Procedure:Short 96 well assay: EACH

Procedure:
Short 96 well assay: EACH condition should be done in triplicate or more.
1. DAY ONE: Trypsinize one T-25 flask and add 5 ml of complete media to trypsinized cells. Centrifuge in a sterile
15 ml falcon tube at 500 rpm in the swinging bucked rotor (~400 x g) for 5 min.
2. Remove media and resuspend cells to 1.0 ml with complete media.
3. Count and record cells per ml. Remember to remove the cells aseptically when counting.
4. DILUTE the cells (cv=cv) to 75,000 cells per ml. Use complete media to dilute cells.
5. Add 100 μl of cells (7500 total cells) into each well and incubate overnight.
6. DAY TWO: Treat cells on day two with agonist, inhibitor or drug.
- If removing media, do very carefully. This is where most variation in data may occur.
- Final volume should be 100 μl per well.
7. DAY THREE: Add 20 μl of 5 mg/ml MTT to each well. Include one set of wells with MTT but no cells (control).
All should be done aseptically.
8. Incubate for 3.5 hours at 37oC in culture hood.
9. CAREFULLY Remove media. Do not disturb cells and do not rinse with PBS.
10. Add 150 μl MTT solvent.
11. Cover with tinfoil and agitate cells on orbital shaker for 15 min.
12. Read absorbance at 590 nm with a reference filter of 620 nm.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขั้นตอน:96 สั้นดี assay: ควรจะทำแต่ละเงื่อนไขใน triplicate หรือมากกว่า1. วันหนึ่ง: Trypsinize หนาว T 25 หนึ่ง และ ml 5 สื่อสมบูรณ์เพิ่มเซลล์ trypsinized เครื่องหมุนเหวี่ยงในการฆ่าเชื้อ15 ml หลอดเหยี่ยวที่ 500 รอบต่อนาทีในการควง bucked ใบพัด (~ 400 x g) ใน 5 นาที2. เอาสื่อ และ resuspend เซลล์ 1.0 ml กับสื่อเสร็จสมบูรณ์3. ตรวจนับ และบันทึกเซลล์ต่อมล.จำเอาเซลล์ aseptically เมื่อตรวจนับ4. เซลล์ DILUTE (cv = cv) เซลล์ 75000 ต่อ ml. ใช้ทำสื่อการ dilute เซลล์5. เพิ่ม μl 100 เซลล์ (เซลล์รวม 7500) ในแต่ละบ่อ และฟักข้ามคืน6. วันที่สอง: รักษาเซลล์สองวันกับอะโกนิสต์ สารยับยั้ง หรือยาเสพติด-ถ้าเอาออกสื่อ ไม่ระมัดระวัง ซึ่งส่วนใหญ่การเปลี่ยนแปลงในข้อมูลอาจเกิดขึ้นได้-สุดท้ายเสียงควร μl 100 ต่อดี7. วันที่สาม: μl เพิ่ม 20 ของ 5 mg/ml MTT จะดีละ รวมชุดของบ่อกับ MTT แต่เซลล์ไม่ (ควบคุม)ทั้งหมดควรทำ aseptically8. ฟัก 3.5 ชั่วโมงที่ 37oC ในฮูดวัฒนธรรม9. ระมัดระวังเอาสื่อ รบกวนเซลล์ และไม่ล้าง ด้วย PBS10. เพิ่มตัวทำละลาย MTT μl 15011. ครอบ tinfoil และกวนเซลล์ในเชคเกอร์ของวงโคจรสำหรับ 15 นาที12. อ่าน absorbance ที่ 590 nm มีตัวอ้างอิงของ 620 nm

