4. DiscussionIn this work we tested

4. Discussion
In this work we tested four inhibitors of phosphotyrosine
kinases on rotavirus infectivity. Genistein was the only inhibitor
that reduced the number of infectious foci when added to the cells
1 h prior infection and during the adsorption period of rotavirus
strain RRV. The drug also inhibited virus progeny production when
it was added after adsorption of the virus and kept until virus was
harvested 12 h later; however, this inhibition seems to be nonspecific
since genistein induced a general cell translation arrest under
these conditions. In this regard, it has been reported that genistein
inhibits the replication of several viruses, including, among others,
cytomegalovirus, arenaviruses, and human immunodeficiency
virus (Andres et al., 2009; Evers et al., 2005; Stantchev et al., 2007;
Vela et al., 2008). It would be interesting to test if the inhibitory
effect of genistein on the replication of some of these viruses is
related with the inhibition of cellular protein synthesis observed
in this work.
The evidence provided in this work strongly suggests that genistein
inhibits rotavirus infectivity by interfering with the early
interaction of the virus with the cell surface. The observations that
support this conclusion are: a) the drug reduced the infectivity of
rotavirus strain SA11 when it was present only during virus adsorption;
b) the infectivity of the virus was not affected when genistein
was added after having adsorbed the virus in the absence of drug,
and c) the infectivity of the virus was not affected by genistein
when transcriptionally active SA11 DLPs were lipofected into cells,
bypassing the entry step. Most importantly, it was shown directly
that binding of the virus to the cell surface is reduced in the presence
of drug and, if added after the virus had been attached at 4 ◦C,
genistein promoted the detachment of most of the bound virus
(Fig. 5).
As genistein inhibits the function of PTKs, and the catalytic site
of these enzymes is located in the cell’s interior, the site of action
of the drug should be intracellular. How this intracellular PTKdrug
interaction translates into changes in the extracellular space
is exemplified by the “inside-out” signaling of integrins. Integrins
are heterodimeric cell adhesion receptors involved in mediating
interactions between cells and cells and the extracellular matrix.
146 T. López et al. / Virus Research 210 (2015) 141–148
Fig. 5. Genistein causes the detachment of rotavirus from the cell surface. (A) Cells were incubated with SA11 TLPs for 1 h at 4 ◦C, unbound virus was washed, and cells were
fixed (Control 4 ◦C) or incubated at 37 ◦C for 1 h in the absence (Control 37 ◦C) or presence of 100 M genistein (Genistein 37 ◦C) and then fixed. Viral particles were detected
by immunofluorescence using a polyclonal serum to rotavirus particles and an anti-rabbit Alexa488-coupled antibody (green); cells were also stained with phalloidin coupled
to Alexa568 (red). (B) Detection of 35S-labeled-rotavirus particles. 35S-labeled SA11 TLPs were adsorbed to MA104 cells for 1 h at 4 ◦C and processed (lanes 1 and 2), or cells
were transferred to 37 ◦C for 1 h in the presence (4, 6 and 8) or absence (3, 5 and 7) of genistein. The virus associated to cells, i.e., excluding the one present in the cell
medium, was collected (1, 3 and 4) or the cells were washed with EGTA and then collected (2, 5 and 6). The cell medium of cells incubated at 37 ◦C was collected (7 and 8). The
samples were analyzed by SDS-PAGE; one representative experiment is shown. C) Quantitative data from experiments described in B. The 35S-labeled SA11 proteins present
in a fraction of the samples analyzed by gel electrophoresis was quantified in a scintillation counter, and the data obtained was expressed as percent of the virus bounds to
cells at 4 ◦C. The data represent the arithmetic mean ± SEM of tree independent experiments performed in duplicate. *P < 0.05 (statistical difference of control compared to
genistein-treated cells), **P = 0.001 (statistical difference of mock-treated compared to EGTA-treated cells).
