Generation of recombinant NDV virus

Generation of recombinant NDV viruses expressing wild-type and mutant HA genes of H5N1 avian influenza virus.We constructed an infectious clone of NDV LaSota by assembling ten overlapping PCR fragments and inserting the 15,186 nucleotides of NDV LaSota and the sequences of the T7 polymerase promoter, HDV ribozyme, and T7 polymerase terminator into the plasmid pBR322. The wild-type and mutated HA genes of H5N1 AIV were inserted between the P and M genes of the NDV cDNA (Fig. 1A). The resultant recombinant viruses, rLa-H5w and rLa-H5m, were rescued from the cDNA as described in Materials and Methods, and the presence of the HA gene was confirmed by RT-PCR. Expression of influenza virus H5 HA by rLa-H5w and rLa-H5m was confirmed by immunostaining infected BHK-21 cells 28 h p.i. As expected, cells infected with rLa were not stained by chicken antisera to H5 AIV HA protein, but they were positive for immunostaining using chicken polyclonal antisera against NDV (Fig. 1B). In contrast, cells infected with rLa-H5w or rLa-H5m were stained by chicken antisera to H5 AIV HA protein as well as the anti-NDV antiserum. The expression of wild-type and mutant HA protein by the recombinant viruses was also confirmed by Western analysis. As shown in Fig. 1C, the majority of wild-type HA protein expressed by rLa-H5w was cleaved, while large amounts of the mutant HA protein lacking the cleavage site expressed by rLa-H5m was uncleaved.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การสร้างไวรัส NDV recombinant แสดงยีน HA ชนิดป่า และการกลายพันธุ์ของไวรัสไข้หวัดนก H5N1 เราสามารถสร้างโคลนติดเชื้อของ NDV LaSota โดยประกอบสิบเศษ PCR ที่ทับซ้อน และแทรกนิวคลีโอไทด์ 15,186 ของ NDV LaSota และลำดับของโปรโมเตอร์พอลิเมอเรส T7 ไรโบไซม์ HDV และเทอร์มิเนเตอร์พอลิเมอเรส T7 ใน plasmid pBR322 ชนิดของป่า และกลายพันธุ์ยีน HA ของ H5N1 AIV ถูกแทรกระหว่าง P และ M ยีนของ cDNA NDV (รูปที่ 1A) ไวรัส recombinant resultant, rLa H5w และ rLa-H5m มีการช่วยเหลือจาก cDNA วัสดุและวิธีการ และยืนยันการมีอยู่ของยีน HA การ RT-PCR ติดเชื้อของไข้หวัดใหญ่ไวรัส H5 ฮา rLa H5w และ rLa H5m ยืนยัน immunostaining p.i. 28 h เซลล์ BHK-21 ตามที่คาดไว้ เซลล์ที่ติดเชื้อ rLa ถูกย้อม โดย antisera ไก่ปริมาณโปรตีน H5 AIV ฮา แต่พวกเขาก็บวกสำหรับใช้กับ NDV (รูปที่ 1B) antisera โพลีแอนติไก่ immunostaining ตรงกันข้าม ภาพเซลล์ที่ติดเชื้อ rLa H5w หรือ rLa H5m antisera ไก่ปริมาณโปรตีน H5 AIV ฮา เป็น antiserum NDV ป้องกัน นิพจน์ของป่าชนิดและโปรตีน HA โดยไวรัส recombinant กลายพันธุ์ยังได้รับการยืนยัน โดยการวิเคราะห์แบบตะวันตก ดังแสดงในรูป 1C ถูกแบ่งออกส่วนใหญ่ของป่าชนิดโปรตีน HA ที่แสดง โดย rLa H5w ในขณะที่จำนวนมากของโปรตีน HA กลายพันธุ์ ขาดไซต์ความแตกแยกที่แสดง โดย rLa H5m เป็น uncleaved

