Casein Sigma (St. Louis, MO, USA),

Casein Sigma (St. Louis, MO, USA), DEAE-cellulose, DEAESephadex
and Sephadex G-75 provided by Pharmacia (Uppsala,
Sweden). All other chemicals were reagent grade and purchased
from Merck (Darmstadt, Germany).
2.2. Specimen collection, crude enzyme extract and enzyme
purification
L. vannamei, caught from Persian Gulf, was immediately frozen
and transported to our enzymology laboratory in Hormozgan
University, Bandar Abbas. The frozen samples were then stored
at
80
C until used. Fresh shrimp pancreas was freed from the
adhering meninges and blood and the gray matter was removed
by gross dissection. Pancreas tissue was re-suspended in 10 ml of
50 mM phosphate buffer, pH 7.5. The suspension was subjected
to sonic disruption, 10 s on, 45 s 0ff for 15 min, and cell debris
was discarded by centrifugation at 15,000g for 20 min. The supernatant
was subjected to ammonium sulfate precipitation. The protein
was then dissolved in minimal amount of phosphate buffer
and dialyzed against the same buffer for 24 h at 4
C, changing dialysis
buffer every 8 h. The dialyzed sample was subjected to anionexchange
chromatography, using a DEAE-cellulose column, previously
equilibrated with 50 mM phosphate buffer pH 7.5. The column
was washed with the same buffer until no protein was
detected in the eluent. Then it was eluted using a gradient of 0–
1 M NaCl in the same buffer at a flow rate of 1 ml/min and 2 ml
fractions were collected. To determine the protein content of each
fraction the absorbance at 280 nm was measured using UV–vis
spectrophotometer. The active fractions from this and subsequent
chromatographies were measured with casein as a substrate. Fractions
with proteolytic activity were pooled and applied to a DEAESephadex
fast flow column, pre-equilibrated with 50 mM phosphate
buffer at pH 7.5. The column was washed with the same buffer
until no protein was detected in the eluent. Then it was eluted
using a gradient of 0–1 M NaCl in the same buffer at a flow rate of
1 ml/min. The enzyme from the previous step was placed on a column
of Sephadex G-75 previously equilibrated with 50 mM phosphate
buffer pH 7.5. A flow rate of 1 ml/min was maintained and
fractions of 2 ml were collected. The enzyme appeared in the effluent,
immediately after the void volume, and the active fractions
from tubes were pooled and concentrated in an ultrafiltration
chamber with a 5 kDa membrane cut-off and analyzed for proteins
and enzyme activity. The concentrated enzyme was dialyzed
against 50 mM phosphate buffer pH 7.5.
2.3. Electrophoresis, measurement of protease activity and protein
concentration
The proteins were identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis using a Mini-PROTEAN electrophoretic
system (BioRad). Electrophoresis was carried out at a
constant current of 85 mA (Laemmli, 1970) and the gels were
stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (Wilson, 1983). Protease
activity was determined at room temperature, using casein
as substrate, by the method of Homaei (Homaei et al., 2014,
2010; Homaei & Etemadipour, 2015). One unit of protease is
defined as the amount of enzyme that hydrolyzes casein to produce
equivalent absorbance to 1 lmol of tyrosine/min with tyrosine
as standard. Protein concentration was estimated by the
Bradford method (Bradford, 1968) using bovine serum albumin
