[0079] The extract separating into

[0079] The extract separating into oil layer and water layer was placed in a separating funnel. The water layer was recovered in a beaker, and filtered
10 Using a separating funnel the water layer was separated. The crystalline material was
then separated from the water using a Nutche suction filter (51.1m, Sansyou Corporation) overlaid a filter paper (Advantec Toyo Co. Ltd., No 2) under low pressure (8kPa vs
Absolute pressure) and then crystal is obtained on the filter paper. The wet filter paper was rinsed with water to remove remaining fat then the crystal was dried under reduced
15 pressure (vacuum-constant temperature dryer, Advantec Toyo Co. Ltd.) at 60°C. 1.0g
of the รงควัตถุสีแดง of ปาล์มใบเลื่อย was obtained.

Example 2
[0080 ]1. Measurement of the anti-angiogenic activity of purified รงควัตถุสีแดง obtains
20 from ปาล์มใบเลื่อย.
Following biological test results were conducted by Ricerca Bioscience, LLC
(http://www.Ricerca.com.) under a contract (Assay#368000, Tumor, การสร้างหลอดเลือดใหม่,
การประกอบขึ้นของหลอด) with the รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example 1.
[0081] Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) differentiate to capillary-like 25 structures and form vessel network on Matrigel in the presence of endothelial cell
growth supplements. The anti-angiogenic activity of a test compound can be assessed
by observing continuity of vessel network compared with untreated control. Test
compound (crystallized รงควัตถุสีแดง prepared in Example 3) was tested for an effect on
anti-การสร้างหลอดเลือดใหม่ at five final concentrations of 100, 10, 1, 0.1 and 0.01m/mL.
30 [0082] 2. Preparation of a test compound (รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in
Example 1)
The รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example 1 was dissolved in 100%
dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted with sterile distilled water to obtain
สารละลายs of 1, 10, 100, 1000 and 100004mL in 40% DMSO. The สารละลายs were
35 diluted 100-fold with culture medium to generate final concentrations of 0.01, 0.1, 1, 10
and 100m/mL.

[0083] 3. Culture method of Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)
HUVEC was purchased from American Type Culture Collection (ATCC
CRL-1730). HUVEC cells were incubated in 5% CO2 atmosphere of at 37°C. The
culture medium used was Endothelial Cell Growth Medium supplemented with 10v/v% 5 fetal bovine serum and 1% antifungal antibiotic.
[0084] 4 Reagents: antifungal antibiotic (GIBCO BRL, USA), dimethylsulfoxide
(Merck, Germany), endothelial cell growth medium (CELL APPLICATIONS, USA), fetal bovine serum (HyClone, USA), Matrigel matrix (BD Biosciences, USA) and ซูรามิน (Sigma, USA).
10 [0085] 5. Devices and Apparatus
96-microwell culture plate (NUNC, USA), Centrifuge 5810R (Eppendorf, Germany), Digital camera (Nikon, Japan), Hematocytometer (Hausser Scientific Horsham, USA), Inverted microscope CK-40 (Olympus, Japan), System microscope E-400 (Nikon, Japan) and Biological safety cabinet (NuAire, USA)
15 [0086] 6. Methods
Matrigel matrix was thawed, kept on ice at 4°C and 541 of the matrix was transferred to each well of a 96-microwell culture plate. The plate was incubated at 37°C for at least one hour to allow the matrix สารละลาย to solidify before treatment.
[0087] Aliquots of 2004 of HUVEC suspension (about 1.5 x 104cells/well) were 20 placed in the 96-well matrigel plate. Two microliters per well of test compound
สารละลาย or vehicle (40% DMSO) was then added and incubated at 5% CO2, 37°C for
18 hours (in duplicate). The final concentration of DMSO was 0.4%. The test
compound was evaluated at concentrations of 100, 10, 1, 0.1 and 0.014mL. At the
end of incubation, a tube network formed by endothelial cell in each wells was
25 evaluated by photomicroscopy (magnification of 40x) and photographed. The total
length of tube network was measured from each photograph (Fig. 1).
[0088] The reduction of the total length of tube network in test compound treatment to
the total length of tube network in vehicle treatment control indicates anti-angiogenic
activity. The minimum inhibitory concentration (MIC) and 50% inhibition
30 concentration (IC50) were determined to assess effect of the test substance on
anti-การสร้างหลอดเลือดใหม่.
[0089] Grant,D.S., Kinsella,J.L., Fridman,R., Auerbach,R., Piasecki,B.A., Yamada,Y.,
et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A Chain peptide(SIKVAV) in vitro
and induction of angiogenetic behavior in vivo. J. Cell Physio1.153:614-625, 1992.
35 Belotti,D., Vergani,V., Drudis,T., Borsotti,P., Pitelli,M.R., Viale,G., Giavazzi,R. and
Taraboletti,G. The microtubule-affecting drug paclitaxel has antiangiogeneic activity.


Clin. Cancer Res. 2:1843-1849, 1996.
[0090] 7. Results
รงควัตถุสีแดง แบบผลึก of the การประดิษฐ์นี้ at 100ug/mL exhibited
significant inhibition of การประกอบขึ้นของหลอด relative to the vehicle-treated control. The 5 standard reference reagent, ซูรามิน, also exhibited significant inhibition at 30 and
15RM (Table 2, รูปs 1 and 2). The IC50 value was shown in Table 3.
[0091] Inhibition of การประกอบขึ้นของหลอด of รงควัตถุสีแดง of ผลปาล์มใบเลื่อย
Treatment Assay Name % Inhibition of total tube length (mean±SEM)
Concentrations (tg/mL)
PT#1151525 368000, การสร้างหลอดเลือดใหม่ 100 10 1 0.1 0.01
รงควัตถุสีแดง การประกอบขึ้นของหลอด 80±4ab 19±3 518 813 -217
Concentrations (gg/mL)
368000, การสร้างหลอดเลือดใหม่ 30 15 10 3 1
ซูรามิน การประกอบขึ้นของหลอด 100±0a 42±9'6 8±1 4±5 3±4
a: Significant inhibition of การประกอบขึ้นของหลอด (30%) b: Minimum inhibitory concentration (MIC)
10 Inhibition of the การประกอบขึ้นของหลอด for 70% or more relative to the vehicle-treated control
group indicates significant anti-angiogenic activity.
[0092] Summary of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and IC50
Treatment Assay # Assay Name MIC IC50
PT#1151625

368000
รงควัตถุสีแดง

ซูรามิน 368000


Example 3

Tumor, การสร้างหลอดเลือดใหม่, การประกอบขึ้นของหลอด 100[tg/mL 32}tg/mL


Tumor, การสร้างหลอดเลือดใหม่, การประกอบขึ้นของหลอด 15[M 1611M

15 [0093] A composition containing the รงควัตถุสีแดง from ผลปาล์มใบเลื่อย as the
following formulation was prepared.
Ingredient Blending quantity of cream (%w/w)
Ethinoic extract or รงควัตถุสีแดง from ปาล์มใบเลื่อย 2.0
Olive oil 10.0
Tri (capryl/capric acid) glyceryl 10.0
Tocopherol 1.0
D.W. 77.0
Total 100.0

Example 4
[0094] Measurement of การเพิ่มจำนวน inhibition activity of VEGF-Induced cell of 20 vascular endothelial cells by purified รงควัตถุสีแดง from ปาล์มใบเลื่อย.
Following results of a biological test was conducted by Ricerca Bioscience,
LLC (http://www.Ricerca.com.) with the รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example






