected sizes had been obtained.

Western blot analysis
Visceral fat tissues were homogenized in HNTG lysis buffer (50-mmol/l 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonic acid, 150-mmol/l NaCl, 1% triton X-100, and 10% glycerol) supplemented with protease inhibitor cocktail (Sigma). Lysates were clarified by centrifugation at 12000g for 20 min at 4 °C. Protein concentrations were determined by the Bradford assay (Pierce, Rockford, IL), and equal amounts of proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes were blocked in Tris-buffered saline with Tween 20 containing 5% nonfat dry milk for 2 h at room temperature. Bound primary antibodies were detected with peroxidase-coupled secondary antibody and an enhanced chemiluminescence detection system (Pierce). Band intensities were determined by densitometric analysis with the Gel Doc gel documentation system (Bio-Rad, Hercules, CA) and the Image J program (NIH), and were normalized to β-actin. All assays were performed in duplicate.

Plasma analysis
Blood was collected in haparinized tubes, and plasma was prepared immediately by centrifugation (890g, 4 °C, 15 min). Plasma concentrations of glucose, triglyceride, and total cholesterol were measured with a commercial enzymatic colorimetric kit (Asan Pharm, Seoul, Korea).

Statistical analysis
Data are presented as means ± s.e.m. Two-tailed t-tests were used to analyze differences in body weight gain and food intake, and plasma data were analyzed by two-way ANOVA. Statistics were calculated using GraphPad Prism version 5.0 software (GraphPad Software, La Jolla, CA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการและขั้นตอน
สัตว์และการทดลองของมนุษย์
ชาย C57BL / 6 หนูถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัยอุลดูแลสัตว์และใช้คณะกรรมการและสอดคล้องกับสถาบันแห่งชาติของแนวทางสุขภาพ หนูได้รับการเลี้ยงดู hfd 60% (อาหารวิจัยวบรัน, nj) และได้รับการแยกออกเป็นสองกลุ่มคือกลุ่มควบคุม (n = 7)และกลุ่มทดลอง (n = 7) ได้รับการรักษาวันละครั้งด้วยครีม capsaicin 0.075% ครีม capsaicin ถูกจัดทำขึ้นโดยการผสม capsaicin เป็นฐานครีมน้ำ (ซิกเซนต์. Louis, MO) และ 100 มิลลิกรัมถูกนำมาใช้กับผิวหน้าท้องโกนในแต่ละครั้ง เพื่อ capsaicin posttreatment หนูอ้วนได้รับการเลี้ยงดู hfd 60% เป็นเวลา 7 สัปดาห์ที่แล้วได้รับการอย่างใดอย่างหนึ่งครีมควบคุม (n = 8) หรือ 0ครีม capsaicin 075% (n = 7) อีก 7 สัปดาห์ในขณะที่ยังคงอยู่ใน hfd แล้วหนูถูกชั่งน้ำหนักและถูกฆ่าโดยการเคลื่อนที่ปากมดลูก ไขมันไขมัน epididymal mesenteric เมาส์แต่ละถูกรวบรวมและชั่งน้ำหนักและเลือดถูกเก็บรวบรวมจากหัวใจ.


วิเคราะห์เนื้อเยื่อเนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายในได้รับการแก้ไขใน 10% ฟอร์มาล​​ินบัฟเฟอร์เป็นกลางเวลา 24 ชั่วโมงตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆและฝังตัวอยู่ในพาราฟินสำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ ตัวอย่างที่ถูกตัดโดย microtome ติดตั้งบนภาพนิ่ง D-polylysine เคลือบแก้ว deparaffinized ในไซลีนและย้อมด้วยสี hematoxylin และ eosin เพื่อประเมินขนาด adipocyte พื้นที่ครอบครองโดย adipocytes ได้รับการคำนวณโดยใช้ลักษณะทางสัณฐานวิทยาลอยในโปรแกรมเจภาพ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

