Separation of Soil Organic Phosphor

Separation of Soil Organic Phosphorus Compounds
Using Reverse-Phase Ion-Pair Chromatography

ABSTRACT
Methods were developed for the extraction and separation of soil organic
phosphorus compounds using reverse-phase ion-pair chromatography
(RP-ICP). Nucleotides (ATP, ADP, and AMP) were separated using a
mobile phase of 15 mM TBAHS, 15 mM KH2PO4, and 7% acetonitrile.
Inositol hexakisphosphate was separated using a mobile phase
composition of 0.05 M formic acid:methanol (49:51 v/v) and
1.5 mL/100 mL of TBAOH. Extraction procedures were developed for
the nucleotides which would be compatible with the RP-ICP system
developed for their separation.

INTRODUCTION
The transport of phosphorus (P) from agricultural land to watercourses
can contribute to the growth of algae and general water quality deterioration
associated with eutrophication." 1 Areas with intensive livestock production
can contribute P to runoff through land application of manure which can
increase the organic P fraction of soils and therefore potentially lead to
enhanced losses of P. Understanding how organic P compounds behave in
soils requires the ability to accurately measure organic P compounds in soils,
manures and other organic amendments.
Traditionally, soil organic P has been crudely determined by the
difference between total P and inorganic P. E2-41 This method is commonly
used because of the difficulties associated with direct measurement of organic
P compounds. While the difference method may be useful for estimating the
total soil organic P fraction, there may be substantial and unknown error
associated with its measurement as well as the inability to identify specific
organic P compounds. The development and implementation of improved
detection methods are necessary to ensure accurate measurement of the
concentration of organic P compounds in soil in order to study their
behavior. [53
The use of high performance liquid chromatography (HPLC) has been
used to identify and measure the organic P fraction in plants, foods, and
aqueous samples. E6-1°1 More recently the identification of organic P
compounds in soils and soil extracts has been accomplished using
phosphorus-3 1 nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy." 1 -133
Although these methods have been developed and used successfully,
there are still some drawbacks to the utilization of these methods for
studying the reactivity and transport of organic P compounds in soils.
Many HPLC procedures utilize ion exchange columns for the separation of
organic P. These columns tend to be expensive, not very durable, and
impractical for analysis of large numbers of samples. Sample preparation
can also be very time consuming and manipulation of samples prior to
analysis can involve many steps that potentially alter or degrade organic P
compounds. The use of NMR is limited by the requirement for sample
pre-concentration and long run times, which can be both expensive and
cause sample degradation.
Practical methods to identify organic P in soil extracts and aqueous
samples are necessary when performing research requiring high throughput of
samples. In addition, reliable extraction methods must also allow recovery of
these compounds from the soil without modification and be compatible with
the analytical procedure.

Separation of Select Organic Phosphorus Compounds
Reverse phase ion pairing chromatography (RP-ICP) was used in this
study for the separation and detection of Inositol Hexakisphosphate (lHP),
Adenosine 5' Triphosphate (ATP), Adenosine 5' Diphosphate (ADP), and
Adenosine 5' Monophosphate (AMP). The RP-1PC system uses elements of
both reverse phase and ion exchange chromatography. The reverse phase
chromatography system is composed of a non-polar stationary phase, usually
carbon chains of varying length, with a polar mobile phase. Unlike regular
reverse phase chromatography, the RP-ICP system has a mobile phase
containing an ion-pairing reagent, typically a charged molecule with a
hydrophobic portion that will 'pair up' with ions in solution. The ion pairs are
retained by the hydrophobic stationary phase. Ion pairs do not exist in the
aqueous solution, but in the nonpolar stationary phase. Because the stationary
phase retains ion pairs, the reverse-phase column effectively functions as an
ion exchange column. This methodology offers several advantages. First,
ionic compounds can be separated without having to use an ion exchange
column, which eliminates complicated sample preparation. Second, reverse
phase chromatography is relatively easy to use and the columns are durable
and inexpensive. This allows for the analysis of large sample sets with
minimal preparation time and without costly sample preparation techniques.
Extraction of Organic Phosphorus Compounds
Sequential acid and alkali extraction has been commonly utilized to
determine soil organic P.[14-17] Initial soil extraction with strong acid
followed by an alkali solution removes more organic P than when either
extractant is used alone. In some procedures, elevated temperatures are also
used, which can cause hydrolysis of labile organic P forms.u4,15,171 With this
extraction procedure, a major concern is recovering all the organic P from the
soil without hydrolyzing any to the inorganic form.
A method proposed by Bowman and Moir [181 to extract soil organic P in
one step involves the use of Na2EDTA with NaOH. The NaOH is used to
solubilize organic P associated with soil organic matter, therefore removing
the majority of the organic P fraction in the soil. The resistance of soil organic
P to alkaline extraction is overcome by adding EDTA, which extracts organic
P adsorbed via a metal cationic bridge. EDTA is a hexadentate ligand that
binds strongly to Group 2 cations such as Mg2± and Ca2± and with other
common soil metals such as Fe 3± and A13±. These metal-EDTA complexes
have 1:1 formation constants ranging from 5.8 X 107 to 5.0 X 1010.[19]

