serum and antibodiesWe used sera fr

serum and antibodies
We used sera from 12 wild individuals from each of the following bird species: Pied Flycatcher Ficedula hypoleuca Pallas (adults), Blue Tit Parus caeruleus L. (adults and nestlings), Grey Shrike Lanius meridionalis Temminck (adults), Red-Backed Shrike Lanius collurio L. (adults), Little Owl Athene noctua Scopoli (adults) and European Kestrel Falco tinnunculus L. (adults and nestlings). The antibody to detect immunoglobulins from the above species was a polyclonal rabbit antichicken IgG conjugated with peroxidase (Sigma A-9046, St Louis, MO, USA). This antibody recognizes the whole molecule.

sds-page
SDS-PAGE was carried out under denaturing conditions (2-β-mercaptoethanol) using a discontinuous buffer system (Laemmli 1970). Serum proteins (3 µl of serum at 1/10 dilution) were separated on polyacrylamide gels containing a stacking gel of 4% and a running gel of 10%. Electrophoretic buffer (25 mm Tris, 196 mm glycine and 0·1% SDS) and running conditions were according to recommendations of Bio-Rad (200 V; see Mini Protean III instructions) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Once we had finished the electrophoresis, gels were covered with a staining solution (Coomassie Brilliant Blue R250 at 0·1% w/v in 40% methanol plus 10% acetic acid) for 1 h at room temperature on a shaker. Destaining of gels was made with 40% methanol plus 10% acetic acid on a shaker until a good contrast was obtained. Lastly, gels were scanned and protein bands quantified using 1D image analysis software (Scion Image for Windows, Scion Corporation, Frederick, MD, USA).

n-page (native page)
Native electrophoresis was carried out according to recommendations of Bio-Rad (see Mini Protean III instructions). Basically, the differences with SDS-PAGE were the following: (i) preparation of samples without 2-β-mercaptoethanol and SDS (ii) use of 6% running gels without stacking gel and (iii) electrophoretic buffer without SDS. The process to stain and analyse the polyacrylamide gels was the same as in the SDS-PAGE.

western blotting
Serum proteins were prepared for SDS-PAGE under denaturing conditions. Proteins (3 µl of serum at 1/10 dilution) were separated on polyacrylamide gels containing a stacking gel of 4% and a running gel of 10% (Laemmli 1970) and transferred to Immobilon-P (polyvinylidene difluoride (PVDF) millipore) membranes (transfer buffer: 12·5 mm Tris, 98 mm glycine and 10% methanol; transfer conditions: 150 V for 1·5 h at 4 °C). Unstained markers for molecular weight from Sigma (references SDS-7 and SDS-6H) were included in all gels. After transference the PVDF membrane was stained with Red Ponceau 0·1% (diluted in 0·1% acetic acid) with the aim of separating the lanes containing the molecular weight markers. Then, transfer membranes without molecular weights were washed with 150 mm phosphate-buffered saline, pH 7·2 plus 0·05% Tween 20 (PBS-T) and incubated in blocking buffer (PBS-T plus 5% non-fat dry milk; Nestlé, Vevey, Switzerland). Later, blots were incubated with antichicken IgG conjugated with peroxidase (1/5000 dilution) diluted in PBS-T. Positive bands were detected by incubation with a developer solution (0·06% 3,3′-diaminobenzidine plus H2O2 at 1/1000 dilution). The incubation period for blocking buffer and antichicken antibodies was 1 h and 2 h at room temperature, respectively. Three washes (5 min) with