The tet-responsive APP transgenic l

The tet-responsive APP transgenic line 102 (tetO-APPswe/ind 102; MMRRC stock # 034845-JAX; Jankowsky et al., 2005) and the tet-activator line B CaMKIIα-tTA (Jackson Laboratories #3010; Mayford et al., 1996) were independently backcrossed to C57BL/6J for >25 generations before being intercrossed for these studies. The resulting double transgenic male offspring were then mated with wild-type FVB females to produce experimental cohorts on a FVBB6 F1 background.

Dox administration.
All mice used in this study were raised on dox to suppress transgene expression during postnatal development. We have previously shown this strategy to ameliorate locomotor hyperactivity and normalize body weight of double transgenic animals, permitting reliable cognitive testing (Rodgers et al., 2012). Offspring were started on dox 1–3 d after birth by placing nursing mothers on medicated chow, formulated to 50 mg/kg dox (Purina Mills TestDiet #5APL). At weaning, mice were maintained on dox until 6 weeks of age (Purina Mills TestDiet #5SBA).

All mice were returned to regular chow for the following 6 months, allowing APP/tetracycline transactivator (TTA) animals to develop a moderate amyloid load. To test the potential cognitive benefit of short-term APP suppression, at 7.5 months half of the mice were treated with dox for 2 weeks before behavioral testing and were maintained on dox until harvest.

During the course of this study, we discovered that the lot of chow we had purchased for postnatal treatment provided submaximal transgene suppression (80% suppression rather than the 90–95% we expected at this dose), so therapeutic administration at 7.5 months was done by administering dox in the drinking water at a dose of 50 μg/ml supplemented with 5% sucrose to mask the bitter taste.

GSI administration.
A separate cohort of age-matched mice that had also expressed transgenic APP for 6 months was treated with GSI to confirm that behavioral recovery attained by transgene suppression with dox was due to reduction of Aβ. LY411575 was administered either in drinking water at a concentration of 40 μg/ml (GSI stock dissolved at 100 mg/ml in DMSO/ethanol to yield a working solution containing 1% DMSO and 0.8% ethanol) or through the chow at a concentration of 25 mg/kg (BioServ Rodent Diet #156166), in both cases to deliver an estimated dose of 5 mg/kg/d. Behavioral analysis began 5 d after treatment started.

Behavioral assays
Behavioral testing began at 8 months of age and included open field, Morris water maze (MWM), radial arm water maze (RAWM), and contextual fear conditioning (CFC). Animals were handled for 3 d before the start of behavioral testing. Locomotor activity was assessed on day 1, followed by MWM training on days 2–10, and RAWM training on day 11. Mice were allowed a 2 d rest period before fear conditioning training on day 14, which was followed by a retention test 24 h later. All animal experiments were reviewed and approved by the Baylor College of Medicine Institutional Care and Use Committee.

Open-field assessment.
Locomotor activity was assessed in white acrylic open-top boxes (46 × 46 × 38 cm) in a room lit by indirect white light. Activity was recorded for 30 min and analyzed using the ANY-maze Video Tracking System (Stoelting).

MWM.
MWM testing was conducted in a circular tank measuring 58 cm high and 122 cm in diameter. The water level was 20 cm from the top of the tank and made opaque using nontoxic white paint. Water temperature was maintained between 21 and 23°C. The room was lit with indirect white light and trials were recorded and tracked using ANY-maze Video Tracking System.

Before the start of acquisition training, mice received 1 d of training in a straight swim channel to acclimate them to the water and check for motor deficits. Mice received eight trials with a 15 min intertrial interval (ITI) in a channel constructed of white acrylic and measuring 107 × 56 ×14 cm, which was placed in the center of pool. Visible cues were removed from the room during straight swim shaping trials. Mice were allowed 60 s to reach a submerged platform on the opposite side of the channel. Mice that failed to reach the platform were guided to the location by the experimenter. Mice were allowed to stay on the platform for 15 s before being removed from the water, dried, and returned to their home cage under an infrared lamp between trials.

Acquisition training in the MWM consisted of four trials per day with a 15 min ITI. Each training session ended with a short-term memory probe. A square platform (10 × 10 cm) covered in nylon mesh for traction was located 1 cm below the surface in the NE quadrant of the maze, half way between the side and the center of the pool. Mice were placed in the maze facing the wall at each of four cardinal start locations and allowed 60 s to locate the hidden platform. As with straight swim, animals that failed to locate the platform in the allotted time were gently guided there by the experimenter. Mice were allowed to stay on the platform for 15 s before being returned to their home cage between trials. Following the 4 training trials, the platform was removed from the maze for an immediate probe trial. Animals were placed in the tank half way between the cardinal points (SW, NW, SE, and NE) and allowed 45 s to navigate the maze. Proximity to target, percentage time, and percentage path spent in each quadrant were calculated along with the number of times the animal crossed the platform location compared with the other three potential platform locations (in the SW, NW, and SE quadrants). Mice were trained to a performance criterion during probe trials of ≥35% path in the correct quadrant and at least 40% of total platform crossings over the correct site compared with other possible platform locations.

