All solutions were prepared using M

All solutions were prepared using Millipore MilliQ water and all reagents were of the highest purity commercially available. Tris, trichloroacetic acid, ATP ditris salt, phosphoenolpyruvate (PEP), NADH, imidazole, N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N′-ethanesulfonic acid (Hepes), lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate kinase (PK), alamethicin, bafilomycin A1 and sodium orthovanadate were from Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Dimethyl sulfoxide and triethanolamine were from Merck (Darmstadt, Germany), and the protease inhibitor cocktail (1 mmol L− 1 benzamidine, 5 μmol L− 1 antipain, 5 μmol L− 1 leupeptin and 1 μmol L− 1 pepstatin A) was from Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA). Preparation of stock solutions of ATP and removal of ammonium ions from crystalline suspensions of PK and LDH, were performed as described by Santos et al. (2007). Crystalline suspensions of PK and LDH were centrifuged at 10,000x at 4 °C for 15 min in a Hermle Z326K refrigerated centrifuge. The pellet was resuspended in 300 μL of 50 mmol L− 1 Hepes buffer, pH 7.5, transferred to a YM-10 Microcon filter and washed 5 times with the same buffer at 10,000x at 4 °C for 15 min each until complete removal of ammonium ions (tested using the Nessler reagent). Finally, the pellet was resuspended in the original volume. Stock solutions of sodium orthovanadate and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) were prepared according to Furriel et al. (2000).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โซลูชั่นทั้งหมดได้ถูกเตรียมใช้น้ำ MilliQ มาก และ reagents ทั้งหมดอยู่ที่ความบริสุทธิ์สูงสุดที่ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ ทริสเรทติ้ง trichloroacetic กรด เกลือ ditris ATP, phosphoenolpyruvate (PEP), NADH อิมิดาโซล กรด piperazine N′ ethanesulfonic N-(2-hydroxyethyl) (Hepes), lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate kinase (PK), alamethicin, bafilomycin A1 และโซเดียม orthovanadate ได้จาก บริษัทเคมี Aldrich ซิก (St Louis, MO สหรัฐอเมริกา) Dimethyl sulfoxide และ triethanolamine ได้จากเมอร์ค (ดาร์มส เยอรมนี), และการรติเอสเตอร์ค็อกเทล (1 mmol L− 1 benzamidine, antipain μmol L− 1 5, 5 leupeptin μmol L− 1 และ μmol 1 L− 1 pepstatin A) ได้จาก Calbiochem (Gibbstown, NJ สหรัฐอเมริกา) เตรียมแก้ไขปัญหาสต็อกของ ATP และกำจัดประจุแอมโมเนียจากบริการผลึกของ PK และ LDH ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย Santos et al. (2007) บริการผลึกของ PK และ LDH ได้ centrifuged ที่ 10000 x ที่ 4 ° C สำหรับ 15 นาทีในเครื่องหมุนเหวี่ยงควบคุมอุณหภูมิ Hermle Z326K เม็ดถูก resuspended ใน μL 300 50 บัฟเฟอร์ L− 1 Hepes mmol, pH 7.5 โอนย้ายไปที่ตัวกรอง Microcon YM-10 และล้างครั้งที่ 5 ด้วยบัฟเฟอร์ที่ 10000 x ที่ 4 ° C สำหรับ 15 นาทีเดียวละจนกระทั่งสมบูรณ์กำจัดประจุแอมโมเนีย (ทดสอบโดยใช้รีเอเจนต์ Nessler) สุดท้าย เม็ดถูก resuspended ในไดรฟ์ข้อมูลต้นฉบับ หุ้นโซลูชั่น orthovanadate ของโซเดียมและ glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (G3P) เตรียมไว้ตาม Furriel