PBS-T were performed after each step. Once the process was finished, blots were dried and the markers were once again bound to the membrane containing the immunoreactive bands in order to determine the apparent molecular weight of the bands. As the colour of the markers is usually very light, we painted the base of each marker before scanning the membrane. Later, we substituted the painted markers with lines. This procedure is nowadays a standard one. Lastly, blots were dried and immediately scanned. Protein bands were quantified using 1D image analysis software (Scion Image for Windows, Scion Corporation). Immunoreactivity was measured as optical density × area of the peaks (see Fig. 1c).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซรั่มและแอนตี้เราใช้นโยบายจากบุคคล 12 ป่าจากแต่ละพันธุ์นกดังต่อไปนี้: นก Flycatcher Ficedula hypoleuca พัลลัส (ผู้ใหญ่), บลู Tit คอมเพล็กซ์ปารัส caeruleus L. (ผู้ใหญ่และ nestlings), สีเทานกอีเสือ Lanius meridionalis Temminck (ผู้ใหญ่), Red-Backed นกอีเสือ Lanius collurio L. (ผู้ใหญ่), นกฮูกน้อย Athene noctua Scopoli (ผู้ใหญ่) และยุโรป Kestrel Falco tinnunculus L. (ผู้ใหญ่และ nestlings) แอนติบอดีตรวจ immunoglobulins จากสายพันธุ์ข้างต้นถูก antichicken กระต่าย polyclonal กลวง IgG มี peroxidase (ซิก A-9046, St Louis, MO สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีนี้รู้จักโมเลกุลทั้งหมดsds-หน้าSDS-หน้าที่ดำเนินภายใต้ denaturing เงื่อนไข (2-β-mercaptoethanol) โดยใช้ระบบบัฟเฟอร์ที่ไม่ต่อเนื่อง (Laemmli 1970) โปรตีนเซรั่ม (3 µl ของซีรั่มที่เจือจาง 1/10) ถูกแยกจากกันใน polyacrylamide gels เจซ้อน 4% และเจทำงาน 10% ด้วยบัฟเฟอร์ (25 มม.ตรี 196 มม. glycine และ 0·1% SDS) และสภาพการทำงานได้ตามคำแนะนำของไบโอราษฎร์ (200 V ดูคำแนะนำมินิ Protean III) (Bio Rad เฮอร์คิวลิส CA, USA) เมื่อเราได้เสร็จสิ้นการ electrophoresis เจถูกปกคลุม ด้วยโซลูชัน staining (Coomassie Brilliant Blue R250 ที่ 0·1% w/v ใน 40% เมทานอลบวก 10% กรดน้ำส้ม) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องในการเชคเกอร์ Destaining ของเจทำ ด้วย 40% เมทานอลบวก 10% กรดอะซิติกในการเชคเกอร์จนได้รับความคมชัดดี สุดท้าย เจถูกสแกน และแถบโปรตีน quantified โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ 1D (ไซออนรูปภาพสำหรับ Windows บริษัทไซออน เฟรเดอริก MD สหรัฐอเมริกา)หน้า n (เจ้าหน้า)Electrophoresis เป็นถูกดำเนินการตามข้อเสนอแนะของ Bio Rad (ดูคำแนะนำมินิ Protean III) ทั่วไป ความแตกต่างกับ SDS หน้าได้ต่อไปนี้: (i) การเตรียมตัวอย่างโดยใช้ SDS (ii) 6% เจไม่เจซ้อนและ (iii) ด้วยบัฟเฟอร์ โดย SDS และ 2-β-mercaptoethanol การติด และวิเคราะห์การ polyacrylamide gels เป็นเดียวกันกับหน้า SDSblotting วิธีตะวันตกSerum proteins were prepared for SDS-PAGE under denaturing conditions. Proteins (3 µl of serum at 1/10 dilution) were separated on polyacrylamide gels containing a stacking gel of 4% and a running gel of 10% (Laemmli 1970) and transferred to Immobilon-P (polyvinylidene difluoride (PVDF) millipore) membranes (transfer buffer: 12·5 mm Tris, 98 mm glycine and 10% methanol; transfer conditions: 150 V for 1·5 h at 4 °C). Unstained markers for molecular weight from Sigma (references SDS-7 and SDS-6H) were included in all gels. After transference the PVDF membrane was stained with Red Ponceau 0·1% (diluted in 0·1% acetic acid) with the aim of separating the lanes containing the molecular weight markers. Then, transfer membranes without molecular weights were washed with 150 mm phosphate-buffered saline, pH 7·2 plus 0·05% Tween 20 (PBS-T) and incubated in blocking buffer (PBS-T