แยก RNA และการวิเคราะห์
เนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายในปั่นด้วย trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) RT-PCR ถูกนำมาใช้ในการวัดระดับการแสดงออกของยีนซึ่งปกติจำนวน gapdh mrna cDNAs ถูกสังเคราะห์ด้วยไป taq dna โพลิเมอร์ (Promega, แมดิสัน) ใน Cycler ร้อน mycycler (ไบโอล้อ)ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์โดยข่าวคราวในเจล agarose และการย้อมสีด้วย ethidium โบรไมด์เพื่อตรวจสอบว่า amplicons เดียวของขนาดที่คาดว่าจะได้รับ.

วิเคราะห์ดวงตะวัน
เนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายในปั่นในบัฟเฟอร์สลาย hntg (50 มิลลิโมล / ลิตร 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonic กรด 150 มิลลิโมล / ลิตรโซเดียมคลอไรด์, 1% ไทรทัน x-100,และ 10% กลีเซอรีน) เสริมด้วยสารยับยั้งโปรติเอสค๊อกเทล (ซิก) lysates ได้ชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12000g เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของโปรตีนที่ได้รับการพิจารณาโดยวิธี Bradford (เพียร์ซ,, อิลลินอยส์) และจำนวนเงินที่เท่ากันของโปรตีนที่ถูกแยกจากกันโดย sds-polyacrylamide เจลอิเล็กโทรและโอนไปยังเมมเบรน nitrocelluloseเยื่อถูกบล็อกในน้ำเกลือ tris-บัฟเฟอร์ด้วยทวี 20 มี 5% นมแห้งไม่มีน้ำมันเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ผูกพันแอนติบอดีหลักถูกพบกับเปอร์ออกซิเดคู่แอนติบอดีรองและเพิ่มระบบตรวจจับการ chemiluminescence (เพียร์ซ) ความเข้มของวงดนตรีได้รับการพิจารณาโดยการวิเคราะห์ densitometric กับเจล doc ระบบเอกสารเจล (ไบโอล้อ, hercules,แคลิฟอร์เนีย) และโปรแกรมภาพเจ (NIH) และได้รับการปกติท​​ี่จะβ-โปรตีน ตรวจทั้งหมดถูกดำเนินการในที่ซ้ำกัน. พลาสม่า


วิเคราะห์เลือดถูกเก็บในหลอด haparinized และพลาสม่าได้จัดทำขึ้นได้ทันทีโดยการหมุนเหวี่ยง (890G, 4 ° C, 15 นาที) ความเข้มข้นของพลาสม่ากลูโคสไตรกลีเซอไรด์และคอเลสเตอรอลรวมถูกวัดด้วยชุดสีเชิงพาณิชย์ของเอนไซม์ (ฟาร์ม Asan, กรุงโซล,เกาหลี).


การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลจะถูกนำเสนอในฐานะหมายถึง± sem สองด้านการทดสอบเสื้อถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ความแตกต่างในการรับน้ำหนักของร่างกายและการรับประทานอาหารและข้อมูลที่พลาสม่าได้รับการวิเคราะห์โดยสองทางแปรปรวน สถิติถูกคำนวณโดยใช้ปริซึม GraphPad รุ่น 5.0 ซอฟต์แวร์ (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, แคลิฟอร์เนีย)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการและขั้นตอนการ
สัตว์ และมนุษย์ทดลอง
หนูชาย C57BL/6 ใช้ในการศึกษานี้ ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้อนุมัติจากซูดูแลสัตว์และใช้กรรมการ และตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ หนูถูกเลี้ยง 60% HFD (ทดลอง รัฐนิวบรันสวิก NJ) และถูกแบ่งเป็น 2 กลุ่ม: กลุ่มควบคุม (n = 7), และกลุ่มทดลอง (n = 7) ถือว่าครั้งหนึ่งวันกับ 0.075% แคปไซซินครีม ครีมแคปไซซินเตรียมไว้ โดยผสมแคปไซซินเป็นครีม hydrophilic พื้นฐาน (ซิก เซนต์หลุยส์ MO), และ 100 มิลลิกรัมใช้ผิว shaved ท้องแต่ละครั้ง สำหรับแคปไซซิน posttreatment หนูอ้วนได้รับ 60% HFD สัปดาห์ที่ 7 และได้รับแล้ว เป็นครีมบำรุงการควบคุม (n = 8) หรือ 0075% ครีมแคปไซซิน (n = 7) สัปดาห์ 7 เพิ่มเติมขณะที่ยังอยู่บน HFD แล้ว หนูมีน้ำหนัก และฆ่า โดยมดลูกเคลื่อน ทางถูกพู และชั่งน้ำหนักตัวไขมันไขมัน epididymal mesenteric ของเมาส์แต่ละ และเลือดรวบรวมจากใจ