When mice reached criterion, they were retired from further MWM training, but given a final long-term memory probe 24 h after reaching criterion. Mice were trained for a maximum of 7 d. After all mice either reached criterion or completed 7 d of training, each was given one additional “refresher” day of training (four trials) with probe test to ensure equivalent performance between groups before starting RAWM training. During this refresher training, performance in our cohorts was identical both between genotypes (F(2,52) = 0.34, p > 0.05) and treatment groups (F(1,52) = 0.74, p > 0.05). Thus, this procedure ensured that all mice were trained to a similar performance level before moving onto RAWM testing in the same room.

RAWM.
The day following MWM refresher training, mice received 1 d of RAWM training consisting of eight trials with a 15 min ITI. The RAWM was created by installing clear Plexiglas triangular inserts into the existing water maze pool (41.25 cm on each side × 50 cm high), which resulted in six open arms joined at the center. Each arm measured 20 cm wide × 34 cm long, and the water was maintained at a depth of 38 cm. The platform was located 3 cm from the end of one arm and submerged 1 cm below the water's surface. Mice were placed into a different arm at the beginning of each trial, with the order of starting positions pseudorandomly selected before training such that no trial began in an arm adjacent to the previous start position. Mice were allowed 60 s to navigate the maze. If a mouse failed to locate the platform in the allotted time, it was gently guided to there by the experimenter and allowed to remain on the platform for 15 s before being returned to its home cage between trials. Latency to locate the platform, swim path length, and number of working memory errors (re-entries into a previously visited arm) were calculated for each trial. Trial 1 scores were excluded from analysis due to the inflated error rate as animals learned the new procedure. Data from trials 2–8 was averaged to provide a performance index for overall RAWM learning. After the final training trial, animals were tested with a short-term probe trial in which the platform was removed and animals were allowed 45 s to navigate the maze. Percentage time and path spent in the target arm were calculated and compared among treatment groups.

CFC.
Two days after RAWM testing, mice were trained in CFC using a near-infrared video fear conditioning system (Med Associates). Conditioning boxes (30.5 × 24 × 21 cm) with a stainless steel grid floor were located inside sound-attenuating chambers and indirectly lit from above. Movement was recorded by a video camera mounted inside the sound-attenuating chamber and analyzed using Video Freeze software (Med Associates). Motion threshold was set to 19 arbitrary units (a.u.) and the minimum freeze duration to 1 s. Chambers and grid floors were cleaned with a 20% ethanol solution after each trial.

During conditioning, mice were allowed to freely explore the chambers for 2 min before receiving a 1 s 0.8 mA footshock. After a 2 min interval, mice received a second 1 s 0.8 mA footshock. Mice remained in the chamber for 1 min after second footshock before being returned to their home cage. Twenty-four hours later, animals were returned to the same conditioning box for a 5 min retention test. The duration of immobility was recorded and used as an index of learning.

Tissue harvest
One week after behavioral testing was completed, mice were killed by sodium pentobarbital overdose and transcardially perfused with ice-cold PBS containing 10 μg/ml heparin. Brains were removed and hemisected along the midline. One hemisphere was dissected to isolate the cortex and hippocampus, which were snap frozen for biochemistry, and the other hemisphere was immersion fixed in 4% PFA at 4°C for 48 h. Brains were cryoprotected in 30% sucrose at 4°C. Tissue was sectioned at 35 μm in the sagittal plane using a freezing sliding microtome, then stored in cryoprotectant (0.1 m phosphate buffer, pH 7.4, 30% ethylene glycol, and 25% glycerol) at −20°C until use.