With such high formation constants, EDTA is able to complex metal cations
that are binding organic P molecules to soil particles and soil organic matter,
thereby increasing organic P recovery from the soil. This method is a one-step
procedure, which is an improvement upon the acid–base extraction.
MATERIALS AND METHODS
Reagents
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate (BAHS) and KH 2PO4 were
obtained from Fisher Scientific. Tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH;
40% in water) was obtained from Fluka. Standards of IHP, ATP, ADP, and
AMP, were obtained from Sigma Chemical Company.
Mobile Phase
Preliminary experiments were conducted using different mixtures of the
solvents and ion-pairing reagents described by Patthy et al. F1 to determine the
optimal mixture for nucleotide separation. It was determined that the optimal
mobile phase composition for separation of all three nucleotides consisted of
15 mM TBAHS, 15 mM KH2PO4, and 7% acetonitrile. The mobile phase was
adjusted to pH 5.5 with concentrated H2504, filtered (0.45 imn) and degassed.
The mobile phase used for separation of IHP consisted of 0.05 M formic
acid:methanol (49:51 v/v) and 1.5 mL TBAOH/100 mL. E61 The pH was
adjusted to 4.3 with H2504, filtered (0.45 imn) and degassed.
HPLC Procedure
A reverse phase C-18 column (Waters Nova-Pak C18 3.9 x 75 mm) 4 μm
particle size was equilibrated with the mobile phase overnight. Analyses were
conducted with a Waters HPLC system, and either a refractive index detector
(Waters 410) for the 1HP or a photo diode array (PDA) detector (Waters 991)
for the nucleotides. Separation of ADP and AMP was optimal with a
1 mL min-1 flow rate, 10 1.11 injection volume, and detection at 260 nm
(Fig. 1). Separation of ATP was optimal at a flow rate of 2.5 mL min -1 , 10 ILL
injection volume and detection at 260 nm (Fig. 2). Separation of IHP was
optimal at a flow rate of 3 mL min -1 with a 30 μL injection volume (Fig. 3).
Retention times and peak areas were calculated with the Millennium

Extraction Techniques
The surface horizon of three soils were used to determine the
extractability and recovery of added organic P compounds (Table 1).
Several combinations of the extracting solution composition, extraction
time, amount of soil, and amount of added organic P were tested (Table 2).
All extractions were conducted at 25°C, to avoid potential compound
degradation from elevated temperatures. The initial extraction procedures
were as follows: 4 or 8 mg of ATP was added to 4 or 8 g of soil (screened
to

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Separation of Soil Organic Phosphorus Compounds
Using Reverse-Phase Ion-Pair Chromatography

ABSTRACT
Methods were developed for the extraction and separation of soil organic
phosphorus compounds using reverse-phase ion-pair chromatography
(RP-ICP). Nucleotides (ATP, ADP, and AMP) were separated using a
mobile phase of 15 mM TBAHS, 15 mM KH2PO4, and 7% acetonitrile.
Inositol hexakisphosphate was separated using a mobile phase
composition of 0.05 M formic acid:methanol (49:51 v/v) and
1.5 mL/100 mL of TBAOH. Extraction procedures were developed for
the nucleotides which would be compatible with the RP-ICP system
developed for their separation.

INTRODUCTION
The transport of phosphorus (P) from agricultural land to watercourses
can contribute to the growth of algae and general water quality deterioration
associated with eutrophication." 1 Areas with intensive livestock production
can contribute P to runoff through land application of manure which can
increase the organic P fraction of soils and therefore potentially lead to
enhanced losses of P. Understanding how organic P compounds behave in
soils requires the ability to accurately measure organic P compounds in soils,
manures and other organic amendments.
Traditionally, soil organic P has been crudely determined by the
difference between total P and inorganic P. E2-41 This method is commonly
used because of the difficulties associated with direct measurement of organic
P compounds. While the difference method may be useful for estimating the
total soil organic P fraction, there may be substantial and unknown error
associated with its measurement as well as the inability to identify specific
organic P compounds. The development and implementation of improved
detection methods are necessary to ensure accurate measurement of the
concentration of organic P compounds in soil in order to study their
behavior. [53
The use of high performance liquid chromatography (HPLC) has been
used to identify and measure the organic P fraction in plants, foods, and
aqueous samples. E6-1°1 More recently the identification of organic P
compounds in soils and soil extracts has been accomplished using
phosphorus-3 1 nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy." 1 -133
Although these methods have been developed and used successfully,
there are still some drawbacks to the utilization of these methods for
studying the reactivity and transport of organic P compounds in soils.
Many HPLC procedures utilize ion exchange columns for the separation of
organic P. These columns tend to be expensive, not very durable, and
impractical for analysis of large numbers of samples. Sample preparation
can also be very time consuming and manipulation of samples prior to
analysis can involve many steps that potentially alter or degrade organic P
compounds. The use of NMR is limited by the requirement for sample
pre-concentration and long run times, which can be both expensive and
cause sample degradation.
Practical methods to identify organic P in soil extracts and aqueous
samples are necessary when performing research requiring high throughput of
samples. In addition, reliable extraction methods must also allow recovery of
these compounds from the soil without modification and be compatible with
the analytical procedure.

Separation of Select Organic Phosphorus Compounds
Reverse phase ion pairing chromatography (RP-ICP) was used in this
study for the separation and detection of Inositol Hexakisphosphate (lHP),
Adenosine 5' Triphosphate (ATP), Adenosine 5' Diphosphate (ADP), and
Adenosine 5' Monophosphate (AMP). The RP-1PC system uses elements of
both reverse phase and ion exchange chromatography. The reverse phase
chromatography system is composed of a non-polar stationary phase, usually
carbon chains of varying length, with a polar mobile phase. Unlike regular
reverse phase chromatography, the RP-ICP system has a mobile phase
containing an ion-pairing reagent, typically a charged molecule with a
hydrophobic portion that will 'pair up' with ions in solution. The ion pairs are
retained by the hydrophobic stationary phase. Ion pairs do not exist in the
aqueous solution, but in the nonpolar stationary phase. Because the stationary
phase retains ion pairs, the reverse-phase column effectively functions as an
ion exchange column. This methodology offers several advantages. First,
ionic compounds can be separated without having to use an ion exchange
column, which eliminates complicated sample preparation. Second, reverse
phase chromatography is relatively easy to use and the columns are durable
and inexpensive. This allows for the analysis of large sample sets with
minimal preparation time and without costly sample preparation techniques.
Extraction of Organic Phosphorus Compounds
Sequential acid and alkali extraction has been commonly utilized to
determine soil organic P.[14-17] Initial soil extraction with strong acid
followed by an alkali solution removes more organic P than when either
extractant is used alone. In some procedures, elevated temperatures are also
used, which can cause hydrolysis of labile organic P forms.u4,15,171 With this
extraction procedure, a major concern is recovering all the organic P from the
soil without hydrolyzing any to the inorganic form.
A method proposed by Bowman and Moir [181 to extract soil organic P in
one step involves the use of Na2EDTA with NaOH. The NaOH is used to
solubilize organic P associated with soil organic matter, therefore removing
the majority of the organic P fraction in the soil. The resistance of soil organic
P to alkaline extraction is overcome by adding EDTA, which extracts organic
P adsorbed via a metal cationic bridge. EDTA is a hexadentate ligand that
binds strongly to Group 2 cations such as Mg2± and Ca2± and with other
common soil metals such as Fe 3± and A13±. These metal-EDTA complexes
have 1:1 formation constants ranging from 5.8 X 107 to 5.0 X 1010.[19]