วิเคราะห์สรีรวิทยา
กำหนดเนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายใน formalin ถูกบัฟเฟอร์กลาง 10% สำหรับ 24 ชม ตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และฝังในพาราฟินสำหรับวิเคราะห์สรีรวิทยา ตัวอย่างถูกตัด โดย microtome ติดบนภาพนิ่ง D-polylysine เคลือบกระจก deparaffinized ในไซ และสี hematoxylin และ eosin ประเมิน adipocyte ขนาด พื้นที่ครอบครอง โดย adipocytes ถูกคำนวณโดยใช้สัณฐานวิทยาลอยในโปรแกรมภาพ J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)

แยกอาร์เอ็นเอและการวิเคราะห์
เนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายได้ homogenized กับ TRIzol (Invitrogen คาร์ลส CA) RT-PCR ถูกใช้เพื่อวัดระดับของยีน ซึ่งได้ตามปกติจำนวน GAPDH mRNA cDNAs ถูกสังเคราะห์ ด้วยไป Taq DNA พอลิเมอเรส (Promega เมดิสัน WI) ในการ MyCycler ความร้อน Cycler (ไบ-Rad) ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสถูกวิเคราะห์ โดย electrophoresis ใน agarose เจ และย้อมสี ด้วยโบรไมด์ ethidium เพื่อตรวจสอบที่ amplicons เดี่ยวขนาดคาดได้ถูกรับการ

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตา
เนื้อเยื่อไขมันอวัยวะภายได้ homogenized ในบัฟเฟอร์การ lysis HNTG (50-mmol/l 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonic กรด 150 mmol/l NaCl ไตรตั้น 1% X-100 และกลีเซอร 10%) เสริม ด้วยรติเอสเตอร์ค็อกเทล (ซิกมา) Lysates ได้ขึ้ โดย centrifugation ที่ 12000g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนด โดยวิเคราะห์แบรดฟอร์ด (เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL), และจำนวนโปรตีนเท่าถูกคั่น ด้วย SDS polyacrylamide เจ electrophoresis และโอนย้ายไป nitrocellulose เข้า เยื่อหุ้มถูกบล็อกในน้ำเกลือ buffered ตรีกับ Tween 20 ประกอบด้วย 5% nonfat แห้งนม h 2 ที่อุณหภูมิห้อง แอนตี้หลักผูกพบแอนติบอดีรอง peroxidase ควบคู่กับระบบตรวจจับพิเศษ chemiluminescence (เพียร์ซ) ปลดปล่อยก๊าซวงถูกกำหนด โดยวิเคราะห์ densitometric อกเจเจเอกสารประกอบระบบ (Bio Rad เฮอร์คิวลิส CA) และโปรแกรมรูปภาพ J (NIH), และได้ตามปกติกับβ-แอกติน Assays ทั้งหมดถูกทำในซ้ำ