The affinity of integrins for their ligands can be altered by changes
in the intracellular domain of these proteins, through a feature
known as “inside-out” signaling or integrin activation (Calderwood,
2004). Integrin activation is controlled by phosphorylation events,
for example, tyrosine phosphorylation in the intracellular tail of
integrin 3 reduces cell adhesion, suggesting that this modification
controls the affinity of the integrin for its ligand (Datta et al.,
2002). In the light of these observations, one possible interpretation
of our data is that genistein-sensitive strains require activated
integrins to efficiently enter into the cell, although it can not be discarded
that another, so far uncharacterized cell surface molecule,
might be required for this purpose. An observation that supports
this hypothesis is that the strains that are not susceptible to genistein,
like UK and TFR-41, have been reported not to use integrins to
infect cells (Graham et al., 2003).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

4. สนทนาในงานนี้ เราได้ทดสอบ inhibitors สี่ของ phosphotyrosinekinases บน rotavirus infectivity Genistein ผลเท่านั้นที่ลดการติดเชื้อ foci เมื่อเซลล์เพิ่มจำนวน1 h ติดเชื้อก่อนและช่วงดูดซับของ rotavirusต้องใช้ RRV ยาที่ห้ามผลิตลูกหลานที่ไวรัสยังเมื่อมันเพิ่มหลังจากการดูดซับของไวรัส และเก็บไว้จนกว่าจะถูกไวรัสเก็บเกี่ยว 12 h หลัง อย่างไรก็ตาม การยับยั้งนี้ดูเหมือนจะเจาะจงเนื่องจาก genistein เกิดจับแปลเป็นเซลล์ทั่วไปภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ในการนี้ จะได้รับรายงานว่า genisteinยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสต่าง ๆ รวมทั้ง หมู่คนอื่น ๆcytomegalovirus, arenaviruses และเอชไอวีที่มนุษย์ไวรัส (แซ et al., 2009 Evers et al., 2005 Stantchev et al., 2007โรง et al., 2008) มันจะน่าสนใจที่จะทดสอบที่ลิปกลอสไขผลของ genistein ในการจำลองแบบของไวรัสเหล่านี้คือที่เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนเซลที่สังเกตในงานนี้หลักฐานที่มาในงานนี้ขอแนะนำว่า genisteinยับยั้ง rotavirus infectivity โดยรบกวนช่วงโต้ตอบของไวรัสกับเซลล์ผิว การสังเกตที่บทสรุปนี้จะสนับสนุน: การ) ยาลด infectivity ของต้องใช้ rotavirus SA11 เมื่ออยู่เฉพาะช่วงดูดซับไวรัสข) infectivity ไวรัสไม่ได้รับผลกระทบเมื่อ genisteinเพิ่มหลังจากมี adsorbed ไวรัสของยาเสพติดและ c) infectivity ของไวรัสไม่ได้รับผลกระทบ โดย genisteinเมื่อใช้งาน transcriptionally SA11 DLPs ได้ lipofected ลงในเซลล์ข้ามขั้นตอนรายการ สำคัญที่สุด มันถูกแสดงโดยตรงที่ผูกของไวรัสไปยังพื้นผิวของเซลล์จะลดลงในการของยาเสพติด และ เพิ่มหลังจากที่มีการแนบไวรัสที่ 4 ◦Cgenistein ส่งเสริมปลดของไวรัสถูกผูกไว้(Fig. 5)เป็น genistein ยับยั้งการทำงานของ PTKs และเว็บไซต์ตัวเร่งปฏิกิริยาเอนไซม์เหล่านี้อยู่ในภายในของเซลล์ การดำเนินการของของยาเสพติดควรได้ intracellular วิธีนี้ intracellular PTKdrugโต้ตอบแปลเป็นการเปลี่ยนแปลงในพื้นที่ extracellularexemplified โดยตามปกติ "ออกภายใน" ของ integrins Integrinsreceptors heterodimeric เซลล์ยึดเกาะเกี่ยวข้องในการเป็นสื่อกลางโต้ตอบระหว่างเซลล์ และเซลล์เคลือบต. 146 López et al. / วิจัยไวรัส 210 (2015) 141-148Fig. 5 Genistein ทำให้ปลดของ rotavirus จากผิวเซลล์ (A) เซลล์ถูก incubated กับ SA11 TLPs สำหรับ h 1 ที่ 4 ◦C ถูกล้างไวรัสผูก และเซลล์ได้ถาวร (ควบคุม 4 ◦C) หรือ incubated ที่ ◦C 37 สำหรับ 1 h ขาด (ควบคุม 37 ◦C) หรือสถานะของ genistein 100 เมตร (Genistein 37 ◦C) และจากนั้น คง ตรวจพบอนุภาคไวรัสโดย immunofluorescence ใช้เซรั่ม polyclonal rotavirus อนุภาคและมีกระต่ายป้องกันควบคู่ Alexa488 แอนติบอดี (สีเขียว); เซลล์มีสียังกับ phalloidin ควบคู่to Alexa568 (red). (B) Detection of 35S-labeled-rotavirus particles. 35S-labeled SA11 TLPs were adsorbed to MA104 cells for 1 h at 4 ◦C and processed (lanes 1 and 2), or cellswere transferred to 37 ◦C for 1 h in the presence (4, 6 and 8) or absence (3, 5 and 7) of genistein. The virus associated to cells, i.e., excluding the one present in the cellmedium, was collected (1, 3 and 4) or the cells were washed with EGTA and then collected (2, 5 and 6). The cell medium of cells incubated at 37 ◦C was collected (7 and 8). Thesamples were analyzed by SDS-PAGE; one representative experiment is shown. C) Quantitative data from experiments described in B. The 35S-labeled SA11 proteins presentin a fraction of the samples analyzed by gel electrophoresis was quantified in a scintillation counter, and the data obtained was expressed as percent of the virus bounds tocells at 4 ◦C. The data represent the arithmetic mean ± SEM of tree independent experiments performed in duplicate. *P < 0.05 (statistical difference of control compared togenistein-treated cells), **P = 0.001 (statistical difference of mock-treated compared to EGTA-treated cells).The affinity of integrins for their ligands can be altered by changesin the intracellular domain of these proteins, through a featureknown as “inside-out” signaling or integrin activation (Calderwood,2004). Integrin activation is controlled by phosphorylation events,for example, tyrosine phosphorylation in the intracellular tail ofintegrin 3 reduces cell adhesion, suggesting that this modificationcontrols the affinity of the integrin for its ligand (Datta et al.,2002). In the light of these observations, one possible interpretationof our data is that genistein-sensitive strains require activatedintegrins to efficiently enter into the cell, although it can not be discardedthat another, so far uncharacterized cell surface molecule,might be required for this purpose. An observation that supportsthis hypothesis is that the strains that are not susceptible to genistein,like UK and TFR-41, have been reported not to use integrins toinfect cells (Graham et al., 2003).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

4.