With such high formation constants, EDTA is able to complex metal cations
that are binding organic P molecules to soil particles and soil organic matter,
thereby increasing organic P recovery from the soil. This method is a one-step
procedure, which is an improvement upon the acid–base extraction.
MATERIALS AND METHODS
Reagents
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate (BAHS) and KH 2PO4 were
obtained from Fisher Scientific. Tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH;
40% in water) was obtained from Fluka. Standards of IHP, ATP, ADP, and
AMP, were obtained from Sigma Chemical Company.
Mobile Phase
Preliminary experiments were conducted using different mixtures of the
solvents and ion-pairing reagents described by Patthy et al. F1 to determine the
optimal mixture for nucleotide separation. It was determined that the optimal
mobile phase composition for separation of all three nucleotides consisted of
15 mM TBAHS, 15 mM KH2PO4, and 7% acetonitrile. The mobile phase was
adjusted to pH 5.5 with concentrated H2504, filtered (0.45 imn) and degassed.
The mobile phase used for separation of IHP consisted of 0.05 M formic
acid:methanol (49:51 v/v) and 1.5 mL TBAOH/100 mL. E61 The pH was
adjusted to 4.3 with H2504, filtered (0.45 imn) and degassed.
HPLC Procedure
A reverse phase C-18 column (Waters Nova-Pak C18 3.9 x 75 mm) 4 μm
particle size was equilibrated with the mobile phase overnight. Analyses were
conducted with a Waters HPLC system, and either a refractive index detector
(Waters 410) for the 1HP or a photo diode array (PDA) detector (Waters 991)
for the nucleotides. Separation of ADP and AMP was optimal with a
1 mL min-1 flow rate, 10 1.11 injection volume, and detection at 260 nm
(Fig. 1). Separation of ATP was optimal at a flow rate of 2.5 mL min -1 , 10 ILL
injection volume and detection at 260 nm (Fig. 2). Separation of IHP was
optimal at a flow rate of 3 mL min -1 with a 30 μL injection volume (Fig. 3).
Retention times and peak areas were calculated with the Millennium