วิเคราะห์พลาสม่า
รวบรวมไว้ใน haparinized หลอดเลือด และพลาสม่าได้เตรียมทันที โดย centrifugation (890g, 4 ° C, 15 นาที) ได้วัดความเข้มข้นของพลาสมากลูโคส ไตรกลีเซอไรด์ และไขมันรวมกับพาณิชย์เอนไซม์ในระบบการวัดสีชุด (Pharm อาซาน โซล เกาหลี

วิเคราะห์สถิติ
ข้อมูลจะแสดงเป็นหมายถึง± s.e.m. หางสอง t-ทดสอบใช้ในการวิเคราะห์ความแตกต่างของน้ำหนักร่างกายได้รับและอาหารบริโภค และพลาสม่าข้อมูลถูกวิเคราะห์ โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง สถิติถูกคำนวณโดยใช้ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 5.0 GraphPad ปริซึม (ซอ GraphPad, La Jolla, CA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมาส์
ชาย C 57 BL / 6 วิธีการและขั้นตอน
สัตว์และการทดลองได้ใช้ในการศึกษานี้ วิธีการทดลองทั้งหมดได้รับอนุมัติโดยมหาวิทยาลัยของคณะกรรมการ ulsan สัตว์และการดูแลเอาใจใส่การใช้และสอดคล้องกับแนวทางของสถาบันแห่งชาติเพื่อ สุขภาพ หนูเป็นอาหาร 60% ที่ hfd (การวิจัยอาหาร New Brunswick , NJ )และได้แบ่งออกเป็นสองกลุ่มกลุ่มควบคุม( N = 7 )และกลุ่มทดลอง( N = 7 )ที่ได้รับการปฏิบัติเมื่อวันที่พร้อมด้วยสีครีม capsaicin oil 0.075 ml % สีครีม capsaicin ที่เตรียมไว้โดยการผสมลงไปในฐาน capsaicin สีครีมเคลือบ( Six Sigma St . Louis , MO )และ 100 มก.ก็นำมาใช้กับผิวบริเวณหน้าท้องโกนหนวดเคราในแต่ละโอกาส สำหรับ posttreatment capsaicin หนูเป็นโรคอ้วนได้เลี้ยง 60% hfd สำหรับ 7 สัปดาห์แล้วได้รับการควบคุมทั้งสีครีม( N = 8 )หรือที่ 0075% capsaicin สีครีม( N = 7 )สำหรับอีก 7 สัปดาห์ในขณะที่ยังคงอยู่บน hfd. ได้ แล้วหนูก็ต้องชั่งน้ำหนักและถูกฆ่าตายโดยทำแพลงรักษา หลอดบริเวณลูกอัณฑะมาใช้เพื่อไขมันไขมัน mesenteric ของเมาส์แต่ละกลุ่มมีและชั่งน้ำหนักและมีเลือดออกถูกเก็บรวบรวมจากใจกลาง

เนื้อเยื่อไขมันการวิเคราะห์เกี่ยวกับวิชาฮิซทอล - โอะจิ
ทมิฬถูกกำหนดในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์เป็นกลาง 10% สำหรับ 24 ชั่วโมงตัดเป็นชิ้นเล็กๆและการใช้งานเอ็มเบ็ดเด็ดในน้ำมันก๊าดสำหรับการวิเคราะห์เกี่ยวกับวิชาฮิซทอล - โอะจิ. ตัวอย่างนี้ก็ถูกตัดด้วย microtome ติดตั้งบนกระดานลื่นกระจก D - polylysine - เคลือบ deparaffinized ใน xylene และแต้มด้วย eosin และ hematoxylin เพื่อประเมินขนาด adipocyte บริเวณพื้นที่ที่ครอบครองโดย adipocytes จะคำนวณโดยใช้รูปร่างลักษณะของหินลอยอยู่ในโปรแกรม J ภาพ (การวิเคราะห์และแยก http://rsb.info.nih.gov/ij/).