as standard.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วน Sigma (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) DEAESephadex, DEAE-เซลลูโลสและ Sephadex G-75 โดย Pharmacia (Uppsalaประเทศสวีเดน) สารเคมีอื่น ๆ ได้เกรดรีเอเจนต์ และซื้อจากเมอร์ค (ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี)2.2. ตัวอย่างเก็บรวบรวม สารสกัดจากเอนไซม์ดิบ และเอนไซม์ทำให้บริสุทธิ์L. vannamei จับได้จากอ่าวเปอร์เซีย ถูกแช่แข็งทันทีและส่งไปห้องปฏิบัติการของเรา enzymology ใน Hormozganมหาวิทยาลัย ระเบิดบันดาร์ ได้เก็บตัวอย่างแช่แข็งไว้ที่ 80 C จนใช้ ตับอ่อนกุ้งสดที่ว่างจากการโดยมีเกาะติด และเลือด และเรื่องสีเทาถูกเอาออกโดยช่วยให้การวิเคราะห์ขั้นต้น เนื้อเยื่อของตับอ่อนถูกเลื่อนออกไปอีก 10 ml ของ50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.5 ภายใต้การระงับโซนิคทรัพย 10 s บน 45 s 0ff 15 นาที และเศษเซลล์ถูกละทิ้ง โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 g 20 นาที ใน supernatantภายใต้การแอมโมเนียมซัลเฟตฝน ในโปรตีนแล้วละลายในฟอสเฟตบัฟเฟอร์จำนวนน้อยที่สุดและ dialyzed กับบัฟเฟอร์ที่เดียวสำหรับ 24 ชั่วโมงที่ 4 C การเปลี่ยนไตบัฟเฟอร์ทุก 8 ชั่วโมง ตัวอย่าง dialyzed ภายใต้ anionexchangechromatography ใช้คอลัมน์ DEAE-เซลลูโลส ก่อนหน้านี้equilibrated กับ 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.5 คอลัมน์ถูกล้างบัฟเฟอร์เดียวจนโปรตีนไม่ได้พบใน eluent แล้ว มัน eluted ใช้การไล่ระดับสีของ 0-1 M NaCl ในบัฟเฟอร์เดียวที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาทีและ 2 มล.เศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวม การตรวจสอบปริมาณโปรตีนของแต่ละส่วน absorbance ที่ 280 nm มีวัดโดยใช้ UV – visspectrophotometer ส่วนงานนี้ และในเวลาต่อมาchromatographies ถูกวัด ด้วยเคซีนเป็นพื้นผิว เศษส่วนกับกิจกรรมได้พู และนำไปใช้กับ DEAESephadexคอลัมน์ไหลเร็ว ก่อน equilibrated ฟอสเฟต 50 มม.บัฟเฟอร์ที่ pH 7.5 คอลัมน์ถูกล้าง ด้วยบัฟเฟอร์ที่เดียวกันจนกว่าจะมีการตรวจพบโปรตีนไม่ถูก eluent แล้ว มันเป็น elutedใช้การไล่ระดับสีที่ 0 – 1 M NaCl ในบัฟเฟอร์เดียวที่อัตราการไหล1 มิลลิลิตร/นาที เอนไซม์จากขั้นตอนก่อนหน้านี้ถูกวางไว้บนคอลัมน์ของ Sephadex G-75 ก่อนหน้านี้ equilibrated ฟอสเฟต 50 มม.บัฟเฟอร์ pH 7.5 เป็นรักษาอัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาที และส่วนใน 2 มล.ถูกเก็บรวบรวม เอนไซม์ที่ปรากฏในน้ำทันทีที่เสียงเป็นโมฆะ และเศษส่วนที่ใช้งานอยู่จากพู และเข้มข้นในการกรองหลอดหอค้าที่ มีการตัดเยื่อ 5 kDa และวิเคราะห์สำหรับโปรตีนและเอนไซม์ เอนไซม์เข้มข้นถูก dialyzedกับ 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.52.3. อิ วัดกิจกรรมรติเอสและโปรตีนความเข้มข้นระบุโปรตีน โดยโซเดียม dodecyl ซัลเฟต polyacrylamideอิเจใช้แบบมินิ-PROTEAN electrophoreticระบบ (BioRad) อิดำเนินการที่เป็นอย่างต่อเนื่องปัจจุบัน 85 mA (Laemmli, 1970) และแบบเจลเลอะ R-250 Coomassie สีฟ้าสดใส (Wilson, 1983) รติเอสactivity was determined at room temperature, using caseinas substrate, by the method of Homaei (Homaei et al., 2014,2010; Homaei & Etemadipour, 2015). One unit of protease isdefined as the amount of enzyme that hydrolyzes casein to produceequivalent absorbance to 1 lmol of tyrosine/min with tyrosineas standard. Protein concentration was estimated by theBradford method (Bradford, 1968) using bovine serum albuminas standard.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เคซีน Sigma ( St. Louis, MO, USA) DEAE-เซลลูโลส DEAESephadex
และ Sephadex G-75 ให้โดย Pharmacia (Uppsala,
สวีเดน) สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดเป็นเกรดน้ำยาและซื้อ
จากเมอร์ (Darmstadt, เยอรมนี).