-19-



1.
[0095] Test compounds and doses
The test compounds, NYG-1, DS-SMO, SMO and AK were evaluated for a
study of EGF การเพิ่มจำนวน. These compounds were dissolved and diluted in 100% 5 DMSO and concentrations were adjusted to 2.63mg/mL and 26.3mg /mL with DMSO.
The final concentration in the test was given as 1001.1g/mL and 101.1g/mL.
[0096] NYG-1: รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example 1.
DS-SMO: Lipophilic fraction extracted by ethanol from deep sea shark meat SMO: Lipophilic fraction extracted by ethanol from shark meat
10 AK: Concentrated alkoxy glycerol (AKG) of shark liver oil
[0097] Cells and Media
HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) were purchased from
American Type Culture Collection (ATCC CRL-1730). HUVEC cells were incubated
in air atmosphere of 5% CO2 at 37°C. The culture medium used was Endothelial Cell 15 Growth Medium with 10% fetal bovine serum (FBS). The medium for assay was
M199 medium supplemented with 10% FBS and 1 Ottg/mL of Heparin.
[0098] Reagents
Dimethyl sulfoxide (Merck, Germany), Endothelial cell growth medium
(CELL APPLICATIONS, USA), Fetal bovine serum (HyClone, USA), Heparin (Sigma, 20 USA), SU5416 (Calbiochem, USA), VEGF165 (Calbiochem, USA) and HBSS(Gibco,
USA)
[0099] Devices and Apparatus
96-microwell tissue culture plate (N'UNC, USA), Centrifuge CT6D (Hitachi,
Japan), Nucleocounter (ChemoMetec, Denmark), Inverted microscope CK-30
25 (Olympus, Japan) and Biological safety cabinet (NuAire, USA)
[0100] Methods
Aliquots of HUVEC (1.1 x 105 cells/ well) were pre-seeded in the 96-well TC
plate in an incubator at 5% CO2, 37°C. Test compound สารละลาย or vehicle (DMSO)
was then added per well and incubated at 5% CO2, 37°C for 20 minutes. Thereafter, 30 VEGF165 (0.2nM) was added and incubated for 48 hours. 48 hours later, the cells were
washed with HBSS once. Then 511g/mL of the fluorescence reagent, CalceinAM dye
(BD Biosciences, USA) was added and incubated for another 50 minutes. After
incubation, fluorescence intensity was detected by Micro plate reader. More than 50%
of suppression for VEGF165 induced การเพิ่มจำนวน was indicated for the significant
35 antagonistic activity of the test reagent.
[0101] Summary of Methos





-20-



307900 Cell การเพิ่มจำนวน, VEGF-Induced
Target: Human Quantitation Method Spectrofluorimetric quantitation of
cell การเพิ่มจำนวน
Vehicle: 0.4% DMSO Signif. Criteria Ag.: >50% Increase in การเพิ่มจำนวน
relative to VEGF165 respon