plus 5% non-fat dry milk; Nestlé, Vevey, Switzerland). Later, blots were incubated with antichicken IgG conjugated with peroxidase (1/5000 dilution) diluted in PBS-T. Positive bands were detected by incubation with a developer solution (0·06% 3,3′-diaminobenzidine plus H2O2 at 1/1000 dilution). The incubation period for blocking buffer and antichicken antibodies was 1 h and 2 h at room temperature, respectively. Three washes (5 min) with PBS-T were performed after each step. Once the process was finished, blots were dried and the markers were once again bound to the membrane containing the immunoreactive bands in order to determine the apparent molecular weight of the bands. As the colour of the markers is usually very light, we painted the base of each marker before scanning the membrane. Later, we substituted the painted markers with lines. This procedure is nowadays a standard one. Lastly, blots were dried and immediately scanned. Protein bands were quantified using 1D image analysis software (Scion Image for Windows, Scion Corporation). Immunoreactivity was measured as optical density × area of the peaks (see Fig. 1c).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ซีรั่มและแอนติบอดี
เราใช้ซีรั่มจาก 12 บุคคลที่ป่าจากแต่ละนกชนิดต่อไปนี้: ลายพร้อยแซว Ficedula hypoleuca พาลา (ผู้ใหญ่), สีฟ้าหัวนม Parus caeruleus ลิตร (ผู้ใหญ่และรัง), สีเทาเฉี่ยวเนียส meridionalis Temminck (ผู้ใหญ่), สีแดง ถอยเฉี่ยวเนียส collurio ลิตร (ผู้ใหญ่), ลิตเติ้ลอะธีนนกฮูก Noctua Scopoli (ผู้ใหญ่) และยุโรปชวา Falco tinnunculus ลิตร (ผู้ใหญ่และรัง) แอนติบอดีเพื่อตรวจหาภูมิคุ้มกันบกพร่องจากสายพันธุ์ดังกล่าวข้างต้นเป็นกระต่ายโพลี antichicken IgG ผันกับ peroxidase (Sigma-9046, St Louis, MO, USA) แอนติบอดีนี้ตระหนักถึงโมเลกุลทั้ง. SDS หน้าSDS-PAGE ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไข denaturing (2-β-mercaptoethanol) โดยใช้ระบบบัฟเฟอร์ไม่ต่อเนื่อง (Laemmli 1970) โปรตีนเซรั่ม (3 ไมโครลิตรของซีรั่มที่ 1/10 เจือจาง) ถูกแยกออกในเจลอะคริเลตที่มีเจลซ้อน 4% และเจลที่ทำงาน 10% บัฟเฟอร์ Electrophoretic (25 มมทริส 196 มม Glycine และ 0 · 1% SDS) และทำงานตามเงื่อนไขที่เป็นไปตามคำแนะนำของ Bio-Rad (200 V ดูคำแนะนำมินิ Protean III) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) เมื่อเราได้เสร็จสิ้นการ electrophoresis เจลถูกปกคลุมไปด้วยสารละลายสีย้อม (Coomassie สีฟ้าสดใส R250 ที่ 0 · 1% w / v ในเมทานอล 40% บวก 10% กรดอะซิติก) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในเครื่องปั่น Destaining ของเจลถูกสร้างขึ้นมาด้วยเมทานอล 40% บวก 10% กรดอะซิติกในเครื่องปั่นจนคมชัดที่ดีที่ได้รับ สุดท้ายเจลถูกสแกนและวงดนตรีโปรตีนปริมาณการใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ภาพ 1D (ภาพการปลูกถ่ายอวัยวะสำหรับ Windows, การปลูกถ่ายอวัยวะคอร์ปอเรชั่นเฟรเดอริ, MD, USA). n หน้า (หน้าพื้นเมือง) อิพื้นเมืองได้รับการดำเนินการตามคำแนะนำของ Bio-Rad ( ดูคำแนะนำมินิ Protean III) โดยทั่วไปความแตกต่างของระบบ SDS-PAGE มีดังต่อไปนี้: (i) การเตรียมความพร้อมของกลุ่มตัวอย่างโดยไม่ต้อง 2-β-mercaptoethanol และ SDS (ii) การใช้เจล 6% ในการทำงานโดยไม่ต้องซ้อนเจลและ (iii) บัฟเฟอร์ electrophoretic โดยไม่ต้อง SDS กระบวนการในการเปื้อนและวิเคราะห์เจลอะคริเลตเป็นเช่นเดียวกับใน SDS-PAGE. ตะวันตกซับโปรตีนเซรั่มที่ถูกจัดเตรียมไว้สำหรับ SDS-PAGE ภายใต้เงื่อนไข denaturing โปรตีน (3 ไมโครลิตรของซีรั่มที่ 1/10 เจือจาง) ถูกแยกออกในเจลอะคริเลตที่มีเจลซ้อน 4% และเจลที่ทำงาน 10% (Laemmli 1970) และย้ายไป Immobilon-P (Polyvinylidene difluoride (PVDF) ค) เยื่อ (บัฟเฟอร์โอน: 12 · 5 มม Tris, 98 มิลลิเมตรไกลซีนและเมทานอล 