2.2 การเก็บตัวอย่างสารสกัดเอนไซม์และเอนไซม์
บริสุทธิ์
ลิตร vannamei จับจากอ่าวเปอร์เซียถูกแช่แข็งทันที
และถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการเอนไซม์เราใน Hormozgan
มหาวิทยาลัยบันดาร์อับบาส กลุ่มตัวอย่างที่ถูกแช่แข็งเก็บไว้แล้ว
ที่? 80? C จนกว่าจะใช้ ตับอ่อนกุ้งสดเป็นอิสระจาก
เยื่อหุ้มสมองและยึดมั่นในเลือดและเรื่องสีเทาถูกลบออก
จากการผ่าขั้นต้น เนื้อเยื่อตับอ่อนเป็นอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน 10 มิลลิลิตร
ขนาด 50 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.5 การระงับการได้ภายใต้
การหยุดชะงักโซนิค 10 เมื่อวันที่ 45 s 0ff นาน 15 นาทีและเศษเซลล์
ถูกยกเลิกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000? กรัมเป็นเวลา 20 นาที ใส
ได้ภายใต้การแอมโมเนียมซัลเฟตตกตะกอน โปรตีน
ก็เลือนหายไปแล้วในจำนวนน้อยที่สุดของฟอสเฟตบัฟเฟอร์
และ dialyzed กับบัฟเฟอร์เดียวกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเปลี่ยนฟอกไต
บัฟเฟอร์ทุก 8 ชั่วโมง ตัวอย่าง dialyzed ได้ภายใต้การ anionexchange
โคโดยใช้คอลัมน์ DEAE-เซลลูโลสก่อนหน้านี้
equilibrated กับขนาด 50 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.5 คอลัมน์
ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์เดียวกันจนไม่มีโปรตีนถูก
ตรวจพบในตัวชะ จากนั้นก็จะถูกใช้ชะลาด 0-
1 M NaCl ในบัฟเฟอร์เดียวกันในอัตราการไหล 1 มล. / นาทีและ 2 มิลลิลิตร
เศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวม เพื่อตรวจสอบปริมาณโปรตีนของแต่ละ
ส่วนการดูดกลืนแสงที่ 280 นาโนเมตรได้รับการวัดโดยใช้ UV-Vis
spectrophotometer เศษส่วนที่ใช้งานจากนี้และต่อมา
chromatographies ถูกวัดด้วยเคซีนเป็นสารตั้งต้น เศษส่วน
ที่มีกิจกรรมโปรตีนถูกรวบรวมและนำไปใช้กับ DEAESephadex
คอลัมน์ไหลเร็วก่อน equilibrated กับขนาด 50 มมฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ที่ pH 7.5 คอลัมน์ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์เดียวกัน
จนไม่มีโปรตีนถูกตรวจพบในตัวชะ จากนั้นก็จะถูกชะ
ใช้ความลาดชัน 0-1 M NaCl ในบัฟเฟอร์เดียวกันที่อัตราการไหล
1 มล. / นาที เอนไซม์จากขั้นตอนก่อนถูกวางลงบนคอลัมน์
ของ Sephadex G-75 equilibrated ก่อนหน้านี้มีขนาด 50 มมฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ค่า pH 7.5 อัตราการไหล 1 มล. / นาทีถูกเก็บรักษาไว้และ
เศษของ 2 มิลลิลิตรถูกเก็บรวบรวม เอนไซม์ที่ปรากฏอยู่ในน้ำทิ้ง,
ทันทีหลังจากที่ปริมาณโมฆะและเศษส่วนที่ใช้งาน
จากหลอดถูกรวบรวมและเข้มข้นในกรอง
ห้องมี 5 เมมเบรน kDa ตัดและวิเคราะห์โปรตีน
และเอนไซม์ เอนไซม์เข้มข้นถูก dialyzed
กับขนาด 50 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.5.
2.3 electrophoresis วัดของกิจกรรมโปรติเอสและโปรตีน
เข้มข้นของ
โปรตีนที่ถูกระบุโดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide
gel electrophoresis ใช้อิเลค Mini-Protean
ระบบ (BioRad) electrophoresis ได้ดำเนินการใน
ปัจจุบันคงที่ของ 85 mA (Laemmli, 1970) และเจลที่ถูก
ย้อมด้วยสีฟ้าสดใส Coomassie R-250 (วิลสัน, 1983) โปรติเอส
กิจกรรมที่ถูกกำหนดไว้ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้เคซีน
เป็นสารตั้งต้นโดยวิธีการ Homaei นี้ (Homaei et al, 2014.
2010; & Homaei Etemadipour, 2015) หนึ่งหน่วยของโปรติเอสถูก
กำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ไฮโดรไลซ์เคซีนในการผลิต
การดูดกลืนแสงเทียบเท่ากับ 1 lmol ของซายน์ / นาทีกับซายน์
เป็นมาตรฐาน โปรตีนเข้มข้นเป็นที่คาดกันโดย
แบรดฟอวิธี (แบรด, 1968) โดยใช้ซีรั่มอัลบูมิวัว
เป็นมาตรฐาน