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[0079] สกัดแยกชั้นน้ำมันและชั้นน้ำถูกวางลงในกรวยแยก ชั้นน้ำในบีกเกอร์การกู้คืน และกรอง10 ใช้กรวยแยกชั้นน้ำที่แยก วัสดุผลึกได้แล้ว แยกออกจากน้ำที่ใช้ Nutche เป็น ตัวกรองดูด (51.1 m, Sansyou Corporation) overlaid กระดาษกรอง (Advantec โตโย จำกัด ทู) ภายใต้ความดันต่ำ (8kPa vs ความดันสัมบูรณ์) แล้ว การได้รับผลึกในกระดาษกรอง กระดาษกรองเปียกถูก rinsed ด้วยน้ำเพื่อเอาไขมันส่วนที่เหลือ แล้วคริสตัลจะได้แห้งลดลงต่ำกว่าความดัน 15 (ค่าคงสุญญากาศอุณหภูมิเครื่องเป่า Advantec โตโย จำกัด) ที่ 60 องศาเซลเซียส 1.0gของรงควัตถุสีแดงของปาล์มใบเลื่อยได้รับการตัวอย่างที่ 2[0080] 1. ได้รับประเมินกิจกรรม anti angiogenic ของรงควัตถุสีแดงบริสุทธิ์20 จากปาล์มใบเลื่อยต่อชีวภาพทดสอบ ผลได้ดำเนินการ โดยการซื้อ Ricerca, LLC (http://www.Ricerca.com.) ภายใต้สัญญา (Assay #368000 เนื้องอก การสร้างหลอดเลือดใหม่ การประกอบขึ้นของหลอด) กับแบบผลึกรงควัตถุสีแดงที่เตรียมไว้ในตัวอย่าง 1[0081] หลอดเลือดดำ umbilical มนุษย์เซลล์บุผนังหลอด (HUVEC) แตกต่างกับโครงสร้าง 25 แรงเหมือนเครือข่ายเรือแบบฟอร์มบน Matrigel ในต่อหน้าของเซลล์บุผนังหลอดเลือด อาหารเสริมการเจริญเติบโต สามารถประเมินกิจกรรม anti angiogenic การทดสอบผสม โดยการสังเกตความต่อเนื่องของเครือข่ายเรือเปรียบเทียบกับตัวควบคุมที่ไม่ถูกรักษา ทดสอบ สารประกอบ (ตกผลึกรงควัตถุสีแดงเตรียมไว้ในตัวอย่างที่ 3) ได้รับการทดสอบสำหรับลักษณะพิเศษบน ต่อต้าน-การสร้างหลอดเลือดใหม่ที่ความเข้มข้นสุดท้ายห้า 100, 10, 1, 0.1 และ 0.01 m/mL 30 [0082] 2 เตรียมทดสอบสารประกอบ (รงควัตถุสีแดงแบบผลึกเตรียมใน ตัวอย่างที่ 1)แบบผลึกรงควัตถุสีแดงที่เตรียมไว้ในตัวอย่าง 1 ที่ละลายใน 100%dimethyl sulfoxide (DMSO) และทำให้เจือจาง ด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อจะได้รับสารละลายs 1, 10, 100, 1000 และ 100004 mL ใน DMSO 40% ได้ สารละลายs35 100-fold ผสมกับวัฒนธรรมสื่อเพื่อสร้างความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.01, 0.1, 1, 10และ 100m/mL[0083] 3 วัฒนธรรมวิธีการ umbilical มนุษย์เส้นเลือดเซลล์บุผนังหลอดเลือด (HUVEC)HUVEC ที่ซื้อจากอเมริกาชนิดวัฒนธรรมชุด (ATCCCRL-1730) HUVEC เซลล์ถูก incubated ใน 5% CO2 อันที่ 37 องศาเซลเซียส ที่สื่อวัฒนธรรมใช้ได้ปานกลาง เจริญเติบโตของ เซลล์ บุผนังหลอดเลือดเสริม ด้วยเซรั่มวัว 10v/v% 5 และทารกในครรภ์และยาปฏิชีวนะต้านเชื้อรา 1%[0084] 4 reagents: dimethylsulfoxide (GIBCO BRL สหรัฐอเมริกา), ยาปฏิชีวนะต้านเชื้อรา(เมอร์ค เยอรมนี), เซลล์บุผนังหลอดเลือดเชื้อ (เซลล์ที่ใช้งาน สหรัฐอเมริกา), เซรั่มวัวและทารกในครรภ์ (HyClone สหรัฐอเมริกา), Matrigel เมตริกซ์ (เวลาออก BD สหรัฐอเมริกา) และซูรามิน (ซิก สหรัฐอเมริกา)10 [0085] 5 อุปกรณ์และเครื่องมือ96 microwell วัฒนธรรมจาน (NUNC สหรัฐอเมริกา), 5810R เครื่องหมุนเหวี่ยง (Eppendorf เยอรมนี), ดิจิตอลกล้อง (Nikon ญี่ปุ่น), Hematocytometer (Hausser วิทยาศาสตร์เฮอร์แชม สหรัฐอเมริกา), กล้องจุลทรรศน์ Inverted CK-40 (โอลิมปัส ญี่ปุ่น), กล้องจุลทรรศน์ระบบอี-400 (Nikon ญี่ปุ่น) และคณะรัฐมนตรีความปลอดภัยทางชีวภาพ (NuAire สหรัฐอเมริกา)15 [0086] 6 วิธีการเมตริกซ์ Matrigel เป็น thawed เก็บไว้ในน้ำแข็งที่ 