Histology
Campbell–Switzer si

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตอบสนอง tet APP ถั่วเหลืองบรรทัด 102 (tetO-APPswe/ind 102 034845 #หุ้น MMRRC แจ๊กซ์เท Jankowsky et al., 2005) และ tet-activator เส้น B CaMKIIα-tTA (Jackson ปฏิบัติ #3010 Mayford et al., 1996) backcrossed ได้อย่างอิสระเพื่อ C57BL/6J สำหรับ > 25 รุ่นก่อน intercrossed การศึกษาเหล่านี้ ผลคู่ถั่วเหลืองชายลูกหลานได้แล้ว mated กับหญิง FVB ป่าชนิดผลิต cohorts ทดลองบนพื้น FVBB6 F1Dox จัดการหนูทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ขึ้นบน dox บีฑา transgene นิพจน์ในระหว่างการพัฒนา postnatal อนุญาตให้น่าเชื่อถือรับรู้ทดสอบ (ร็อดเจอร์ส et al., 2012) ถ้าเราแสดงกลยุทธ์นี้ ameliorate locomotor เข้าร่องเข้ารอย และปกติน้ำหนักตัวของสัตว์ถั่วเหลืองคู่ ได้ก่อนหน้านี้ ลูกหลานก็เริ่ม dox d 1-3 หลังคลอดโดยทำการพยาบาลมารดาในครัวจำหน่าย ส่วน dox 50 mg/kg (Purina ลัอ TestDiet #5APL) ในการ weaning หนูถูกจัดอยู่ใน dox จนถึง 6 สัปดาห์อายุ (Purina ลัอ TestDiet #5SBA)หนูทั้งหมดมีการส่งคืนเพื่อรับประทานปกติสำหรับ 6 เดือนต่อไปนี้ ให้สัตว์ transactivator (TTA) APP/เตตราไซคลีน พัฒนาโหลดแอมีลอยด์ปานกลาง การทดสอบการรับรู้ประโยชน์ศักยภาพของ APP ปราบปรามระยะสั้น ที่ 7.5 เดือนครึ่งหนึ่งของหนูได้รับการรักษา ด้วย dox 2 สัปดาห์ก่อนการทดสอบพฤติกรรม และถูกรักษาไว้บน dox จนถึงเก็บเกี่ยวในระหว่างการศึกษานี้ เราค้นพบว่า จำนวนมากของชาวเราซื้อมาสำหรับรักษา postnatal ให้ปราบปราม submaximal transgene (ปราบปราม 80% มากกว่า 90 – 95% เราคาดว่าที่ยานี้), เพื่อให้ดูแลรักษาที่ 7.5 เดือนถูกทำ โดยจัดการ dox ในน้ำดื่มในปริมาณ 50 μg/ml เสริม ด้วย 5% ซูโครสกับหน้ากากรสขมGSI จัดการผู้ผ่านแยกของหนูตรงกับอายุที่ยังมีแสดง APP ถั่วเหลือง 6 เดือนถูกรักษา ด้วย GSI เพื่อยืนยันว่า พฤติกรรมกู้ได้ปราบปราม transgene กับ dox ได้เนื่องจากการลดลงของ Aβ LY411575 ได้รับการดูแลทั้งในน้ำดื่มที่ความเข้มข้นของ μg 40 ml (GSI หุ้นส่วนยุบที่ 100 mg/ml ใน DMSO/เอ ทานอลเพื่อหาโซลูชันทำ DMSO 1% และ 0.8% เอทานอล) หรือครัวที่เข้มข้น 25 มิลลิกรัม/กิโลกรัม (BioServ หนูอาหาร #156166), ในทั้งสองกรณีจะส่งมอบยาการประเมินของ 5 มก./กก./d. วิเคราะห์พฤติกรรมเริ่มใหม่หลังจากการเริ่มต้นรักษาพฤติกรรม assaysการทดสอบพฤติกรรมเริ่มที่อายุ 8 เดือน และรวมฟิลด์เปิด เขาวงกตน้ำมอร์ริส (MWM), เขาวงกตน้ำแขนรัศมี (RAWM), และความกลัวตามบริบทที่ปรับ (CFC) สัตว์ถูกจัดการสำหรับ 3 d ก่อนเริ่มทดสอบพฤติกรรม กิจกรรม locomotor ถูกประเมินในวันที่ 1 ตาม ด้วย MWM อบรมวันที่ 2 – 10 และ RAWM ฝึกอบรมวันที่ 11 หนูได้รับอนุญาตช่วงเวลาเหลือ 2 d ก่อนกลัวปรับอบรมวันที่ 14 ซึ่งด้วยการทดสอบเก็บข้อมูล 24 ชมในภายหลัง สัตว์ทดลองทั้งหมดถูกตรวจทาน และอนุมัติ โดย Baylor วิทยาลัยของแพทย์สถาบันดูแลและใช้คณะกรรมการเปิดเขตการตรวจประเมินกิจกรรม locomotor ถูกประเมินในสีขาวอะครีลิคกล่องเปิดด้านบน (46 × 46 × 38 ซม.) ในห้องสว่าง ด้วยแสงทางอ้อมขาว กิจกรรมบันทึกใน 30 นาที และวิเคราะห์โดยใช้เขาวงกตได้วิดีโอติดตามระบบ (Stoelting)MWMMWM ทดสอบถูกดำเนินในถังกลมที่วัดสูง 58 ซม.และเส้นผ่าศูนย์กลาง 122 ซม. ระดับน้ำได้ 20 ซม.