et al. (2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โซลูชั่นทั้งหมดถูกจัดทำขึ้นโดยใช้น้ำค MilliQ และสารเคมีทุกคนของความบริสุทธิ์สูงสุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ ทริสกรดไตรคลอโรเกลือเอทีพี ditris, phosphoenolpyruvate (PEP) NADH, imidazole, N- (2-hydroxyethyl) piperazine n 'ethanesulfonic กรด (HEPES) นม dehydrogenase (LDH) ไคเนสไพรู (PK) alamethicin, สาร bafilomycin A1 และ orthovanadate โซเดียมจาก Sigma-Aldrich เคมี จำกัด (St Louis, MO, USA) Dimethyl sulfoxide และ triethanolamine มาจากเมอร์ค (Darmstadt, Germany) และยับยั้งเอนไซม์โปรติเอค๊อกเทล (1 มิลลิโมล L- 1 benzamidine 5 ไมโครโมล L- 1 antipain 5 ไมโครโมล L- 1 leupeptin และ 1 ไมโครโมล L- 1 pepstatin A) มาจาก Calbiochem (Gibbstown, NJ, สหรัฐอเมริกา) การเตรียมความพร้อมของการแก้ปัญหาสต็อกของเอทีพีและการกำจัดของแอมโมเนียมไอออนจากผลึกของสารแขวนลอย PK และ LDH, ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยซานโตสและอัล (2007) ผลึกของสารแขวนลอย PK และ LDH ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000x ที่ 4 ° C เป็นเวลา 15 นาทีในการหมุนเหวี่ยงตู้เย็น Hermle Z326K เม็ดถูก resuspended ใน 300 ไมโครลิตร 50 มิลลิโมล L- 1 HEPES บัฟเฟอร์ pH 7.5 ถ่ายโอนไปยังตัวกรอง Microcon YM-10 และล้าง 5 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์เดียวกันใน 10,000x ที่ 4 ° C เป็นเวลา 15 นาทีในแต่ละจนถึงการกำจัดที่สมบูรณ์ของ แอมโมเนียมไอออน (ทดสอบโดยใช้สาร Nessler) สุดท้ายเม็ดที่ถูก resuspended ในปริมาณเดิม การแก้ปัญหาสต็อกของ orthovanadate โซเดียมและ glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (G3P) ได้รับการจัดทำขึ้นตาม Furriel et al, (2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โซลูชั่นทั้งหมดเตรียมการใช้น้ำและสารเคมีมิลลิ milliq มีความบริสุทธิ์สูงสุดในเชิงพาณิชย์ นอกจากนี้กรดไตรคลอโรอะซิติก เกลือ ditris เอทีพีฟอสโฟอีนอลไพรูเวต ( PEP ) , NADH อิมิดาโซล , เอ็น - ( 2-hydroxyethyl ) piperazine-n ’ - ethanesulfonic acid ( ฮีเปส ) , lactate dehydrogenase ( LDH ) Pyruvate kinase ( PK ) ลาเมตทิซิน , ,bafilomycin A1 และโซเดียม orthovanadate จากซิกม่า Aldrich Chemical Co . ( เซนต์ หลุยส์ , โม , USA ) ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ และไตรเ ทาโนลามีนจากเมอร์ค ( ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) , และ protease inhibitor ค็อกเทล ( 1 มิลลิโมล L − 1 benzamidine 5 μโมล L − 1 antipain 5 μโมล L − 1 ลูเพปตินและ 1 μโมล L − 1 pepstatin ) จาก calbiochem ( gibbstown , NJ , USA )การเตรียมการของหุ้นโซลูชั่นของ ATP และกำจัดไอออนของแอมโมเนียจากผลึกและสารแขวนลอยของ PK LDH , มีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้โดยซานโตส et al . ( 2007 ) รับน้ำหนักของผลึกและเป็นระดับที่ 10000x PK หลังที่ 4 ° C เป็นเวลา 15 นาที ใน z326k เฮอร์เมิลเหวี่ยงเย็น . เม็ดเป็น resuspended 300 μ L 50 มิลลิโมล L − 1 ฮีเปส บัฟเฟอร์ พีเอช 7.5 ,ย้ายไป ym-10 microcon กรองและล้าง 5 ครั้งกับบัฟเฟอร์เดียวกันที่ 10000x 4 ° C เป็นเวลา 15 นาที จนถึงการกำจัดที่สมบูรณ์ของแต่ละไอออนแอมโมเนียม ( ทดสอบโดยใช้เนสเลอร์ Reagent ) ในที่สุด อาหารเม็ดก็ resuspended ในปริมาณเดิม หุ้นโซลูชั่นของ orthovanadate โซเดียมและ glyceraldehyde-3-phosphate ( g3p ) เตรียมได้จาก furriel et al . ( 2000 )