Extraction Techniques
The surface horizon of three soils were used to determine the
extractability and recovery of added organic P compounds (Table 1).
Several combinations of the extracting solution composition, extraction
time, amount of soil, and amount of added organic P were tested (Table 2).
All extractions were conducted at 25°C, to avoid potential compound
degradation from elevated temperatures. The initial extraction procedures
were as follows: 4 or 8 mg of ATP was added to 4 or 8 g of soil (screened
to <2mm), 25 mL of extracting solution (NaOH-EDTA or H 2O) was added
five minutes after addition of the ATP to the soil and shaken for 1 or 1.5 hr.
Some samples were also extracted with water: these were shaken for an
additional 0.5 hr and then combined with the original extracted solution
(Table 2). All extracts were filtered through Whatman 42 filter paper,
adjusted to pH 6 with H2504 and filtered (0.45 ilm) prior to HPLC analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกดินอินทรีย์ฟอสฟอรัสสารประกอบ
ใช้ย้อนกลับเฟสโครมา Ion-Pair บทคัดย่อวิธีการได้รับการพัฒนาสำหรับการสกัดและการแยกตัวของดินอินทรีย์สารฟอสฟอรัสใช้ย้อนกลับเฟสโคไอออนคู่(RP-ICP) นิวคลีโอ (ATP, ADP และแอมป์) ถูกแยกออกโดยใช้เฟสเคลื่อนที่ 15 มิลลิ TBAHS, 15 มิลลิ KH2PO4 และ 7% acetonitrile. Inositol hexakisphosphate ถูกแยกออกโดยใช้เฟสเคลื่อนที่0.05 องค์ประกอบของกรดฟอร์มิ: เมทานอล (49:51 วี / V) และ1.5 มิลลิลิตร / 100 มิลลิลิตร TBAOH ขั้นตอนการสกัดได้รับการพัฒนาสำหรับนิวคลีโอซึ่งจะเข้ากันได้กับระบบ RP-ICP พัฒนาสำหรับการแยกของพวกเขา. บทนำการขนส่งของฟอสฟอรัส (P) จากที่ดินการเกษตรเพื่อทางน้ำสามารถนำไปสู่การเจริญเติบโตของสาหร่ายและเสื่อมคุณภาพน้ำทั่วไปที่เกี่ยวข้องกับการขาดออกซิเจน . "1 พื้นที่ที่มีการผลิตปศุสัตว์ที่เข้มข้นสามารถนำ P เพื่อการไหลบ่าผ่านการประยุกต์ใช้ที่ดินของมูลซึ่งสามารถเพิ่มส่วน P อินทรีย์ของดินและดังนั้นจึงอาจนำไปสู่​​การสูญเสียที่เพิ่มขึ้นของ P. ทำความเข้าใจวิธีการสารประกอบอินทรีย์ P ประพฤติตนอยู่ในดินที่ต้องใช้ความสามารถอย่างถูกต้อง วัดสาร P อินทรีย์ในดินปุ๋ยและที่แก้ไขเพิ่มเติมอินทรีย์อื่น ๆ . ตามเนื้อผ้าดินอินทรีย์ P ได้รับการพิจารณาหยาบโดยความแตกต่างระหว่าง P ทั้งหมดและอนินทรี P. E2-41 วิธีนี้เป็นที่นิยมใช้เพราะปัญหาที่เกี่ยวข้องกับวัดโดยตรงอินทรีย์สารประกอบ P. ในขณะที่วิธีการที่แตกต่างกันอาจจะเป็นประโยชน์สำหรับการประเมินดินทั้งหมดส่วน P อินทรีย์อาจจะมีข้อผิดพลาดมากและไม่รู้จักที่เกี่ยวข้องกับการวัดรวมทั้งไม่สามารถที่จะระบุเฉพาะเจาะจงสารประกอบอินทรีย์ P การพัฒนาและการดำเนินการปรับปรุงวิธีการตรวจสอบที่มีความจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าการวัดที่ถูกต้องของความเข้มข้นของสาร P อินทรีย์ในดินเพื่อการศึกษาของพวกเขาพฤติกรรม [53 การใช้ประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography (HPLC) ได้รับการใช้ในการระบุและวัดส่วน P อินทรีย์ในพืชอาหารและตัวอย่างน้ำ E6-1 ° 1 เมื่อเร็ว ๆ นี้ระบุตัวตนของ P อินทรีย์สารในดินและสารสกัดจากดินได้รับความสำเร็จโดยใช้ฟอสฟอรัส 3 1 นิวเคลียร์ด้วยคลื่นสนามแม่เหล็ก (NMR) สเปกโทรสโก. "1 -133 ถึงแม้ว่าวิธีการเหล่านี้ได้รับการพัฒนาและนำมาใช้ประสบความสำเร็จมี ยังคงข้อบกพร่องบางอย่างที่จะใช้ประโยชน์จากวิธีการเหล่านี้สำหรับการศึกษาการเกิดปฏิกิริยาและการขนส่งของสาร P อินทรีย์ในดิน. ขั้นตอนการใช้ HPLC หลายคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนสำหรับการแยกอินทรีย์ P. คอลัมน์เหล่านี้มักจะมีราคาแพงไม่คงทนมากและทำไม่ได้สำหรับ การวิเคราะห์ของตัวเลขขนาดใหญ่ของกลุ่มตัวอย่าง. เตรียมตัวอย่างนอกจากนี้ยังสามารถใช้เวลานานมากและการจัดการของกลุ่มตัวอย่างก่อนที่จะมีการวิเคราะห์สามารถเกี่ยวข้องกับหลายขั้นตอนที่อาจเปลี่ยนแปลงหรือลด P อินทรีย์สาร. ใช้ NMR ถูก จำกัด โดยความต้องการสำหรับตัวอย่างความเข้มข้นก่อนและ วิ่งครั้งยาวซึ่งสามารถเป็นได้ทั้งราคาแพงและก่อให้เกิดการย่อยสลายตัวอย่าง. วิธีการปฏิบัติในการระบุ P สารสกัดอินทรีย์ในดินและน้ำตัวอย่างมีความจำเป็นเมื่อดำเนินการวิจัยที่ต้องใช้อัตราความเร็วสูงของกลุ่มตัวอย่าง นอกจากนี้วิธีการสกัดที่เชื่อถือได้นอกจากนี้ยังต้องช่วยให้การฟื้นตัวของสารเหล่านี้มาจากพื้นดินโดยไม่มีการดัดแปลงและเข้ากันได้กับขั้นตอนการวิเคราะห์. แยกเลือกอินทรีย์ฟอสฟอรัสสารประกอบเฟสย้อนกลับไอออนโครมาจับคู่ (RP-ICP) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาสำหรับการแยก และการตรวจสอบ Inositol Hexakisphosphate (LHP) Adenosine 5 'Triphosphate (ATP) Adenosine 5' เพท (ADP) และAdenosine 5 'Monophosphate (AMP) ระบบ RP-1PC ใช้องค์ประกอบของทั้งสองขั้นตอนกลับและโครมาแลกเปลี่ยนไอออน ย้อนกลับเฟสระบบโคประกอบด้วยเฟสที่ไม่มีขั้วมักโซ่คาร์บอนที่มีความยาวแตกต่างกันกับเฟสเคลื่อนที่ขั้วโลก ซึ่งแตกต่างจากปกติโคย้อนกลับเฟส, ระบบ RP-ICP มีเฟสเคลื่อนที่ที่มีสารไอออนจับคู่โดยทั่วไปโมเลกุลเรียกเก็บเงินกับส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่จะ 