2.4. RNA extraction and semiquantit

2.4. RNA extraction and semiquantitative RT-PCRTotal RNA was extracted from oocytes, granulosa and thecapreparation using Nucleospin RNA II according to the manufacturer’s instructions. Total RNA was quantified by absorbance at 260 nm Total RNA (2 lg) was reverse transcribed with Ready-to-Go You Prime First-Strands Beads . STC 1 cDNA
was PCR co-amplified with porcine b-actin (pACT) using two different primer pairs
for the target genes. The constitutive pACT gene was used as an internal positivecontrol to normalize the products of the amplification reaction. For STC 1, the sense primer (50 -TGATCAGTGCTTCTGCAACC-30 ) and antisense primer (50 -TCACAGTCCAGTAGGCTTCG-30 ) were derived from the bovine STC 1 mRNA coding sequence).Variability in mRNA amounts was assessed by amplifying swine
actin using the primers pACT sense (50 -GAG ACC TTC AAC ACGCCG-30 ) and pACT antisense (50 -GGA AGG TGG ACA GCG AGG-30 ). An aliquot (5 ll) of the cDNA template was amplified by PCR using 1 ll (25 mU) Taq polymerase(Fermentas, Hannover, MD, USA) in 50 ll PCR buffer containing 1 ll of 10 mM dNTP mix (Fermentas), 0.3 lM for both pACT primers and 0.7 lM for both STC 1 primers. Amplification was carried out using the thermal cycler PTC-100 Peltier (MJ Research, . After an initial denaturation step for 5 min at 95 °C, target cDNA was amplified for 2 cycles with a denaturation step at 95 °C for 30 s, annealing at 57 °C for 30 s (À1 °C in the second cycle), elongation at 72 °C for 30 s, and for 30 cycles with a
denaturation step at 95 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s, elongation at 72 °C for 30 s. Reactions were terminated with a final elongation at 72 °C for 15 min. The PCR products were separatedon 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide (0.5 lg/ml)and visualized under UV light. Digital images were captured by Power Shot A610 (Canon, Tokyo, Japan). Quantification of band intensity was performed with NIH Image software Scion ImageBeta 4.02 . Target gene mRNA abundance was expressed relativeto pACT mRNA abundance. Semiquantitative PCR was validated by

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 แยกอาร์เอ็นเอและอาร์เอ็นเอ RT PCRTotal semiquantitative ถูกสกัดจากแช่สารละลาย granulosa และ thecapreparation II Nucleospin อาร์เอ็นเอโดยใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูก quantified โดย absorbance ที่ 260 nm รวมอาร์เอ็นเอ (2 lg) ถูกย้อนทับศัพท์ ด้วยพร้อมกับไปคุณนายกก่อน-Strands ลูกปัด STC 1 cDNAamplified บริษัท PCR กับช่วง b-แอกติน (สนธิสัญญา) ใช้สองคู่รองพื้นแตกต่างกันหรือไม่สำหรับยีนเป้าหมาย ยีนสนธิสัญญาขึ้นใช้เป็น positivecontrol การภายในเพื่อลดขนาดผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา amplification สำหรับ STC 1 รองพื้นรู้สึก (50 - TGATCAGTGCTTCTGCAACC-30) และ antisense พื้น (50 - TCACAGTCCAGTAGGCTTCG-30) ได้มาจาก mRNA STC 1 วัวที่กำหนดลำดับ) สำหรับความผันผวนในปริมาณ mRNA ถูกประเมิน โดยมือสุกรใช้ความรู้สึกสัญญาไพรเมอร์แอกติน (50 - แก๊กบัญชีทีทีซีจำกัด AAC ACGCCG-30) และ antisense สนธิสัญญา (50 - GGA AGG TGG ACA GCG AGG-30) ส่วนลงตัว (5 จะ) ของแม่ cDNA ถูก amplified โดยใช้ 1 ll (25 หมู่) Taq พอลิเมอเรส (Fermentas ฮันโนเวอร์ MD สหรัฐอเมริกา) ในบัฟเฟอร์ PCR จะ 50 PCR ประกอบด้วย 1 จะ 10 มม. dNTP ผสม (Fermentas), 0.3 lM สำหรับไพรเมอร์ของสนธิสัญญาและ 0.7 lM สำหรับไพรเมอร์ STC 1 ทั้ง Amplification ถูกดำเนิน cycler ร้อน Peltier PTC-100 (MJ วิจัย การใช้ หลังจากการเริ่มต้น denaturation ขั้นตอนสำหรับ 5 นาทีที่ 95 ° C, cDNA เป้าหมายถูก amplified สำหรับรอบ 2 มีขั้นตอน denaturation ที่ 95 ° C สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 57 ° C สำหรับ 30 s (À1 ° C ในรอบที่สอง) elongation ที่ 72 ° C สำหรับ 30 s และ สำหรับ 30 รอบกับการขั้นตอน denaturation ที่ 95 ° C สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 55 ° C สำหรับ 30 s, elongation ที่ 72 ° C สำหรับปฏิกิริยา 30 s ได้ถูกหยุดลง ด้วย elongation final ที่ 72 ° C สำหรับ 15 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR separatedon 1.5% agarose เจลสีกับโบรไมด์ ethidium (0.5 lg/ml) และ visualized ภายใต้แสง UV ได้ รวมภาพดิจิตอล โดย A610 ยิงพลังงาน (แคนนอน โตเกียว ญี่ปุ่น) Quantification ของความเข้มของแถบทำ ด้วยซอฟต์แวร์ภาพ NIH 4.02 ImageBeta ไซออน อุดมสมบูรณ์ mRNA ของยีนเป้าหมาย relativeto แสดงสนธิสัญญา mRNA ที่อุดมสมบูรณ์ Semiquantitative PCR ถูกตรวจสอบโดย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การสกัดอาร์เอ็นเอและเชิงกึ่งปริมาณ RT-PCRTotal RNA ถูกสกัดจากเซลล์ไข่, granulosa และ thecapreparation ใช้ Nucleospin อาร์เอ็นเอที่สองตามคำแนะนำของผู้ผลิต รวมอาร์เอ็นเอเป็นสาย quanti ed โดยการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรรวมอาร์เอ็นเอ (2 จี) ได้รับการถ่ายทอดกลับมีพร้อมไปคุณนายกแรก Strands ลูกปัด เอสทีซี 1
ยีนเป็นPCR ร่วม ampli เอ็ด Fi สำหรับสุกรขโปรตีน (สัญญา)
โดยใช้สองคู่ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันสำหรับยีนเป้าหมาย ยีนสนธิสัญญาส่วนประกอบใช้เป็น positivecontrol ภายในปกติผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาไฟ ampli ไอออนบวก สำหรับเอสทีซี 1, ไพรเมอร์ความรู้สึก (50 -TGATCAGTGCTTCTGCAACC-30) และไพรเมอร์ antisense (50 -TCACAGTCCAGTAGGCTTCG-30) ได้รับมาจากเอสทีซีวัว 1 mRNA เข้ารหัสลำดับ) .Variability ในปริมาณ mRNA
ได้รับการประเมินโดยขยายหมูโปรตีนโดยใช้ไพรเมอร์สนธิสัญญาความรู้สึก (50 -GAG แม็ก TTC ACGCCG AAC-30) และสนธิสัญญา antisense (50 -GGA AGG TGG ACA GCG AGG-30) หาร (5 LL) แม่แบบยีนเป็นสาย ampli ed โดยวิธี PCR โดยใช้ 1 LL (25 MU) โพลิเมอร์ Taq (Fermentas ฮันโนเวอร์, MD, USA) ใน 50 LL บัฟเฟอร์ PCR ที่มี 1 LL 10 มิลลิผสม dNTP (Fermentas) 0.3 LM ทั้งสนธิสัญญาและไพรเมอร์ 0.7 LM ทั้งเอสทีซี 1 ไพรเมอร์ ไอออนบวกสาย Ampli ได้ดำเนินการโดยใช้ Cycler ความร้อน PTC-100 Peltier (MJ วิจัย. หลังจากขั้นตอน denaturation เริ่มต้นสำหรับ 5 นาทีที่ 95 ° C เป้าหมายยีนเป็นเอ็ดสาย ampli สำหรับ 2 รอบด้วยขั้นตอน denaturation ที่ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, การหลอม ที่ 57 ° C เป็นเวลา 30 วินาที (A1 ° C ในรอบที่สอง) การยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 30