10%; เงื่อนไขการโอน: 150 V 1 · 5 ชั่วโมงที่ 4 ° C) เครื่องหมายไม่มีรอยเปื้อนสำหรับน้ำหนักโมเลกุลจาก Sigma (อ้างอิง SDS-7 และ SDS-6H) ถูกรวมอยู่ในเจลทั้งหมด หลังจากโอนเมมเบรน PVDF ถูกย้อมด้วยสีแดง Ponceau 0 · 1% (ปรับลดใน 0 · 1% กรดอะซิติก) โดยมีจุดมุ่งหมายในการแยกช่องที่มีเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล จากนั้นเยื่อโอนโดยไม่ต้องน้ำหนักโมเลกุลถูกล้างด้วยน้ำเกลือขนาด 150 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7 · 2 บวก 0 · 05% Tween 20 (PBS-T) และบ่มในการป้องกันบัฟเฟอร์ (PBS-T บวก 5% นมไม่มีไขมันแห้ง ; เนสท์เล่เวเวย์, วิตเซอร์แลนด์) ต่อมา blots ถูกบ่มกับ IgG antichicken ผันกับ peroxidase (1/5000 เจือจาง) เจือจางในพีบีเอส-T วงบวกถูกตรวจพบโดยการบ่มด้วยการแก้ปัญหาการพัฒนา (0 · 06% 3,3'-Diaminobenzidine บวก H2O2 ที่ 1/1000 เจือจาง) ระยะฟักตัวสำหรับการปิดกั้นกันชนและแอนติบอดี antichicken เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องตามลำดับ สามล้าง (5 นาที) กับพีบีเอส-T ได้ดำเนินการหลังจากที่แต่ละขั้นตอน เมื่อกระบวนการเสร็จ blots แห้งและเครื่องหมายถูกผูกไว้อีกครั้งเพื่อเมมเบรนที่มีวง immunoreactive เพื่อกำหนดน้ำหนักโมเลกุลที่ชัดเจนของวง เป็นสีของเครื่องหมายมักจะเบามากเราทาสีฐานของแต่ละเครื่องหมายก่อนที่จะสแกนเมมเบรน ต่อมาเราแทนเครื่องหมายทาสีที่มีเส้น ขั้นตอนนี้เป็นปัจจุบันมาตรฐานหนึ่ง สุดท้าย blots แห้งและสแกนได้ทันที แถบโปรตีนถูกวัดโดยใช้ซอฟแวร์การวิเคราะห์ภาพ 1D (ภาพการปลูกถ่ายอวัยวะสำหรับ Windows, การปลูกถ่ายอวัยวะคอร์ปอเรชั่น) ภูมิคุ้มกันจะวัดความหนาแน่นของแสงบริเวณ×ของยอดเขา (ดูรูป. 1c)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราใช้เซรั่มและแอนติบอดี
( 12 บุคคลป่าจากแต่ละชนิดของนก นกพายด์ต่อไปนี้ : ficedula hypoleuca Pallas ( ผู้ใหญ่ ) และสีฟ้า ( 2 ) caeruleus ลิตร ( ผู้ใหญ่และน Nestlings ) เสือเทาเลนีอิส meridionalis ท์ ( ผู้ใหญ่ ) แดงถอยเสือเลนีอิส collurio L . ( ผู้ใหญ่ ) , น้อย ( noctua scopoli ธินี นกฮูก ผู้ใหญ่ ) และยุโรป Kestrel Falco tinnunculus L( ผู้ใหญ่และน Nestlings ) แอนติบอดีเพื่อตรวจหามมูโนโกลบูลินมาจากสายพันธุ์ข้างต้นถูกใช้กระต่าย antichicken IgG conjugated กับเปอร์ออกซิเดส ( Sigma a-9046 , เซนต์ หลุยส์ โม สหรัฐอเมริกา ) แอนติบอดีกลุ่มนี้โมเลกุลทั้งหน้า

SDS เอนไซม์ที่ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขี่ ( 2 - บีตา - mercaptoethanol ) โดยใช้ระบบบัฟเฟอร์แบบไม่ต่อเนื่อง ( laemmli 1970 )ซีรั่มโปรตีน ( 3 µผม เซรั่ม ที่ 1 / 10 ( ) เป็นโพลีอะคริลาไมด์เจล บรรจุแยกในซ้อนเจล 4 % และใช้เจลของ 10% คารีบัฟเฟอร์ ( 25 มม. นอกจากนี้ 196 มม. ไกลซีนและ 0 ด้วย 1% SDS ) และใช้เงื่อนไขตามข้อเสนอแนะของไบโอ ราด ( 200 V ; ดูคําแนะนําขนาดเล็กซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก 3 ) ( ไบโอ ราด , Hercules , CA , USA ) เมื่อเราได้เสร็จสิ้นการอิเล็กเจลที่ถูกปกคลุมด้วยคราบ โซลูชั่น ( Brilliant Blue r250 เหล่านี้น่าจะเป็นที่ 0 ด้วย 1% w / v ในบวก 10% 40% เมทานอลกรดอะซิติก ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้องในเครื่องปั่น . destaining เจลทำจาก 40% เมทานอลบวก 10% กรดในเครื่องปั่นจนความคมชัดที่ดีได้ . ท้ายนี้ เจล ทำการสแกนแถบโปรตีนและปริมาณการใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ภาพ 1D ( ไซออนภาพสำหรับหน้าต่างไซออน Corporation , Frederick , MD , USA )

n-page เพจ ( พื้นเมือง )
พื้นเมือง electrophoresis ได้ดำเนินการตามข้อเสนอแนะของ ไบโอ ราด ( ดูคำสั่งขนาดเล็กซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก 3 ) โดยทั่วไป แตกต่างกับการศึกษาเป็นต่อไปนี้ : ( i ) การเตรียมตัวอย่างโดย 2 - บีตา - mercaptoethanol SDS ( II ) และใช้ 6 % ใช้เจลเจลโดยไม่ต้องซ้อนและ ( 3 ) รูปแบบบัฟเฟอร์โดยเฉพาะ .กระบวนการย้อมและวิเคราะห์สารเจลเป็นเช่นเดียวกับในการศึกษา .