จากด้านบนของถัง และทำการใช้พิษทั้งสีขาวทึบ มีรักษาอุณหภูมิน้ำระหว่าง 21 และ 23 ° c ห้องที่สว่าง ด้วยแสงทางอ้อมขาว และทดลองบันทึก และติดตามการใช้ระบบการติดตามวิดีโอเขาวงกตได้ก่อนเริ่มฝึกอบรมซื้อ หนูรับ d 1 ของการฝึกอบรมในช่องว่ายน้ำตรง acclimate ให้น้ำ และตรวจสอบมอเตอร์ขาดดุล หนูได้รับทดลองแปดกับช่วงเวลา 15 นาที intertrial (ตัล) ในช่องของอะครีลิคสีขาว และวัด 107 × 56 × 14 ซม. ซึ่งถูกวางไว้ในศูนย์กลางของสระว่ายน้ำ สัญลักษณ์ที่มองเห็นได้ถูกเอาออกจากพักในระหว่างการทดลองการสร้างรูปร่างว่ายน้ำตรง หนูได้รับอนุญาต 60 s ถึงแพลตฟอร์มน้ำท่วมฝั่งตรงข้ามของสถานี หนูที่ไม่สามารถเข้าถึงแพลตฟอร์มได้แนะนำไปยังตำแหน่ง โดยที่ experimenter หนูได้รับอนุญาตให้อยู่บนแพลตฟอร์ม 15 s ก่อนที่จะถูกเอาออกจากน้ำ แห้ง และกลับสู่กรงบ้านของพวกเขาภายใต้หลอดไฟอินฟราเรดการระหว่างการทดลองซื้อการฝึกอบรมใน MWM ประกอบด้วยการทดลอง 4 ต่อวัน 15 นาทีตัล เซสชันการฝึกอบรมแต่ละสิ้นสุดกับโพรบเป็นหน่วยความจำระยะสั้น เวทีขนาด (10 × 10 ซม.) ครอบคลุมตาข่ายไนล่อนสำหรับลาก 1 ซ.ม.อยู่ใต้ผิวหนังในควอดร้อนท์ NE ของเขาวงกต ครึ่งทางระหว่างด้านข้างของสระว่ายน้ำได้ หนูอยู่ในเขาวงกตที่หันหน้าเข้าหาผนังในแต่ละตำแหน่งเริ่มต้นที่คาร์ดินัลสี่ และอนุญาต 60 s หาแพลตฟอร์มซ่อน เป็นกับว่ายน้ำตรง สัตว์ที่ล้มเหลวในการค้นหาแพลตฟอร์มในเวลาที่กำหนด ได้เบา ๆ แนะนำมี โดย experimenter ที่ หนูได้รับอนุญาตให้อยู่บนแพลตฟอร์ม 15 s ก่อนที่จะถูกส่งกลับไปกรงภายในบ้านของพวกเขาระหว่างการทดลอง ต่อไปนี้ทดลองฝึกอบรม 4 แพลตฟอร์มถูกเอาออกจากเขาวงกตสำหรับทดลองการโพรบทันที สัตว์ที่ถูกเก็บไว้ในถังครึ่งทางระหว่างจุดสำคัญ (SW, NW, SE และ NE) และอนุญาต 45 s ไปเขาวงกต เป้าหมาย เวลาเปอร์เซ็นต์ และเส้นทางเปอร์เซ็นต์ใช้ในควอดร้อนท์ละถูกคำนวณ ด้วยจำนวนครั้งที่สัตว์ข้ามแพลตฟอร์มตำแหน่งเปรียบเทียบกับที่สามเป็นเวทีสถานอื่น ๆ (ใน SW, NW, SE quadrants) หนูได้ฝึกให้เกณฑ์ประสิทธิภาพระหว่างทดลองโพรบ ≥35 เส้นทาง%ในควอดร้อนท์ถูกต้องและข้ามแพลตฟอร์มรวมที่ 40% ผ่านเว็บไซต์ถูกต้องเปรียบเทียบกับตำแหน่งอื่น ๆ แพลตฟอร์มได้When mice reached criterion, they were retired from further MWM training, but given a final long-term memory probe 24 h after reaching criterion. Mice were trained for a maximum of 7 d. After all mice either reached criterion or completed 7 d of training, each was given one additional “refresher” day of training (four trials) with probe test to ensure equivalent performance between groups before starting RAWM training. During this refresher training, performance in our cohorts was identical both between genotypes (F(2,52) = 0.34, p > 0.05) and treatment groups (F(1,52) = 0.74, p > 0.05). Thus, this procedure ensured that all mice were trained to a similar performance level before moving onto RAWM testing in the same room.RAWM.The day following MWM refresher training, mice received 1 d of RAWM training consisting of eight trials with a 15 min ITI. The RAWM was created by installing clear Plexiglas triangular inserts into the existing water maze pool (41.25 cm on each side × 50 cm high), which resulted in six open arms joined at the center. Each arm measured 20 cm wide × 34 cm long, and the water was maintained at a depth of 38 cm. The platform was located 3 cm from the end of one arm and submerged 