รอบที่มีขั้นตอนdenaturation ที่ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาที การยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที. ปฏิกิริยาถูกยกเลิกด้วยการยืดสายเอ็นที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที. ผลิตภัณฑ์ PCR เป็น separatedon 1.5% เจล agarose ย้อมด้วยสีโบรไมด์ ethidium (0.5 LG / ml) และมองเห็นภายใต้แสงยูวี ภาพดิจิตอลถูกจับโดย Power Shot A610 (Canon, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น). Quanti ไอออนไฟของความเข้มวงได้ดำเนินการกับซอฟแวร์ภาพ NIH ปลูกถ่ายอวัยวะ ImageBeta 4.02. อุดมสมบูรณ์ mRNA ของยีนเป้าหมายได้แสดงออก relativeto อุดมสมบูรณ์สนธิสัญญา mRNA. เชิงกึ่งปริมาณ PCR ได้รับการตรวจสอบโดย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การสกัดอาร์เอ็นเอและบริโภค RT pcrtotal RNA คือ สารสกัดจากธรรมชาติ และการใช้เซลล์ thecapreparation nucleospin อาร์เอ็นเอ 2 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกการไฟฟ้าโดยการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร ) จึงรวม RNA ( 2 ) ) คือ ย้อนกลับ และพร้อมที่จะไป คุณท่านแรกถักลูกปัด ที่ STC cDNA
1คือเทคนิค Co ampli จึงเอ็ดกับเลือดหมู b-actin ( สัญญา ) โดยใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันสองคู่
สำหรับเป้าหมายยีน ยีนสนธิสัญญาและถูกใช้เป็น positivecontrol ภายในเพื่อให้ผลิตภัณฑ์ของ ampli ไอออนบวกจึงเกิดปฏิกิริยา ที่ STC 1 ความรู้สึก ไพรเมอร์ ( 50 - tgatcagtgcttctgcaacc-30 ) และ antisense รองพื้น ( 50 - tcacagtccagtaggcttcg-30 ) ได้มาจากวัวที่ STC 1 mRNA ลำดับนะครับ )ความแปรปรวนของปริมาณที่ประเมินโดยใช้ไพรเมอร์ actin amplifying สุกร
สัญญาความรู้สึก ( 50 - บัญชี บริษัท ทีทีซี acgccg-30 ( AAC ) และสนธิสัญญา antisense ( 50 - ก๊ะ agg tgg ACA gcg agg-30 ) เป็นส่วนลงตัว ( 5 จะ ) ของดีเอ็นเอแม่แบบคือ ampli จึงเอ็ดโดยวิธี PCR โดยใช้ 1 จะ ( 25 มม. ) ใช้แท็ก ( fermentas ฮันโนเวอร์ , MD , USA ) ในปี 50 จะสามารถบัฟเฟอร์ที่มี 1 จะผสม dntp 10 มม. ( fermentas ) 0โดยทั้ง 3 สัญญาชนิด 0.7 LM ทั้ง STC 1 รองพื้น การ ampli จึงได้ดําเนินการโดยใช้ความร้อนรอบ ptc-100 Peltier ( วิจัย , MJ หลังจากเริ่มต้น ( ขั้นตอนที่ 5 นาทีที่ 95 องศา C , ยีนเป้าหมาย ampli จึงม 2 รอบด้วย ( ขั้นตอนที่ 95 องศา C เป็นเวลา 30 วินาที annealing ที่ 57 องศา C เป็นเวลา 30 วินาที ( À 1 ° C ในรอบสอง ) ความยาว 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที และ 30 รอบด้วย
( ขั้นตอนที่ 95 องศา C 30 S , อบอ่อนที่อุณหภูมิ 55 องศา C 30 S ความยาว 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ปฏิกิริยาสิ้นสุดลงด้วยการยืดตัวที่ 72 ° C จึงนาล เป็นเวลา 15 นาที ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูก separatedon 1.5 % เจลเปื้อนทิเดียมโบรไมด์ ( 0.5 LG / มิลลิลิตร ) และมองเห็นภายใต้ แสงยูวี ภาพดิจิตอลที่ถูกจับโดยพลังงานยิง a610 ( Canon , โตเกียว , ญี่ปุ่น )การไฟฟ้าจึงบวกความเข้มแสดงกับวงศัพท์ไซออนซอฟต์แวร์ภาพ imagebeta 4.02 . ยีน mRNA เป้าหมายมากมายแสดง relativeto สนธิสัญญาของความอุดมสมบูรณ์ บริโภคโดยผ่านการพิจารณา