Western blotting
เซรั่มโปรตีนเอนไซม์ที่เตรียมสำหรับการเหนี่เงื่อนไขโปรตีน ( 3 µผม เซรั่ม ที่ 1 / 10 ( ) เป็นโพลีอะคริลาไมด์เจล บรรจุแยกในซ้อนเจล 4 % และใช้เจล 10% ( laemmli 1970 ) และย้ายไป immobilon-p ( ีนไดฟลูออไรด์ ( PVDF ) มิลลิ ) เมมเบรน ( โอนบัฟเฟอร์ : 12 ด้วย 5 มม. โดย 98 ไกลซีนและ 10 มม. % เมทานอล ; เงื่อนไขการโอนเงิน : 150 V 1 ด้วย 5 H ที่ 4 ° C )เครื่องหมายไม่มีรอยเปื้อนสำหรับน้ำหนักโมเลกุลจาก Sigma ( อ้างอิง sds-7 และ sds-6h ) ถูกรวมอยู่ในเจล หลังจากการโอน Pvdf เยื่อเปื้อนสีแดงใน 0 ด้วย 1% ( เจือจางใน 0 ด้วย 1% กรดอะซิติก ) กับจุดมุ่งหมายของการแบ่งเลนที่มีเครื่องหมายโมเลกุล . งั้นก็โอนเยื่อโดยไม่ต้องมีน้ำหนักโมเลกุลถูกล้างด้วยเกลือฟอสเฟต 150 มม. 2 ,พีเอช 7 2 บวกด้วย 0 ด้วย 05 tween 20 ( pbs-t ) บ่มในบล็อกบัฟเฟอร์ ( pbs-t บวก 5% ไม่อ้วนแห้งนม เนสท์เล่เวเวย์ , สวิตเซอร์แลนด์ ) ต่อมา ไม้ถูกบ่มกับ antichicken IgG conjugated กับเปอร์ออกซิเดส ( 1 / 5000 เจือจาง ) เจือจางใน pbs-t. บวกวงถูกตรวจพบโดยการบ่มด้วยวิธีพัฒนา ( 0 ด้วย 06 % สำหรับ H2O2 ที่ได้รับ - diaminobenzidine บวก 1 / 1000 เจือจาง )ระยะฟักตัวบล็อกบัฟเฟอร์ และ antichicken แอนติบอดีเป็น 1 ชั่วโมง และ 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง 3 ล้าง ( 5 นาที ) pbs-t แสดงหลังจากที่แต่ละขั้นตอน เมื่อกระบวนการเสร็จ ไม้แห้ง และเครื่องหมายอีกครั้งผูกพันกับเมมเบรนที่มีวง immunoreactive เพื่อหาน้ำหนักโมเลกุลปรากฏในแถบเป็นสีของเครื่องหมายมักจะเบามาก เราทาสีที่ฐานของแต่ละเครื่องหมายก่อนการสแกนเมมเบรน ต่อมาเราแทนทาสีเครื่องหมายกับเส้น ขั้นตอนนี้เป็นปัจจุบันเป็นมาตรฐานเดียว สุดท้าย ไม้แห้ง และทันทีที่สแกน แถบโปรตีน quantified ใช้ 1D ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ภาพ ( ไซออนรูปภาพสำหรับ บริษัท ไซออน )การได้เป็นซิกแซ็ก×พื้นที่หุบ ( ดูในรูป )