การอภิปรายในงานนี้เราได้ทดสอบสี่ของสารยับยั้งphosphotyrosine
ไคเนสส์ในการติดเชื้อโรตาไวรัส genistein
เป็นสารยับยั้งเท่านั้นที่ลดลงจำนวนfoci ติดเชื้อเมื่อเข้ามาเซลล์
1 ชั่วโมงก่อนที่การติดเชื้อและในช่วงเวลาการดูดซับของโรตาไวรัส
RRV ความเครียด ยาเสพติดนอกจากนี้ยังสามารถยับยั้งการผลิตลูกหลานไวรัสเมื่อมันถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากการดูดซับของไวรัสและเก็บไว้จนไวรัสเก็บเกี่ยว12 ชั่วโมงต่อมา; แต่การยับยั้งนี้ดูเหมือนว่าจะเชิญชมตั้งแต่ genistein เหนี่ยวนำให้เกิดเซลล์จับกุมแปลทั่วไปภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ในเรื่องนี้จะได้รับการรายงานว่า genistein ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสหลายรวมทั้งหมู่คนcytomegalovirus, arenaviruses และเอดส์ไวรัส(Andres et al, 2009;. Evers et al, 2005;.. Stantchev, et al, 2007. Vela et al, 2008) มันจะน่าสนใจที่จะทดสอบถ้ายับยั้งผลของ genistein ในการจำลองแบบของบางส่วนของไวรัสเหล่านี้จะเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนโทรศัพท์มือถือที่สังเกตเห็นในงานนี้. หลักฐานที่ระบุไว้ในงานนี้อย่างมากแสดงให้เห็นว่า genistein ยับยั้งการติดเชื้อโรตาไวรัสโดยรบกวน ในช่วงต้นของการทำงานร่วมกันของไวรัสที่มีพื้นผิวเซลล์ การสำรวจที่สนับสนุนข้อสรุปนี้ก) ยาเสพติดลดการติดเชื้อของ SA11 ความเครียดโรตาไวรัสเมื่อมันถูกนำเสนอเฉพาะในช่วงการดูดซับไวรัสข) การติดเชื้อของไวรัสที่ไม่ได้รับผลกระทบเมื่อ genistein ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากที่มีการดูดซับไวรัสในกรณีที่ไม่มี ของยาเสพติดและค) การติดเชื้อของไวรัสที่ไม่ได้รับผลกระทบจาก genistein เมื่อใช้งาน transcriptionally DLPs SA11 ถูก lipofected เข้าสู่เซลล์, การผ่านขั้นตอนการเข้า สิ่งสำคัญที่สุดคือมันแสดงให้เห็นโดยตรงที่มีผลผูกพันของเชื้อไวรัสให้กับเซลล์ผิวจะลดลงในการปรากฏตัวของยาเสพติดและถ้าเพิ่มเข้ามาหลังจากไวรัสที่ได้รับการติดอยู่ที่4 ◦C, genistein การเลื่อนออกส่วนใหญ่ของไวรัสที่ถูกผูกไว้(รูปที่ . 5). ในฐานะที่เป็น genistein ยับยั้งการทำงานของ PTKs และเว็บไซต์การเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์เหล่านี้ตั้งอยู่ในเซลล์ของการตกแต่งภายในที่เว็บไซต์ของการกระทำของยาเสพติดที่ควรจะเป็นภายในเซลล์ วิธี PTKdrug เซลล์นี้การทำงานร่วมกันแปลเป็นการเปลี่ยนแปลงในพื้นที่นอกเป็นตัวอย่างโดย"ภายในออก" การส่งสัญญาณของ integrins Integrins เป็นผู้รับการยึดเกาะของเซลล์ heterodimeric ส่วนร่วมในการไกล่เกลี่ยปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และเซลล์และextracellular เมทริกซ์. 