4° C และ 541 ของเมทริกซ์ถูกถ่ายโอนไปละดีแผ่น 96 microwell วัฒนธรรม จานถูก incubated ที่ 37° C อย่างน้อยหนึ่งชั่วโมงให้สารละลายเมตริกซ์จะแข็งก่อนรักษา[0087] aliquots 2004 รัฐ HUVEC (เกี่ยวกับ 1.5 x 104cells/ดี) ถูกวางในจาน matrigel 96 ดี 20 Microliters สองต่อด้วยการทดสอบที่ซับซ้อน สารละลายหรือยานพาหนะ (40% DMSO) แล้วเพิ่ม และ incubated 5% CO2, 37° C สำหรับ18 ชั่วโมง (ซ้ำ) ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO เป็น 0.4% การทดสอบสารประกอบถูกประเมินที่ความเข้มข้น 100, 10, 1, 0.1 และ 0.014 mL ที่ มีจุดสิ้นสุดของคณะทันตแพทยศาสตร์ ท่อเครือข่ายเกิดขึ้นจากเซลล์บุผนังหลอดเลือดในแต่ละบ่อ 25 ประเมิน โดย photomicroscopy (อัตราส่วนของ 40 x) และถ่ายภาพ ผลรวม ความยาวของเครือข่ายหลอดถูกวัดจากแต่ละภาพ (Fig. 1) [0088] การลดลงของความยาวรวมของเครือข่ายหลอดทดสอบผสมให้ ความยาวรวมของท่อเครือข่ายในการควบคุมรักษารถบ่งชี้ anti angiogenic กิจกรรมการ เข้มข้นลิปกลอสไขต่ำสุด (MIC) และยับยั้งการ 50% ความเข้มข้น 30 (IC50) ที่กำหนดประเมินผลของสารทดสอบใน ต่อต้าน-การสร้างหลอดเลือดใหม่[0089] Grant,D.S. Kinsella,J.L. Fridman, R., Auerbach อาร์ Piasecki,B.A ยามาดะ Y., ร้อยเอ็ด al. โต้ตอบของเซลล์บุผนังหลอดเลือด ด้วย peptide(SIKVAV) A สาย laminin มีการเพาะเลี้ยง และ angiogenetic พฤติกรรมในสัตว์ทดลองที่เหนี่ยวนำ เจเซลล์ Physio1.153:614-625, 1992 Belotti, D., Vergani 35, V., Drudis ต. Borsotti, P., Pitelli,M.R, Viale กรัม Giavazzi, R. และ Taraboletti กรัม มีผลต่อไมโครทิวบูลยา paclitaxel มีกิจกรรม antiangiogeneic Clin 2:1843 ทรัพยากรมะเร็ง-1849, 1996[0090] 7 ผลลัพธ์จัดแสดงแบบผลึกรงควัตถุสีแดงของการประดิษฐ์นี้ที่ 100ug/mLการยับยั้งการประกอบขึ้นของหลอดที่สัมพันธ์กับการควบคุมรถถือว่าสำคัญ รีเอเจนต์อ้างอิงมาตรฐานที่ 5 ซูรามิน นอกจากนี้ยังจัดแสดงยับยั้งสำคัญที่ 30 และ 15RM (ตารางที่ 2, รูปs 1 และ 2) ค่า IC50 ที่แสดงในตาราง 3 [0091] ยับยั้งการประกอบขึ้นของหลอดรงควัตถุสีแดงผลปาล์มใบเลื่อยรักษาชื่อวิเคราะห์%ยับยั้งความยาวท่อรวม (mean±SEM)ความเข้มข้น (tg/มล.)PT#1151525 368000, การสร้างหลอดเลือดใหม่ 100 10 1 0.1 0.01รงควัตถุสีแดง การประกอบขึ้นของหลอด 80±4ab 19±3 518 813 -217Concentrations (gg/mL)368000, การสร้างหลอดเลือดใหม่ 30 15 10 3 1ซูรามิน การประกอบขึ้นของหลอด 100±0a 42±9'6 8±1 4±5 3±4a: Significant inhibition of การประกอบขึ้นของหลอด (30%) b: Minimum inhibitory concentration (MIC)10 Inhibition of the การประกอบขึ้นของหลอด for 70% or more relative to the vehicle-treated controlgroup indicates significant anti-angiogenic activity.[0092] Summary of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and IC50Treatment Assay # Assay Name MIC IC50PT#1151625 368000รงควัตถุสีแดงซูรามิน 368000Example 3 Tumor, การสร้างหลอดเลือดใหม่, การประกอบขึ้นของหลอด 100[tg/mL 32}tg/mLTumor, การสร้างหลอดเลือดใหม่, การประกอบขึ้นของหลอด 15[M 1611M 15 [0093] A composition containing the รงควัตถุสีแดง from ผลปาล์มใบเลื่อย as thefollowing formulation was prepared.Ingredient Blending quantity of cream (%w/w)Ethinoic extract or รงควัตถุสีแดง from ปาล์มใบเลื่อย 