To measure the activity of caspases instead of their proteolytic
activation state, one can use fluorogenic tetrapeptide substrates.
These tetrapeptide P4–P1 substrates, which fit in the catalytic
pocket of caspases and are recognized by the corresponding
S4–S1 residues in the protease, were selected by tetrapeptide combinatorial
libraries [43,44]. The cleavage occurs after the aspartic
acid residue at P1 and is coupled to 7-amino-4-methylcoumarin
(AMC) or 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC). Hydrolysis
of this peptide bond releases free AMC or AFC, and the consequent
fluorescence can be measured by a fluorometer. In this way acetyl(
Ac)-DEVD-AMC was proposed as a preferred substrate for
caspase-3 and -7, Ac-LEHD-AMC for caspase-5, Ac-YVAD-AMC for
caspase-1 and -4, Ac-IETD-AMC for caspase-8 and -6, and Ac-
WEHD-AMC for caspase-1, -4 and -5 [43]. However, the claimed
specificities of the peptide substrates should be viewed with caution
[45]. The problem is that peptide substrate specificity is often
abolished by high caspase concentrations, and what really matters
for the proteolytic activity is not specificity but the Kcat value [46].
Cellular concentrations of caspase-3 also cleave Ac-IETD-AMC
(substrate for caspase-8 and -6) even more efficiently than caspase-
8 and -6, due to the high Kcat value of caspase-3. Therefore,
enzymatic measurements of caspase activities should be combined
with immunoblotting to identify the presence and activation status
of the caspase.
To measure the activity of caspases instead of their proteolyticactivation state, one can use fluorogenic tetrapeptide substrates.These tetrapeptide P4–P1 substrates, which fit in the catalyticpocket of caspases and are recognized by the correspondingS4–S1 residues in the protease, were selected by tetrapeptide combinatoriallibraries [43,44]. The cleavage occurs after the asparticacid residue at P1 and is coupled to 7-amino-4-methylcoumarin(AMC) or 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC). Hydrolysisof this peptide bond releases free AMC or AFC, and the consequentfluorescence can be measured by a fluorometer. In this way acetyl(Ac)-DEVD-AMC was proposed as a preferred substrate forcaspase-3 and -7, Ac-LEHD-AMC for caspase-5, Ac-YVAD-AMC forcaspase-1 and -4, Ac-IETD-AMC for caspase-8 and -6, and Ac-WEHD-AMC for caspase-1, -4 and -5 [43]. However, the claimedspecificities of the peptide substrates should be viewed with caution[45]. The problem is that peptide substrate specificity is oftenabolished by high caspase concentrations, and what really mattersfor the proteolytic activity is not specificity but the Kcat value [46].Cellular concentrations of caspase-3 also cleave Ac-IETD-AMC(substrate for caspase-8 and -6) even more efficiently than caspase-8 and -6, due to the high Kcat value of caspase-3. Therefore,enzymatic measurements of caspase activities should be combinedwith immunoblotting to identify the presence and activation statusof the caspase.
การแปล กรุณารอสักครู่..
วัดกิจกรรมของ caspases แทนของพวกเขาโปรตีน
กระตุ้นรัฐ หนึ่งสามารถใช้ fluorogenic เตตระเพปไทด์พื้นผิว .
เหล่านี้เตตระเพปไทด์ P4 ) P1 พื้นผิวที่เหมาะสมในการ caspases
กระเป๋าของและรู้จักที่ S4 s1
) ตกค้างในโปรติเอสจำนวนเตตระเพปไทด์เชิง
ห้องสมุด [ 43,44 ] ลึกเกิดขึ้นหลังจากเสีย
กรดที่ตกค้าง และอยู่คู่กับ 7-amino-4-methylcoumarin P1
( AMC ) หรือ 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin ( AFC ) การย่อยสลาย
นี้พันธะเพปไทด์ออก บบส. ฟรี หรือ เอเอฟซี และเรืองแสงจาก
สามารถวัดได้โดยฟลู โรมิเตอร์ . ในวิธีนี้อะ (
AC ) - devd-amc ถูกเสนอเป็นสารตั้งต้นที่ต้องการ
การศึกษาลักษณะและ - 7 , AMC lehd AC caspase-5 , AMC yvad AC
caspase-1 และ - 4AC ietd AMC สำหรับ caspase-8 และ - 6 , และ AC -
wehd-amc สำหรับ caspase-1 , - 4 - 5 [ 43 ] อย่างไรก็ตาม อ้างว่า
- เปปไทด์พื้นผิวควรจะดูด้วยความระมัดระวัง
[ 45 ] ปัญหาคือว่าเปปไทด์ตั้งต้นเพาะมัก
แคสเปสยกเลิกโดยความเข้มข้นสูง และสิ่งที่สำคัญจริงๆ
สำหรับกิจกรรมจำเพาะ คือไม่เฉพาะเจาะจง แต่ค่า kcat
[ 46 ]การศึกษาลักษณะความเข้มข้นเซลล์ยังติด AC ietd AMC
( พื้นผิวสำหรับ caspase-8 และ - 6 ) แม้มีประสิทธิภาพมากขึ้นกว่าแคสเปส -
8 - 6 , เนื่องจากการสูง kcat คุณค่าของการศึกษาลักษณะ . ดังนั้น การวัดกิจกรรมของเอนไซม์แคสเปส
) ควรรวมกับการระบุตัวตนและกระตุ้นสถานะ
ของแคสเปส .
การแปล กรุณารอสักครู่..