'จับคู่' กับไอออนในการแก้ปัญหา คู่ไอออนจะถูกเก็บรักษาไว้โดยเฟสไม่ชอบน้ำ คู่ไอออนไม่อยู่ในสารละลาย แต่ในเฟส nonpolar เพราะนิ่งขั้นตอนยังคงคู่ไอออนคอลัมน์เฟสกลับทำหน้าที่อย่างมีประสิทธิภาพเป็นคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน วิธีการนี้มีข้อดีหลายประการ ขั้นแรกสารประกอบไอออนิกสามารถแยกออกได้โดยไม่ต้องใช้การแลกเปลี่ยนไอออนคอลัมน์ซึ่งลดการเตรียมสารตัวอย่างที่มีความซับซ้อน ประการที่สองกลับโคเฟสค่อนข้างใช้งานง่ายและคอลัมน์ที่มีความคงทนและราคาไม่แพง นี้จะช่วยให้การวิเคราะห์ชุดตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่ที่มีเวลาเตรียมตัวน้อยที่สุดและโดยไม่ต้องเสียค่าใช้จ่ายตัวอย่างเทคนิคการเตรียม. สกัดอินทรีย์ฟอสฟอรัสสารประกอบกรด Sequential และการสกัดอัลคาไลน์ได้ถูกนำมาใช้กันทั่วไปเพื่อตรวจสอบดินอินทรีย์ P. [14-17] การสกัดดินเริ่มต้นด้วยการที่แข็งแกร่ง กรดตามด้วยการแก้ปัญหาด่างเอา P อินทรีย์มากขึ้นกว่าเมื่อทั้งสารสกัดถูกนำมาใช้เพียงอย่างเดียว ในขั้นตอนบางส่วนอุณหภูมิที่สูงขึ้นนอกจากนี้ยังมีการใช้ซึ่งอาจทำให้เกิดการย่อยสลายของ forms.u4,15,171 P อินทรีย์ labile กับขั้นตอนการสกัดความกังวลที่สำคัญคือการกู้คืนทั้งหมด P อินทรีย์จากดินโดยไม่มีการย่อยใด ๆ ในรูปแบบอนินทรี. วิธี ที่เสนอโดยนายขมังธนูและ Moir [181 ถึงแยกดินอินทรีย์ P ในขั้นตอนหนึ่งที่เกี่ยวข้องกับการใช้ Na2EDTA ด้วย NaOH NaOH จะใช้ในการละลาย P อินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับอินทรียวัตถุในดินจึงเอาเสียงส่วนใหญ่ของส่วน P อินทรีย์ในดิน ความต้านทานของดินอินทรีย์P เพื่อสกัดอัลคาไลน์จะเอาชนะโดยการเพิ่ม EDTA ซึ่งสารสกัดอินทรีย์P ดูดซับผ่านสะพานประจุบวกโลหะ EDTA เป็นแกนด์ hexadentate ที่ผูกอย่างยิ่งกับกลุ่มที่ 2 ไพเพอร์เช่น Mg2 ±และ Ca2 ±และกับคนอื่น ๆโลหะดินทั่วไปเช่นเฟ± 3 และ A13 ± เหล่านี้เชิงซ้อนโลหะ EDTA มี 1: 1 คงก่อตัวตั้งแต่ 5.8 X 107-5.0 X 1010 [19] ด้วยการสร้างค่าคงที่ดังกล่าวสูง EDTA สามารถไพเพอร์โลหะที่ซับซ้อนที่มีผลผูกพันโมเลกุล P อินทรีย์เพื่ออนุภาคของดินและอินทรียวัตถุในดิน , จึงช่วยเพิ่มการกู้คืน P อินทรีย์จากดิน วิธีนี้เป็นขั้นตอนหนึ่งขั้นตอนที่มีการปรับปรุงเมื่อสกัดกรดเบส. วัสดุและวิธีการวิเคราะห์สารTetrabutylammonium ซัลเฟตไฮโดรเจน (BAHS) และ KH 2PO4 ถูกที่ได้รับจาก Fisher Scientific ไฮดรอกไซ Tetrabutylammonium (TBAOH; 40% ในน้ำ) ที่ได้รับจาก Fluka มาตรฐานการ IHP เอทีพี, ADP และแอมป์ที่ได้รับจาก บริษัท Sigma เคมี. มือถือขั้นตอนการทดลองเบื้องต้นได้รับการดำเนินการโดยใช้ผสมที่แตกต่างกันของตัวทำละลายและสารเคมีไอออนจับคู่อธิบายโดย Patthy และคณะ F1 เพื่อตรวจสอบส่วนผสมที่ดีที่สุดสำหรับการแยกเบื่อหน่าย มันได้รับการพิจารณาแล้วว่าดีที่สุดองค์ประกอบเฟสเคลื่อนที่สำหรับการแยกของทั้งสามประกอบด้วยนิวคลีโอ15 มิลลิ TBAHS, 15 มิลลิ KH2PO4 และ 7% acetonitrile เฟสเคลื่อนที่ถูก. ปรับให้ค่า pH 5.5 ที่มีความเข้มข้น H2504 กรอง (0.45 IMN) และ degassed เฟสเคลื่อนที่ที่ใช้สำหรับการแยก IHP ประกอบด้วย 0.05 M ฟอร์มิกรด: เมทานอล (49:51 v / v) และ 1.5 มิลลิลิตร TBAOH / 100 มิลลิลิตร E61 พีเอชได้รับการปรับเปลี่ยนให้กับ 4.3 H2504 กรอง (0.45 IMN) และ degassed. HPLC ขั้นตอนการกลับเฟสเสา C-18 (น้ำ Nova-ปาก C18 3.9 x 75 มม) 4 ไมครอนขนาดอนุภาคถูก equilibrated กับเฟสเคลื่อนที่ในชั่วข้ามคืน การวิเคราะห์ได้ดำเนินการกับระบบน้ำ HPLC และทั้งตรวจจับดัชนีหักเห(น้ำ 410) สำหรับ 1HP หรืออาร์เรย์ไดโอดภาพ (PDA) เครื่องตรวจจับ (น้ำ 991) สำหรับนิวคลีโอ แยก ADP และแอมป์เป็นที่เหมาะสมกับ1 มิลลิลิตรนาทีอัตราการไหล 1, 10 1.11 ปริมาณการฉีดและการตรวจสอบที่ 260 นาโนเมตร(รูปที่ 1). แยกเอทีพีเป็นที่ดีที่สุดที่อัตราการไหล 2.5 มิลลิลิตรนาที -1, 10 ILL ปริมาณการฉีดและการตรวจสอบที่ 260 นาโนเมตร (รูปที่ 2). แยก IHP เป็นที่ดีที่สุดที่อัตราการไหลของ 3 มิลลิลิตรนาที -1 มีปริมาณการฉีดไมโครลิตร 30 (รูปที่. 3). ครั้งการเก็บรักษาและพื้นที่สูงสุดจะถูกคำนวณกับมิลเลนเนียมเทคนิคการสกัดขอบฟ้าพื้นผิวของดินที่สามถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบสกัดและการฟื้นตัวของสารประกอบอินทรีย์เพิ่ม P (ตารางที่ 1). หลายชุดขององค์ประกอบการแก้ปัญหาสกัดสกัดเวลาปริมาณของดินและปริมาณของ P อินทรีย์เพิ่มได้มีการทดสอบ (ตารางที่ 2). ทั้งหมดการสกัดสารที่ได้รับการดำเนินการที่ 25 ° C, เพื่อหลีกเลี่ยงสารที่มีศักยภาพในการย่อยสลายจากอุณหภูมิที่สูงขึ้น ขั้นตอนการสกัดครั้งแรกมีดังนี้ 4 หรือ 8 มิลลิกรัมของเอทีพีถูกบันทึกอยู่ใน 4 หรือ 8 กรัมของดิน (ฉายที่ <2mm) 25 มิลลิลิตรของสารละลายสกัด (NaOH-EDTA หรือ H 2O) ถูกบันทึกอยู่ในห้านาทีหลังจากการเพิ่มขึ้นของ เอทีพีให้กับดินและเขย่าสำหรับ 1 หรือ 1.5 ชม. ตัวอย่างบางคนถูกสกัดด้วยน้ำเหล่านี้ถูกเขย่าเพิ่มเติม 0.5 ชั่วโมงและรวมกันแล้วกับสารสกัดเดิม(ตารางที่ 2) สารสกัดจากทั้งหมดถูกกรองผ่านกระดาษกรอง Whatman 42, ปรับให้ค่า pH 6 กับ H2504 และกรอง (0.45 ILM) ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ HPLC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกของดินอินทรีย์ สารประกอบของฟอสฟอรัส
ใช้กลับเฟสคู่ไอออนโครมาโทกราฟี Abstract