2.0Olive oil 10.0Tri (capryl/capric acid) glyceryl 10.0Tocopherol 1.0D.W. 77.0Total 100.0Example 4[0094] Measurement of การเพิ่มจำนวน inhibition activity of VEGF-Induced cell of 20 vascular endothelial cells by purified รงควัตถุสีแดง from ปาล์มใบเลื่อย. Following results of a biological test was conducted by Ricerca Bioscience,LLC (http://www.Ricerca.com.) with the รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example -19-1.[0095] Test compounds and dosesThe test compounds, NYG-1, DS-SMO, SMO and AK were evaluated for a study of EGF การเพิ่มจำนวน. These compounds were dissolved and diluted in 100% 5 DMSO and concentrations were adjusted to 2.63mg/mL and 26.3mg /mL with DMSO. The final concentration in the test was given as 1001.1g/mL and 101.1g/mL. [0096] NYG-1: รงควัตถุสีแดง แบบผลึก prepared in Example 1.DS-SMO: Lipophilic fraction extracted by ethanol from deep sea shark meat SMO: Lipophilic fraction extracted by ethanol from shark meat10 AK: Concentrated alkoxy glycerol (AKG) of shark liver oil[0097] Cells and MediaHUVEC (human umbilical vein endothelial cells) were purchased fromAmerican Type Culture Collection (ATCC CRL-1730). HUVEC cells were incubated in air atmosphere of 5% CO2 at 37°C. The culture medium used was Endothelial Cell 15 Growth Medium with 10% fetal bovine serum (FBS). The medium for assay was M199 medium supplemented with 10% FBS and 1 Ottg/mL of Heparin. [0098] ReagentsDimethyl sulfoxide (Merck, Germany), Endothelial cell growth medium(CELL APPLICATIONS, USA), Fetal bovine serum (HyClone, USA), Heparin (Sigma, 20 USA), SU5416 (Calbiochem, USA), VEGF165 (Calbiochem, USA) and HBSS(Gibco, USA)[0099] Devices and Apparatus96-microwell tissue culture plate (N'UNC, USA), Centrifuge CT6D (Hitachi, Japan), Nucleocounter (ChemoMetec, Denmark), Inverted microscope CK-30 25 (Olympus, Japan) and Biological safety cabinet (NuAire, USA) [0100] MethodsAliquots of HUVEC (1.1 x 105 cells/ well) were pre-seeded in the 96-well TC plate in an incubator at 5% CO2, 37°C. Test compound สารละลาย or vehicle (DMSO) was then added per well and incubated at 5% CO2, 37°C for 20 minutes. Thereafter, 30 VEGF165 (0.2nM) was added and incubated for 48 hours. 48 hours later, the cells were washed with HBSS once. Then 511g/mL of the fluorescence reagent, CalceinAM dye (BD Biosciences, USA) was added and incubated for another 50 minutes. After incubation, fluorescence intensity was detected by Micro plate reader. More than 50% of suppression for VEGF165 induced การเพิ่มจำนวน was indicated for the significant 35 antagonistic activity of the test reagent.[0101] Summary of Methos -20-307900 Cell การเพิ่มจำนวน, VEGF-InducedTarget: Human Quantitation Method Spectrofluorimetric quantitation ofcell การเพิ่มจำนวนVehicle: 0.4% DMSO Signif. Criteria Ag.: >50% Increase in การเพิ่มจำนวนrelative to VEGF165 respon