1 cm below the water's surface. Mice were placed into a different arm at the beginning of each trial, with the order of starting positions pseudorandomly selected before training such that no trial began in an arm adjacent to the previous start position. Mice were allowed 60 s to navigate the maze. If a mouse failed to locate the platform in the allotted time, it was gently guided to there by the experimenter and allowed to remain on the platform for 15 s before being returned to its home cage between trials. Latency to locate the platform, swim path length, and number of working memory errors (re-entries into a previously visited arm) were calculated for each trial. Trial 1 scores were excluded from analysis due to the inflated error rate as animals learned the new procedure. Data from trials 2–8 was averaged to provide a performance index for overall RAWM learning. After the final training trial, animals were tested with a short-term probe trial in which the platform was removed and animals were allowed 45 s to navigate the maze. Percentage time and path spent in the target arm were calculated and compared among treatment groups.CFC.Two days after RAWM testing, mice were trained in CFC using a near-infrared video fear conditioning system (Med Associates). Conditioning boxes (30.5 × 24 × 21 cm) with a stainless steel grid floor were located inside sound-attenuating chambers and indirectly lit from above. Movement was recorded by a video camera mounted inside the sound-attenuating chamber and analyzed using Video Freeze software (Med Associates). Motion threshold was set to 19 arbitrary units (a.u.) and the minimum freeze duration to 1 s. Chambers and grid floors were cleaned with a 20% ethanol solution after each trial.During conditioning, mice were allowed to freely explore the chambers for 2 min before receiving a 1 s 0.8 mA footshock. After a 2 min interval, mice received a second 1 s 0.8 mA footshock. Mice remained in the chamber for 1 min after second footshock before being returned to their home cage. Twenty-four hours later, animals were returned to the same conditioning box for a 5 min retention test. The duration of immobility was recorded and used as an index of learning.Tissue harvestOne week after behavioral testing was completed, mice were killed by sodium pentobarbital overdose and transcardially perfused with ice-cold PBS containing 10 μg/ml heparin. Brains were removed and hemisected along the midline. One hemisphere was dissected to isolate the cortex and hippocampus, which were snap frozen for biochemistry, and the other hemisphere was immersion fixed in 4% PFA at 4°C for 48 h. Brains were cryoprotected in 30% sucrose at 4°C. Tissue was sectioned at 35 μm in the sagittal plane using a freezing sliding microtome, then stored in cryoprotectant (0.1 m phosphate buffer, pH 7.4, 30% ethylene glycol, and 25% glycerol) at −20°C until use.HistologyCampbell–Switzer si