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

รุ่นของไวรัส NDV recombinant แสดงชนิดป่าและยีน HA กลายพันธุ์ของโรคไข้หวัดนกสายพันธุ์ H5N1 virus.We สร้างโคลนติดเชื้อของ NDV Lasota โดยการรวบรวมสิบเศษทับซ้อนกัน PCR และใส่ 15186 นิวคลีโอของ NDV Lasota และลำดับของโปรโมเตอร์ T7 โพลิเมอร์, HDV ribozyme และ T7 โพลิเมอร์ Terminator เข้า pBR322 พลาสมิด The-ชนิดป่าและการกลายพันธุ์ของยีนฮ่า H5N1 AIV ถูกแทรกระหว่างยีน P และ M ของ NDV ยีน (รูป. 1A) ไวรัส recombinant ผลลัพธ์ RLA-H5w และ RLA-H5m, ได้รับการช่วยเหลือจากยีนที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการและการปรากฏตัวของยีน HA รับการยืนยันโดย RT-PCR การแสดงออกของเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ H5 HA โดย RLA-H5w และ RLA-H5m รับการยืนยันจากการย้อมติดติดเชื้อ BHK-21 เซลล์ 28 ชั่วโมง Pi เป็นที่คาดหวังเซลล์ที่ติดเชื้อกับ RLA ไม่ได้ย้อมสีโดยการฉีดไก่ H5 AIV HA โปรตีน แต่พวกเขาก็บวกสำหรับ การย้อมติดโดยใช้ฉีดโพลีไก่กับ NDV (รูปที่ 1B.) ในทางตรงกันข้ามกับเซลล์ที่ติดเชื้อ RLA-H5w หรือ RLA-H5m มีการย้อมโดยการฉีดไก่ H5 AIV HA โปรตีนเช่นเดียวกับการป้องกัน NDV antiserum การแสดงออกของชนิดป่าและมนุษย์กลายพันธุ์โปรตีน HA โดยไวรัส recombinant ยังได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ตะวันตก ดังแสดงในรูป 1C ส่วนใหญ่ของป่าประเภท HA โปรตีนแสดงออกโดย RLA-H5w ที่ถูกตัดในขณะที่จำนวนมากของการกลายพันธุ์ HA โปรตีนขาดความแตกแยกเว็บไซต์แสดงโดย RLA-H5m เป็น uncleaved

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสร้างรีคอมบิแนนท์ ndv ไวรัสกลายพันธุ์ของยีนและการแสดงออกของฮาเชื้อไวรัสไข้หวัดนก H5N1 ติดเชื้อ เราสร้างโคลนของ ndv lasota โดยประกอบชิ้นส่วนและการแทรกซ้อนกันร่วมสิบ 15186 นิวคลีโอไทด์ของ ndv lasota และลำดับของการส่งเสริมการขาย * * 3 * * 3 , HDV ไรโบไซม์และใช้ใน pbr322 terminator พลาสมิด ของและกลายพันธุ์ของยีนดังกล่าว aiv ฮาถูกแทรกระหว่าง P และ M ndv cDNA ของยีน ( รูปที่ 1A ) ซึ่งเป็นโปรตีนที่ไวรัส และ rla-h5w rla-h5m , ได้รับการช่วยเหลือจาก cDNA ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุ และวิธีการ และการปรากฏตัวของฮายีนที่ได้รับการยืนยันโดย RT-PCR . การแสดงออกของไวรัสไข้หวัดใหญ่ h5 ฮาโดย rla-h5w rla-h5m และได้รับการยืนยันโดย immunostaining เซลล์ติดเชื้อ bhk-21 28 H PI ตามที่คาดไว้ เซลล์ที่ติดเชื้อถูกย้อมด้วยแอนติ RLA ไม่ไก่ h5 aiv ฮาโปรตีน แต่พวกเขาเป็นบวกสำหรับ immunostaining ใช้ไก่ใช้แอนติกับ ndv ( รูปที่ 1A ) ในทางตรงกันข้าม เซลล์ที่ติดเชื้อถูกย้อมด้วยแอนติ rla-h5w หรือ rla-h5m ไก่ h5 aiv ฮาโปรตีน รวมทั้งต่อต้าน ndv แอนติ . การแสดงออกของโปรตีนกลายพันธุ์และฮาโดยไวรัส recombinant ยังได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์แบบตะวันตก ดังแสดงในรูปที่ 1 ซี ส่วนใหญ่ของโปรตีนที่แสดงออกโดย rla-h5w ฮาคือเป็นจำนวนมากในขณะที่โปรตีนกลายพันธุ์ฮาขาดการเว็บไซต์ที่แสดงออกโดย rla-h5m คือ uncleaved .