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ 0079 ] สกัดแยกน้ำมันและน้ำในชั้นชั้นวางในกรวยแยก . น้ำชั้นก็หายในบีกเกอร์และกรอง
10 โดยใช้กรวยแยกน้ำแยกชั้น . วัสดุผลึกคือ
จากนั้นแยกออกจากน้ำโดยใช้ nutche ( 51.1m ดูดกรอง , กรองกระดาษหุ้ม sansyou Corporation ) ( ADVANTEC โตโย จำกัด2 ) ภายใต้ความดันต่ำ ( 8kpa vs
ความดันสัมบูรณ์ ) แล้วคริสตัลจะได้รับตัวกรองกระดาษ กรองเปียกกระดาษถูกล้างด้วยน้ำเพื่อเอาไขมันที่เหลือแล้ว คริสตัลก็แห้งภายใต้ความดันลดลง
15 ( สุญญากาศคงที่อุณหภูมิอบแห้ง , ADVANTEC Toyo จำกัด ) ที่อุณหภูมิ 60 องศา 1.0g
ของรงควัตถุสีแดงของปาล์มใบเลื่อยได้

ตัวอย่าง 2
[ 0080 ] 1การวัดการป้องกัน angiogenic กิจกรรมให้รงควัตถุสีแดงได้รับ 20 จากปาล์มใบเลื่อย
.
ต่อไปนี้การทดสอบทางชีวภาพผลการทดลองโดยค้นหาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ , LLC
( http : / / www.ricerca . com . ) ภายใต้สัญญา ( โดย# 368000 เนื้องอก การสร้างหลอดเลือดใหม่
,การประกอบขึ้นของหลอด ) กับรงควัตถุสีแดงแบบผลึกเตรียมไว้ในตัวอย่าง 1 .
[ 0081 ] หลอดเลือดดำสายสะดือมนุษย์ ( เพิ่ ) ต่างฝอย 25 โครงสร้างและรูปแบบเครือข่ายบนเรือ matrigel ในการแสดงตนของเยื่อบุเซลล์
การเจริญเติบโตอาหารเสริม ต่อต้าน angiogenic กิจกรรมการทดสอบสารสามารถประเมิน
โดยความต่อเนื่องสังเกตเครือข่ายเรือเมื่อเทียบกับการควบคุมสาร ทดสอบ
สารประกอบ ( ตกผลึกรงควัตถุสีแดงเตรียมไว้ในตัวอย่างที่ 3 ) พบว่ามีผลต่อ
ต่อต้าน - การสร้างหลอดเลือดใหม่ที่ห้าและสุดท้าย 100 , 10 , 1 , 0.1 และ 0.01m/ml .
30 [ 0082 ] 2 การเตรียมการทดสอบสาร ( รงควัตถุสีแดงแบบผลึกเตรียม
ตัวอย่าง 1 )
รงควัตถุสีแดงแบบผลึกเตรียมไว้ในตัวอย่างที่ 1 ละลาย 100%
เต๊ะ ( DMSO ) และเจือจางด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อเพื่อขอรับ
สารละลาย S 1 , 10 , 100 , 1000 และ 100004ml 40 % DMSO . การสารละลาย 2
3 จำนวน 100 พับกับอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อสร้างความเข้มข้นสุดท้าย 0.01 , 0.1 , 1 และ 10
100 / มล.