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เทตที่ตอบสนองต่อ APP สายพันธุ์ 102 (teto-APPswe / IND 102; MMRRC หุ้น # 034845-JAX. Jankowsky et al, 2005) และสาย Tet-กระตุ้น B-CaMKIIα TTA (แจ็คสันห้องปฏิบัติการ # 3010; Mayford et al, 1996) ได้รับการปรับปรุงพันธุ์อิสระเพื่อ C57BL / 6J สำหรับ> 25 รุ่นก่อนที่จะถูก intercrossed สำหรับการศึกษาเหล่านี้ ส่งผลให้คู่ยีนลูกหลานชายถูกแต่งงานแล้วกับป่าประเภทหญิง FVB การผลิตผองเพื่อนทดลองบนพื้นหลัง F1 FVBB6. บริหาร Dox. หนูทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้ถูกยกขึ้นบน Dox ในการปราบปรามการแสดงออกของยีนในระหว่างการพัฒนาหลังคลอด เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้กลยุทธ์นี้เพื่อเยียวยา hyperactivity เคลื่อนไหวและปกติน้ำหนักตัวของสัตว์พันธุ์คู่อนุญาตให้ทดสอบความรู้ความเข้าใจที่เชื่อถือได้ (ร็อดเจอร์ส et al., 2012) ลูกหลานได้รับการเริ่มต้นในการ Dox 1-3 d หลังคลอดโดยการวางพยาบาลมารดาในเชายาสูตรถึง 50 mg / kg Dox (Purina Mills TestDiet # 5APL) ที่หย่านมหนูได้รับการดูแลใน Dox จนถึง 6 สัปดาห์ของอายุ (Purina Mills TestDiet # 5SBA). หนูทั้งหมดถูกส่งกลับไปยังโจวเหวินปกติต่อไปนี้ 6 เดือนช่วยให้ APP / tetracycline transactivator (TTA) สัตว์เพื่อพัฒนาโหลด amyloid ปานกลาง เพื่อทดสอบความรู้ความเข้าใจผลประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้นจากการปราบปราม APP ระยะสั้นที่ 7.5 เดือนครึ่งของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Dox เป็นเวลา 2 สัปดาห์ก่อนการทดสอบพฤติกรรมและการได้รับการดูแลใน Dox จนถึงการเก็บเกี่ยว. ในช่วงของการศึกษานี้เราพบว่าจำนวนมาก ของโจวเหวินที่เราได้ซื้อสำหรับการรักษาหลังคลอดให้ปราบปรามยีน submaximal (80% ปราบปรามมากกว่า 90-95% เราคาดว่าในขนาดนี้) ดังนั้นการบริหารการรักษาที่ 7.5 เดือนที่ได้กระทำโดยการบริหาร Dox ในน้ำดื่มขนาด 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรที่เติมน้ำตาลซูโครส 5% ที่จะสวมหน้ากากรสขม. บริหาร GSI. หมู่ที่แยกจากกันของหนูอายุที่จับคู่ได้แสดงว่ายัง APP พันธุ์เป็นเวลา 6 เดือนได้รับการรักษาด้วย GSI เพื่อยืนยันว่าพฤติกรรมการกู้คืนบรรลุโดยการปราบปรามยีนกับ Dox เป็น เนื่องจากการลดลงของAβ LY411575 เป็นยาทั้งในน้ำดื่มที่ความเข้มข้น 40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (หุ้น GSI ละลายที่ 100 mg / ml ใน DMSO / เอทานอลเพื่อให้ได้วิธีการทำงานที่มี 1% DMSO และเอทานอล 0.8%) หรือผ่านเชาที่ความเข้มข้น 25 mg / kg (BioServ อาหารสัตว์ฟันแทะ # 156166) ในทั้งสองกรณีที่จะส่งมอบยาโดยประมาณ 5 มก. / กก. / วัน การวิเคราะห์พฤติกรรมเริ่ม 5 วันหลังการรักษาเริ่มต้น. การวิเคราะห์พฤติกรรมการทดสอบพฤติกรรมเริ่มต้นที่ 8 เดือนของอายุและรวมถึงสนามเปิดเขาวงกตน้ำมอร์ริส (MWM) แขนเขาวงกตน้ำรัศมี (RAWM) และเครื่องกลัวบริบท (CFC) สัตว์ถูกจัดการ 3 d ก่อนที่จะเริ่มการทดสอบพฤติกรรม ขมิ้นอ้อยได้รับการประเมินในวันที่ 1 ตามด้วยการฝึกอบรม MWM ในวันที่ 2-10 และการฝึกอบรมในวันที่ RAWM 11. หนูที่ได้รับอนุญาตระยะเวลาที่เหลือ d 2 ก่อนที่จะกลัวการฝึกอบรมเครื่องในวันที่ 14 ซึ่งตามมาด้วยการเก็บรักษาการทดสอบ 24 ชั่วโมง ต่อมา ทั้งหมดสัตว์ทดลองได้รับการตรวจสอบและอนุมัติจากวิทยาลัยแพทย์เบย์เลอร์ของสถาบันดูแลและการใช้คณะกรรมการ. ประเมินเปิดสนาม. กิจกรรมการเคลื่อนไหวได้รับการประเมินในสีขาวอะคริลิกล่องเปิดด้านบน (46 × 46 × 38 ซม.) ในห้องที่มีแสงสีขาวโดยทางอ้อม แสง กิจกรรมที่ถูกบันทึกไว้เป็นเวลา 30 นาทีและใช้ในการวิเคราะห์ใด ๆ เขาวงกตวิดีโอระบบติดตาม (Stoelting). MWM. ทดสอบ MWM ได้ดำเนินการในถังกลมวัด 58 ซม. สูง 122 ซม. และมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง ระดับน้ำ 20 ซมจากด้านบนของถังทึบแสงและทำให้การใช้สีขาวปลอดสารพิษ อุณหภูมิของน้ำที่ถูกเก็บรักษาไว้ระหว่างวันที่ 21 และ 23 องศาเซลเซียส ห้องพักถูกไฟที่มีแสงสีขาวทางอ้อมและการทดลองที่ถูกบันทึกไว้และติดตามโดยใช้ใด ๆ เขาวงกตวิดีโอระบบติดตาม. ก่อนที่จะเริ่มการฝึกอบรมการซื้อกิจการ, หนูได้รับ 1 d ของการฝึกอบรมในช่องว่ายน้ำตรงไปปรับพวกเขาลงไปในน้ำและตรวจสอบสำหรับยานยนต์ การขาดดุล หนูทดลองที่ได้รับแปดกับ 15 นาทีช่วงเวลา intertrial (ITI) ในช่องสร้างขึ้นมาจากคริลิคสีขาวและการวัด 107 × 56 × 14 ซม. ซึ่งวางอยู่ในใจกลางของสระว่ายน้ำ ที่มองเห็นความหมายที่ถูกถอดออกจากห้องพักในระหว่างการว่ายน้ำตรงการสร้างการทดลอง หนูที่ได้รับอนุญาต 60 ที่จะถึงแพลตฟอร์มที่จมอยู่ใต้น้ำบนฝั่งตรงข้ามของช่อง หนูที่ล้มเหลวในการเข้าถึงแพลตฟอร์มถูกชี้นำไปยังสถานที่โดยการทดลอง หนูได้รับอนุญาตให้อยู่ในแพลตฟอร์มสำหรับ 15 วินาทีก่อนที่จะถูกลบออกจากน้ำที่แห้งและกลับไปที่กรงบ้านของพวกเขาภายใต้โคมไฟอินฟราเรดระหว่างการทดลอง. การฝึกอบรมในการได้มาซึ่ง MWM ประกอบด้วยสี่การทดลองต่อวัน 15 นาที ITI การฝึกอบรมแต่ละจบลงด้วยการสอบสวนความจำระยะสั้น แพลตฟอร์มตาราง (10 × 10 ซม.) ครอบคลุมในตาข่ายไนล่อนสำหรับการลากตั้งอยู่ 1 ซมใต้พื้นผิวในด้านตะวันออกเฉียงเหนือของเขาวงกตที่ครึ่งทางระหว่างด้านข้างและตรงกลางของสระว่ายน้ำ หนูอยู่ในเขาวงกตที่หันหน้าไปทางผนังในแต่ละสี่พระคาร์ดินัลเริ่มต้นสถานที่และได้รับอนุญาต 60 เพื่อหาแพลตฟอร์มที่ซ่อน เช่นเดียวกับการว่ายน้ำตรงสัตว์ที่ล้มเหลวในการหาแพลตฟอร์มในเวลาที่กำหนดถูกชี้นำเบา ๆ โดยมีการทดลอง หนูได้รับอนุญาตให้อยู่ในแพลตฟอร์มสำหรับ 15 วินาทีก่อนที่จะถูกส่งกลับไปยังกรงบ้านของพวกเขาระหว่างการทดลอง ต่อไปนี้การทดลองการฝึกอบรม 4 แพลตฟอร์มถูกลบออกจากเขาวงกตสำหรับการพิจารณาคดีการสอบสวนทันที สัตว์ที่ถูกวางไว้ในถังครึ่งทางระหว่างจุดสำคัญ (SW, NW, SE และทิศตะวันออกเฉียงเหนือ) และได้รับอนุญาต 45 ที่จะนำทางเขาวงกต