วิธีการพัฒนาสำหรับการสกัดและการแยกของดินอินทรีย์
สารประกอบของฟอสฟอรัสใช้กลับเฟสคู่ไอออนโครมาโตกราฟี
( rp-icp ) นิวคลีโอไทด์ ( ATP ADP , และแอมป์ ) ถูกแยกจากกันโดยใช้
เฟสเคลื่อนที่ 15 tbahs มม. kh2po4 15 มม. และ 7%
ไน .ไอโนซิทอล hexakisphosphate แยกโดยใช้อัตราส่วนเฟส
มือถือ 0.05 M กรด : เมทานอล ( 49:51 v / v )
1.5 มล. / 100 มิลลิลิตร tbaoh . ขั้นตอนการสกัดถูกพัฒนาสำหรับ
นิวคลีโอไทด์ซึ่งจะเข้ากันได้กับระบบที่พัฒนาขึ้นสำหรับการแยกของพวกเขา rp-icp



แนะนำการเคลื่อนที่ของฟอสฟอรัส ( P ) จากที่ดินเพื่อการเกษตรห้วย
สามารถสนับสนุนการเติบโตของสาหร่ายและคุณภาพน้ำเสื่อม
ทั่วไปที่เกี่ยวข้องกับบานชื่น " 1 พื้นที่กับ
ปศุสัตว์สามารถสนับสนุนการไหลบ่าผ่าน p ที่ดินมูลซึ่งสามารถ
เพิ่มอินทรีย์ P ส่วนของดินจึงอาจนำไปสู่การสูญเสียของ P . ความเข้าใจวิธีการ
เพิ่มอินทรีย์สารทำตัว
pดินต้องใช้ความสามารถในการแม่นยำในการวัดระดับสารอินทรีย์ในดิน ปุ๋ยคอก และแก้ไข

ผ้าอินทรีย์อื่น ๆอินทรีย์ P ได้รับการพิจารณาอย่างคร่าวๆ โดย
ความแตกต่างระหว่าง P และสารอนินทรีย์รวมหน้า e2-41 วิธีนี้เป็นวิธีที่ใช้โดยทั่วไป
เพราะความยุ่งยากที่เกี่ยวข้องกับการวัดโดยตรงของอินทรีย์
P สารในขณะที่วิธีความแตกต่างที่อาจเป็นประโยชน์สำหรับการประเมิน
รวมอินทรีย์ P เศษส่วน อาจจะมีมากและไม่รู้จักข้อผิดพลาด
เกี่ยวข้องกับของการวัด รวมถึงไม่สามารถที่จะระบุเฉพาะเจาะจง
p อินทรีย์สาร การพัฒนาและทดลองใช้ปรับปรุงวิธีการตรวจสอบเป็นสิ่งที่จำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่า

ถูกต้องของการวัดความเข้มข้นของอินทรีย์สารในดิน ? เพื่อศึกษาพฤติกรรมของพวกเขา

[ 53
ใช้วิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC ) ได้
ใช้เพื่อระบุและวัดอินทรีย์ P ส่วนในพืชอาหารและ
ตัวอย่างสารละลาย . e6-1 / 1 เพิ่มเติมล่าสุดตัวของอินทรีย์สารในดินและ p