[ 0083 ] 3 .วิธีวัฒนธรรมของหลอดเลือดดำสายสะดือมนุษย์ ( เพิ่ )
เพิ่ซื้อมาจากประเภทคอลเลกชันวัฒนธรรมอเมริกัน ( ATCC
crl-1730 ) เซลล์ก็เพิ่ ) 5% CO2 ในบรรยากาศที่อุณหภูมิ 37 องศา C .
สื่อวัฒนธรรมใช้เป็นเยื่อบุเซลล์ การเจริญเติบโต อาหารสูตร MS ที่เสริมด้วยเครื่อง / V 5 ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์และ 1% ในยาปฏิชีวนะ .
[ กระดาษ ] 4 สารเคมี : สารต้านเชื้อรายาปฏิชีวนะ ( gibco BRL , USA )ไดเมทิลซัลฟอกไซด์
( Merck , เยอรมัน ) , เซลล์เยื่อบุเจริญ ( กลางงานเซลล์ USA ) ของทารกในครรภ์ และ เซรั่ม ( hyclone , USA ) , matrigel เมทริกซ์ ( BD BIOSCIENCES , USA ) และซูรามิน ( Sigma , USA ) .
10 [ 0085 ] 5 . อุปกรณ์และเครื่องมือ
96 microwell วัฒนธรรมจาน ( ขณะนี้ สหรัฐอเมริกา ) ซึ่ง 5810r ( เพนดอร์ฟ , เยอรมนี ) , กล้อง ดิจิตอล ( Nikon , ญี่ปุ่น ) , hematocytometer ( ด้านวิทยาศาสตร์ hausser USA )กล้องจุลทรรศน์หัวก ck-40 ( Olympus , ญี่ปุ่น ) , ระบบ e-400 กล้องจุลทรรศน์ Nikon , ญี่ปุ่น ) และคณะรัฐมนตรีด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ( nuaire , USA )
5 [ เป็น ] 6 . วิธี
matrigel เมทริกซ์ถูกละลาย เก็บไว้ในที่เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศา C และ 541 ของเมทริกซ์ถูกย้ายกันของวัฒนธรรม microwell 96 แผ่นจานบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลาอย่างน้อยหนึ่งชั่วโมงเพื่อให้เมทริกซ์สารละลายแข็งก่อนการรักษา 0087
[ ] เฉยๆปี 2548 เพิ่ระงับ ( ประมาณ 1.5 x 104cells / ดี ) อายุ 20 อยู่ในดี matrigel 96 แผ่น สองตัวเลขต่อด้วยการทดสอบสาร
สารละลายหรือยานพาหนะ ( 40% DMSO ) จากนั้นเพิ่ม CO2 บ่มที่ 37 ° C 5 %
18 ชั่วโมง ( ซ้ำ )ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO เป็น 0.4% แบบทดสอบประเมินอยู่
ผสมความเข้มข้น 100 , 10 , 1 , 0.1 และ 0.014ml ที่
จบระยะเวลาท่อเครือข่ายที่เกิดจากเยื่อบุเซลล์ในแต่ละบ่อ
25 photomicroscopy ( ประเมินโดยการขยายของ 40 x ) และถ่ายภาพ ความยาวทั้งหมดของท่อ
เครือข่ายวัดจากแต่ละภาพ ( รูปที่ 1 )
[ 0088 ] ลดความยาวทั้งหมดของท่อเครือข่ายในการรักษาสารทดสอบ

ความยาวทั้งหมดของท่อเครือข่ายในการควบคุมการรักษายานพาหนะแสดงกิจกรรมต่อต้าน angiogenic

ความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง ( MIC ) และ 50% inhibition
30 ความเข้มข้น ( ic50 ) ได้รับการพิจารณาเพื่อประเมินผลของการทดสอบสาร anti - การสร้างหลอดเลือดใหม่
.
[ 0089 ] แกรนท์