146 ตLópez et al, / วิจัยไวรัส 210 (2015) 141-148 รูป 5. Genistein ทำให้เกิดการปลดของโรตาไวรัสจากเซลล์ผิว (A) เซลล์ที่ถูกบ่มกับ SA11 TLPs 1 ชั่วโมงที่ 4 ◦Cไวรัสหลุดถูกล้างและเซลล์ที่ได้รับการแก้ไข(ควบคุม 4 ◦C) หรือบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในกรณีที่ไม่มี (control 37 ◦C) หรือการปรากฏตัวของ 100 M genistein (Genistein 37 ◦C) และจากนั้นคงที่ อนุภาคไวรัสที่ตรวจพบโดยอิมมูโนโดยใช้ซีรั่มโพลีอนุภาคโรตาไวรัสและป้องกันกระต่ายแอนติบอดี Alexa488 คู่ (สีเขียว); เซลล์ก็ถูกย้อมด้วยสี phalloidin ควบคู่ไปAlexa568 (สีแดง) (ข) การตรวจหาอนุภาคที่มีข้อความ 35S-โรตาไวรัส 35S ที่มีข้อความ SA11 TLPs ถูกดูดซับไป MA104 เซลล์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 ◦Cและประมวลผล (ช่องที่ 1 และ 2) หรือเซลล์ถูกย้ายไป37 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในการปรากฏตัว (4, 6 และ 8) หรือไม่มี ( 3, 5 และ 7) ของ genistein ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับเซลล์คือไม่รวมอยู่ในหนึ่งในมือถือกลางที่ถูกเก็บรวบรวม (1, 3 และ 4) หรือเซลล์ที่ถูกล้างด้วย EGTA และรวบรวมแล้ว (2, 5 และ 6) กลางเซลล์ของเซลล์บ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cถูกเก็บรวบรวม (7 และ 8) ตัวอย่างมาวิเคราะห์โดยวิธี SDS-PAGE; การทดลองแสดงให้เห็นว่าตัวแทน C) ข้อมูลเชิงปริมาณจากการทดลองที่อธิบายไว้ในบีโปรตีน SA11 35S ที่มีข้อความในปัจจุบันในส่วนของตัวอย่างที่วิเคราะห์โดยข่าวคราวถูกวัดในประกายเคาน์เตอร์และข้อมูลที่ได้รับการแสดงเป็นร้อยละของขอบเขตไวรัสไปยังเซลล์ที่4 ◦C ข้อมูลที่เป็นตัวแทนของการคำนวณค่าเฉลี่ย± SEM ของการทดลองอิสระต้นไม้ดำเนินการในที่ซ้ำกัน * P <0.05 (ความแตกต่างทางสถิติในการควบคุมเมื่อเทียบกับเซลล์genistein รับการรักษา) ** P = 0.001 (ความแตกต่างทางสถิติของการจำลองที่ได้รับเมื่อเทียบกับเซลล์ EGTA รับการรักษา). ความสัมพันธ์ของ integrins สำหรับแกนด์ของพวกเขาสามารถเปลี่ยนแปลงจากการเปลี่ยนแปลงในโดเมนภายในเซลล์ของโปรตีนเหล่านี้ผ่านคุณสมบัติที่เรียกว่า "ภายในออก" หรือส่งสัญญาณยืนยันการใช้งาน integrin (วูด, 2004) การเปิดใช้งาน integrin ถูกควบคุมโดยเหตุการณ์ phosphorylation, ตัวอย่างเช่นฟอสโฟซายน์ในหางของเซลล์integrin 3 ช่วยลดการยึดเกาะของเซลล์บอกว่าการเปลี่ยนแปลงนี้จะควบคุมความสัมพันธ์ของintegrin สำหรับแกนด์ของ (Datta et al., 2002) ในแง่ของการสังเกตเหล่านี้อย่างใดอย่างหนึ่งการตีความที่เป็นไปได้ของข้อมูลของเราคือการที่สายพันธุ์ genistein ที่มีความอ่อนไหวต้องเปิดใช้งาน integrins ได้อย่างมีประสิทธิภาพเข้าสู่เซลล์แม้ว่ามันจะไม่สามารถทิ้งที่อื่นเพื่อให้ห่างไกลuncharacterized โมเลกุลเซลล์ผิว, อาจจะจำเป็นสำหรับการนี้ วัตถุประสงค์. ข้อสังเกตที่สนับสนุนสมมติฐานนี้คือสายพันธุ์ที่ไม่ไวต่อการ genistein, เช่นสหราชอาณาจักรและ TFR-41 ได้รับรายงานจะไม่ใช้ integrins ที่จะติดเชื้อเซลล์(เกรแฮม et al., 2003)