ได้สำเร็จโดยใช้สารสกัดจากดินphosphorus-3 1 แม่เหล็กนิวเคลียร์ ( NMR ) spectroscopy " 1 - 133
ถึงแม้ว่าวิธีการเหล่านี้ได้รับการพัฒนาและใช้เรียบร้อยแล้ว
ยังมีบางประการในการใช้วิธีการเหล่านี้เพื่อ
เรียนความว่องไวและการขนส่งของอินทรีย์สารในดิน P .
ขั้นตอนโดยมากใช้คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนเพื่อแยก
อินทรีย์หน้าคอลัมน์เหล่านี้มักจะมีราคาแพงไม่ค่อยทนทาน และใช้งานไม่ได้สำหรับการวิเคราะห์
ของตัวเลขขนาดใหญ่ของตัวอย่าง
ตัวอย่างการเตรียมยังสามารถบริโภคมากเวลาและการจัดการของกลุ่มตัวอย่างก่อน
การวิเคราะห์สามารถเกี่ยวข้องกับหลายขั้นตอนที่อาจเปลี่ยนแปลงหรือย่อยสลายอินทรีย์สาร P
. ใช้ของคุณจะถูก จำกัด โดยความต้องการสำหรับตัวอย่าง
ก่อนสมาธิยาวครั้ง ซึ่งสามารถเป็นทั้งแพงและ
เกิดการย่อยสลายตัวอย่าง วิธีการปฏิบัติเพื่อระบุ
p ในดินอินทรีย์สารสกัดและตัวอย่างน้ำเป็นสิ่งจำเป็นเมื่อดำเนินการวิจัยที่ต้องการ

throughput สูง ตัวอย่าง โดยการสกัดด้วยวิธีที่เชื่อถือได้ นอกจากนี้ ยังต้องให้คืน
สารประกอบเหล่านี้จากดินโดยไม่ต้องดัดแปลง และเข้ากันได้กับ

ขั้นตอนการวิเคราะห์การเลือกอินทรีย์ สารประกอบของฟอสฟอรัส
กลับเฟสคู่ไอออน chromatography ( rp-icp ) ถูกนำมาใช้ในการศึกษา
เพื่อแยกและตรวจสอบ hexakisphosphate Inositol ( lhp )
อะดีโนซีนไตรฟอสเฟต ( ATP ) 5 " อะดีโนซีน 5 ' ไดฟอสเฟต ( ADP ) และอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต ( '
5 แอมป์ ) ระบบ rp-1pc ใช้องค์ประกอบของ
ทั้งสองกลับเฟส และโครมาโทกราฟีการแลกเปลี่ยนไอออนกลับเฟส
โครมาโตกราฟีระบบประกอบด้วยไม่มีขั้วนิ่งระยะปกติ
คาร์บอนโซ่ของความยาวแตกต่างกัน กับขั้วเฟสเคลื่อนที่ . ซึ่งแตกต่างจากเทคนิคเฟสกลับปกติ
, ระบบ rp-icp มีเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยไอออนคู่
3 โดยปกติประจุโมเลกุลกับ
ส่วน ) ที่ ' คู่ ' กับไอออนในสารละลาย ไอออนคู่
เก็บไว้ด้วย stationary phase ) . ไอออนคู่ไม่มีอยู่ใน
สารละลาย แต่ในเฟสอยู่กับที่ไม่มีขั้ว . เพราะเฟสอยู่กับที่
รักษาไอออนคู่ , กลับเฟสคอลัมน์ได้อย่างมีประสิทธิภาพการทำงานเป็น
แลกเปลี่ยนอิออนคอลัมน์ วิธีการนี้มีข้อดีหลายประการ แรก
สารประกอบอิออนิคสามารถแยกออกจากกันได้โดยไม่ต้องใช้การแลกเปลี่ยนไอออน
คอลัมน์ซึ่งจะช่วยลดการเตรียมตัวอย่างซับซ้อน 2 ย้อนกลับ
เฟสโครมาโทกราฟีค่อนข้างใช้งานง่ายและคอลัมน์จะทนทาน
และราคาไม่แพง นี้จะช่วยให้สำหรับการวิเคราะห์ชุดตัวอย่างขนาดใหญ่ที่มีเวลาเตรียมตัวน้อย และไม่มี

เทคนิคการเตรียมตัวอย่างแพง การสกัดสารประกอบอินทรีย์
ฟอสฟอรัสกรดด่างและการสกัดลำดับได้โดยทั่วไปใช้

ตรวจสอบดินอินทรีย์หน้า [ 14-17 ] เริ่มต้นการสกัดด้วยกรดดิน
ตามด้วยด่างเอาอินทรีย์มากขึ้นกว่าเมื่อ P
สกัดใช้คนเดียว ในบางขั้นตอน อุณหภูมิสูงยัง
ใช้ซึ่งอาจทำให้เกิดการย่อยสลายของรูปแบบยาอินทรีย์ P .
u4,15171 ด้วยขั้นตอนการสกัด , ความกังวลหลักคือการกู้คืนทั้งหมดอินทรีย์
P จากดิน โดยไม่มีการย่อยใด ๆเพื่อรูปแบบอนินทรีย์ .
วิธีที่เสนอโดยโบว์แมนและมอยร์ [ 181 สกัดอินทรีย์ฟอสฟอรัสในดิน
ขั้นตอนหนึ่งที่เกี่ยวข้องกับการใช้ na2edta ด้วย NaOH มี NaOH ใช้
solubilize อินทรีย์ P ที่เกี่ยวข้องกับอินทรีย์วัตถุในดิน ดังนั้นการเอา
ส่วนใหญ่ของเศษอินทรีย์ฟอสฟอรัสในดิน ความต้านทานของดินอินทรีย์
P เพื่อการสกัดด้วยด่างถูกเอาชนะโดยการเพิ่ม EDTA ซึ่งสารสกัดอินทรีย์
P ดูดซับโลหะประจุบวก ผ่านสะพาน EDTA เป็นลิแกนด์ที่
ผูกเพื่อขอกลุ่มไอออนบวก เช่น mg2 ±แคลเซียมและ±กับโลหะและดินอื่น ๆ ทั่วไป เช่น เหล็ก±
3 และ± A13 . สารประกอบเชิงซ้อนโลหะเหล่านี้มีการสร้างค่าคงที่ EDTA
1 ตั้งแต่ 5.8 x 107 5.0 x 1010 [ 19 ]