rna
เนื้อเยื่อไขมันทมิฬสดพร่องมันเนยเป็นคนพร้อมด้วย trizol ( invitrogen ,ห้างสรรพสินค้า Carlsbad Outlet , CA ) Rt - pcr ถูกใช้ในการวัดระดับของยีนซึ่งเป็นการแสดงออกถึงความปรับให้สอดคล้องกับปริมาณของ gapdh mrna . cdnas สังเคราะห์ความถี่เป็นไปด้วยดีเอ็นเอ taq polymerase ( promega Madison , WI )ใน mycycler cycler ระบายความร้อน( bio-rad )polymerase ห่วงโซ่การตอบสนองเป็นวิเคราะห์โดย electrophoresis agarose ใน ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจลและเกิดรอยเปื้อนควรพร้อมด้วย ethidium ไม่น่าทึ่งในการตรวจสอบว่าเดี่ยว amplicons ของที่คาดว่าจะได้รับการมีขนาดได้รับ.

ตะวันตกทำให้เสียไปวิเคราะห์
ทมิฬเนื้อเยื่อไขมันได้สดพร่องมันเนยเป็นใน hntg lysis Buffer ( 50 - มิลลิโมล/ L 4 - ( 2 - hydroxyethyl ) - 1 - piperazineethansulfonic กรด, 150 - มิลลิโมล/ L NaCl , 1% Triton X - 100 ,และ 10% กลีซ - เออะริน)และเสริมด้วยค็อกเทลยาป้องกัน protease ( Six Sigma ) lysates ได้ชัดเจนขึ้นโดยผลิตที่/ 12000 g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ° C ความเข้มข้นโปรตีนจากเนื้อสัตว์ได้ถูกกำหนดโดย Bradford สอบ(แทง Rockford IL )และจำนวนที่เท่ากันของโปรตีนก็แยกจากกันโดย electrophoresis เจลเซิร์ฟเวอร์ SDS - polyacrylamide และจะพาท่านไปส่งถึงยัง nitrocellulose เยื่อเลือกผ่านความละเอียดสูงเยื่อเลือกผ่านความละเอียดสูงก็ถูกปิดกั้นในนมแห้ง nonfat น้ำเกลือพร้อมด้วยส่วนกลาง 20 ที่มี 5% บริษัททริสเรทติ้ง - Buffered สำหรับ 2 ชั่วโมงที่ อุณหภูมิ ห้อง เมื่อเส้นเลือดหลักผูกพันถูกตรวจพบกับแอนทิบอด - อิรอง peroxidase - ประกอบและระบบการตรวจจับ chemiluminescence ดียิ่งขึ้น(แทง) ความเข้มคลื่นความถี่ได้ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ densitometric ด้วยเจลเจล doc เอกสารประกอบการใช้งานระบบ( bio-rad ยักษ์ไม่)และโปรแกรม J ภาพ ( the NIH )และได้ปรับให้สอดคล้องกับเฉพาะ - actin assays ทั้งหมดนั้นดำเนินการในที่ซ้ำกัน.การวิเคราะห์

จอพลาสม่า
เลือดถูกเก็บรวบรวมในหลอด haparinized พลาสมาและเตรียมไว้ทันทีโดยผลิต( 890 G 4 ° C 15 นาที) สาขาวิชาพลาสมาของคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอร์ไรด์ในน้ำตาลกลูโคสในเป็นวัดด้วยชุด colorimetric enzymatic ทางการค้า( asan pharm กรุงโซลเกาหลีใต้)

ข้อมูลทางสถิติการวิเคราะห์ข้อมูล
ซึ่งจะช่วยจัดแสดงเป็นวิธีการ± s.e.m. สอง - หาง T - การทดสอบจะถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างในการ บริโภค อาหารและการเพิ่มน้ำหนักร่างกายและพลาสมาเป็นข้อมูลวิเคราะห์โดย anova แบบสองทาง จากสถิติก็คำนวณโดยใช้ graphpad ปริซึมเวอร์ชัน 5.0 ซอฟต์แวร์( graphpad ซอฟท์แวร์, La Jolla , CA )