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขั้นตอน:
สั้นทดสอบ 96 ดี: สภาพแต่ละคนควรจะทำในเพิ่มขึ้นสามเท่าหรือมากกว่า
1 วันแรก: Trypsinize หนึ่ง T-25 ขวดและเพิ่ม 5 ml ของสื่อที่สมบูรณ์เพื่อ trypsinized เซลล์ centrifuge ในการฆ่าเชื้อ
หลอดขนาด 15 มลเหยี่ยวที่ 500 รอบต่อนาทีในการแกว่งสุขโรเตอร์ (~ 400 XG) เป็นเวลา 5 นาที
2 นำสื่อและเซลล์แขวนลอยถึง 1.0 มลกับสื่อที่สมบูรณ์
3 นับและบันทึกเซลล์ต่อมิลลิลิตร โปรดจำไว้เพื่อขจัดเซลล์ในขวดทดลองเมื่อนับ
4 เจือจางเซลล์ (CV = CV) ถึง 75,000 เซลล์ต่อมิลลิลิตร ใช้สื่อที่สมบูรณ์ในการเจือจางเซลล์
5 เพิ่ม 100 ไมโครลิตรของเซลล์ (7500 เซลล์ทั้งหมด) ในแต่ละดีและฟักค้างคืน
6 วันที่สอง: การรักษาเซลล์ในวันที่สองที่มีตัวเอกยับยั้งหรือยาเสพติด
- หากถอดสื่อทำอย่างระมัดระวัง ซึ่งเป็นที่ที่การเปลี่ยนแปลงมากที่สุดในข้อมูลที่อาจเกิดขึ้น
- ปริมาณสุดท้ายควรจะเป็น 100 ไมโครลิตรต่อดี
7 วันที่สาม: เพิ่ม 20 ไมโครลิตรของ 5 mg / ml MTT กันดี รวมถึงชุดของหลุมที่มี MTT แต่ไม่มีเซลล์ (ควบคุม)
ทั้งหมดควรจะทำในขวดทดลอง
8 ฟัก 3.5 ชั่วโมงที่ 37oC ในวัฒนธรรมเครื่องดูดควัน
9 อย่างเอาสื่อ ไม่รบกวนเซลล์และไม่ได้ล้างออกด้วยพีบีเอส
10 เพิ่ม 150 ไมโครลิตร MTT ตัวทำละลาย
11 ครอบคลุมกับฟอยล์และรณรงค์เซลล์บนเครื่องปั่นโคจรเป็นเวลา 15 นาที
12 อ่านดูดกลืนแสงที่ 590 นาโนเมตรที่มีตัวกรองการอ้างอิงของ 620 นาโนเมตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอน :
สั้น 96 ดี ) : แต่ละภาพควรทำทั้งสามใบหรือมากกว่า .
1 วันที่หนึ่ง : t-25 trypsinize หนึ่งขวดและเพิ่ม 5 ml ของสื่อที่สมบูรณ์เพื่อ trypsinized เซลล์ ซึ่งในการฆ่าเชื้อ
15 ml ฟอลคอนหลอด 500 รอบต่อนาที ในควง bucked ใบพัด ( ~ 400 x G ) 5 นาที
2 เอาสื่อและ resuspend เซลล์ 1.0 มิลลิลิตรกับสื่อสมบูรณ์ .
3 นับและบันทึกเซลล์ต่อมิลลิลิตรอย่าลืมเอาเซลล์ aseptically เมื่อนับ .
4 เจือจางเซลล์ ( CV = CV ) 75 , 000 เซลล์ต่อมิลลิลิตร ใช้สื่อสมบูรณ์เพื่อเจือจางเซลล์ .
5 เพิ่ม 100 μ L เซลล์ ( เซลล์รวม 7 ) ในแต่ละดีและพักค้างคืน .
6 วันที่สอง : เลี้ยงเซลล์ในวันที่ สอง ด้วยเวลาใช้ยา , หรือ .
- ถ้าเอาสื่อ ทำอย่างระมัดระวัง นี่คือที่เปลี่ยนแปลงมากที่สุดในข้อมูลที่อาจเกิดขึ้น .
เล่มสุดท้าย ควรμลิตรต่อ 100 .
7 วันที่สาม : เพิ่ม 20 μ L 5 mg / ml MTT แต่ละอย่างดี รวมชุดหนึ่งของบ่อด้วย MTT แต่ไม่มีเซลล์ ( ควบคุม ) .
ทั้งหมดควรจะทำ aseptically .
8 ฟักไข่ 3.5 ชั่วโมงในเครื่องดูดควัน 37oc วัฒนธรรม .
9 อย่างออกสื่อ อย่ารบกวนเซลล์และไม่ล้างด้วย pbs .
10 เพิ่ม 150 μ L MTT ตัวทำละลาย .
11คลุมด้วยแผ่นฟอยล์ป่วนเซลล์ต่างโคจร 15 นาที
12 อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 590 nm ด้วยการอ้างอิงกรอง 620 นาโนเมตร