ด้วยเช่นสูงการสร้างค่าคงที่EDTA สามารถซับซ้อนไอออนโลหะ
ที่ผูกอินทรีย์โมเลกุล อนุภาค P ดินและอินทรีย์วัตถุในดินอินทรีย์ P
งบเพิ่ม , การกู้คืนจากดิน วิธีนี้ขั้นตอนเดียว
ขั้นตอน ซึ่งมีการปรับปรุงเมื่อกรด - เบส ในการสกัดสารเคมี


วัสดุและวิธีการโมลาร์ไฮโดรเจนซัลเฟต ( bahs ) และ KH 2po4 ถูก
ได้รับจากชาวประมงทางวิทยาศาสตร์โมลาร์โซเดียมไฮดรอกไซด์ ( tbaoh ;
40% ในน้ำ ) ได้จาก fluka . มาตรฐานของ IHP ATP ADP และ
, , , แอมป์ , ที่ได้รับจาก บริษัท ซิกม่า เคมี

มือถือระยะเบื้องต้น การทดลองใช้ส่วนผสมที่แตกต่างกันของสารละลายไอออนคู่
และ reagents อธิบายโดย patthy et al . F1 เพื่อหาส่วนผสมที่เหมาะสมสำหรับการแยกยีน
.มันเป็นตัดสินใจที่เหมาะสมสำหรับการแยกองค์ประกอบ
เฟสเคลื่อนที่ทั้งหมด 3 คู่ ประกอบด้วย kh2po4
15 tbahs มม. 15 มม. และ 7% ไน . ระยะเคลื่อนที่
ค่า pH 5.5 กับความเข้มข้น h2504 , กรอง ( 0.45 Immersion ) และ degassed .
เฟสเคลื่อนที่ที่ใช้สำหรับการแยกของ IHP คือ 0.05 M มิค
กรด : เมทานอล ( 49:51 v / v ) และ 1.5 กรัม / 100 มิลลิลิตร tbaoh E61 pH คือ
ปรับระดับด้วย h2504 , กรอง ( 0.45 Immersion ) และ degassed .

ย้อนกลับขั้นตอนขั้นตอน HPLC คอลัมน์ ( น้ำ - โนวา ปาก c18 3.9 x 75 มิลลิเมตร ) 4 μ M
ขนาดอนุภาค equilibrated กับเฟสเคลื่อนที่อย่างรวดเร็ว วิเคราะห์ข้อมูลวิจัยด้วยระบบ HPLC

เครื่องตรวจจับน้ำ ทั้งดัชนีการหักเห ( น้ำ 410 ) เพื่อ 1HP หรือโฟโตไดโอดเรย์ ( PDA ) เครื่องตรวจจับ ( น้ำ 991 )
สำหรับเรา .การแยกของ ADP และแอมป์ก็เหมาะสมกับ
1 มิลลิลิตร อัตราการไหลของ min-1 10 1.11 การฉีดปริมาณ และการตรวจจับที่ 260 nm
( รูปที่ 1 ) การแยกของเอทีพีได้สูงสุดที่อัตราการ ไหลของ 2.5 มิลลิลิตรต่อนาที - 1 , 10 ป่วย
ฉีดปริมาณและการตรวจสอบที่ 260 nm ( รูปที่ 2 ) การแยกของ IHP คือ
ที่ดีที่สุดที่อัตราการไหล 3 มิลลิลิตรต่อนาที - 1 กับการฉีดปริมาณ 30 μ L
( รูปที่ 3 )เวลากักสูงสุด และคำนวณพื้นที่ด้วยเทคนิคการสกัดสหัสวรรษ


ผิวดินฟ้าสามเพื่อใช้ตรวจสอบ
การตัดตอนและการกู้คืนของการเพิ่มอินทรีย์สาร P ( ตารางที่ 1 ) .
ชุดหลายของการสกัดองค์ประกอบโซลูชันเวลาการสกัด
, ปริมาณของดิน และปริมาณของการเพิ่มอินทรีย์ P คือ ทดสอบ
( ตารางที่ 2 )ทั้งหมดจำนวน 25 ° C ในการสกัดเพื่อหลีกเลี่ยงการย่อยสลายสาร
อาจเกิดขึ้นจากอุณหภูมิสูง
ขั้นตอนการสกัดเริ่มต้นมีดังนี้ : 4 หรือ 8 มิลลิกรัมของเอทีพี ได้เพิ่มเป็น 4 หรือ 8 กรัมของดิน ( เพื่อคัดกรอง
< 2 มิลลิเมตร ) , 25 มิลลิลิตร ( NaOH แยกสารละลาย EDTA หรือ H 20 ) เพิ่ม
5 นาทีหลังจากที่เพิ่ม ATP ให้ดินและเขย่า 1 หรือ 1.5 ชม. .
ตัวอย่างบางส่วนถูกสกัดด้วยน้ำ เหล่านี้ถูกเขย่าสำหรับ
เพิ่มเติม 0.5 ชม. และรวมกันแล้วกับต้นฉบับสารสกัด
( ตารางที่ 2 ) สารสกัดทั้งหมดถูกกรองผ่านกระดาษกรอง
whatman 42 , ค่า pH 6 กับ h2504 กรอง ( 0.45 ลม ) ก่อนการวิเคราะห์ปริมาณซูโครส