ความใกล้ชิดกับเป้าหมายเวลาร้อยละร้อยละและเส้นทางที่ใช้ในแต่ละด้านจะถูกคำนวณพร้อมกับจำนวนครั้งที่สัตว์ข้ามแท่นตั้งเมื่อเทียบกับอีกสามสถานแพลตฟอร์มที่มีศักยภาพ (ใน SW, NW และแนวทาง SE) หนูได้รับการฝึกฝนเพื่อเป็นเกณฑ์ในระหว่างการทดลองประสิทธิภาพการสอบสวนของเส้นทาง≥35% ในด้านที่ถูกต้องและอย่างน้อย 40% ของทั้งหมดข้ามแพลตฟอร์มมากกว่าเว็บไซต์ที่ถูกต้องเมื่อเทียบกับสถานที่ที่เป็นไปได้อื่น ๆ แพลตฟอร์ม. เมื่อหนูถึงเกณฑ์ที่พวกเขาออกมาจากต่อ MWM การฝึกอบรม แต่ให้หน่วยความจำระยะยาวสุดท้ายสอบสวน 24 ชั่วโมงหลังจากที่ไปถึงเกณฑ์ หนูได้รับการฝึกฝนไม่เกิน 7 วัน หลังจากที่หนูทุกอย่างใดอย่างหนึ่งถึงหรือเกณฑ์เสร็จ 7 วันของการฝึกอบรมแต่ละคนได้รับอีกหนึ่ง "ทบทวน" วันของการฝึกอบรม (สี่ทดลอง) กับการทดสอบการสอบสวนเพื่อให้ประสิทธิภาพเทียบเท่าระหว่างกลุ่มก่อนที่จะเริ่มการฝึกอบรม RAWM ในระหว่างการฝึกอบรมทบทวนนี้ประสิทธิภาพการทำงานในผองเพื่อนของเราก็เหมือนกันระหว่างทั้งสองยีน (F (2,52) = 0.34, p> 0.05) และกลุ่มการรักษา (F (1,52) = 0.74, p> 0.05) ดังนั้นขั้นตอนนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าหนูทุกคนได้รับการฝึกฝนให้อยู่ในระดับประสิทธิภาพการทำงานที่คล้ายกันก่อนที่จะย้ายไปยัง RAWM ทดสอบในห้องเดียวกัน. RAWM. วันรุ่งขึ้นการฝึกอบรมทบทวน MWM หนูได้รับ 1 d ของการฝึกอบรม RAWM ประกอบด้วยแปดทดลองกับ 15 นาที ITI . RAWM ถูกสร้างขึ้นโดยการติดตั้งเรียงรายเป็นรูปสามเหลี่ยมชัดเจนแทรกเข้าไปในเขาวงกตที่สระว่ายน้ำที่มีอยู่ในน้ำ (41.25 ซม. ในแต่ละด้าน× 50 ซม. สูง) ซึ่งมีผลในหกแขนเปิดเข้าร่วมที่ศูนย์ แขนแต่ละวัด 20 ซม. กว้าง× 34 เซนติเมตรยาวและน้ำถูกเก็บรักษาไว้ที่ระดับความลึก 38 ซม. แพลตฟอร์มตั้งอยู่ 3 ซม. จากปลายแขนข้างหนึ่งและจมอยู่ใต้น้ำ 1 ซม. ด้านล่างพื้นผิวของน้ำ หนูถูกวางไว้เป็นแขนที่แตกต่างกันที่จุดเริ่มต้นของแต่ละการทดลองใช้กับคำสั่งของตำแหน่งที่เริ่มต้นก่อนที่จะเลือก pseudorandomly การฝึกอบรมดังกล่าวว่าไม่มีการพิจารณาคดีเริ่มขึ้นในแขนติดกับตำแหน่งเริ่มต้นก่อนหน้านี้ หนูที่ได้รับอนุญาต 60 ที่จะนำทางเขาวงกต ถ้าเมาส์ล้มเหลวในการหาแพลตฟอร์มในเวลาที่กำหนดก็จะถูกแนะนำเบา ๆ เพื่อโดยมีการทดลองและได้รับอนุญาตให้อยู่ในแพลตฟอร์มสำหรับ 15 วินาทีก่อนที่จะถูกส่งกลับไปยังบ้านของกรงระหว่างการทดลอง แฝงเพื่อหาแพลตฟอร์มที่ความยาวของเส้นทางการว่ายน้ำและจำนวนของการทำงานข้อผิดพลาดของหน่วยความจำ (อีกครั้งรายการที่เข้าชมก่อนหน้าแขน) จะถูกคำนวณสำหรับการทดลองแต่ละ ทดลอง 1 คะแนนได้รับการยกเว้นจากการวิเคราะห์เนื่องจากอัตราความผิดพลาดเป็นสัตว์ที่สูงขึ้นได้เรียนรู้ขั้นตอนใหม่ ข้อมูลจากการทดลอง 2-8 เฉลี่ยเพื่อให้ดัชนีประสิทธิภาพสำหรับการเรียนรู้ RAWM โดยรวม หลังจากการพิจารณาคดีการฝึกอบรมครั้งสุดท้ายสัตว์ที่ถูกทดสอบด้วยการพิจารณาคดีการสอบสวนในระยะสั้นซึ่งแพลตฟอร์มจะถูกลบออกและสัตว์ที่ได้รับอนุญาต 45 ที่จะนำทางเขาวงกต เวลาร้อยละและเส้นทางที่ใช้ในแขนเป้าหมายจะถูกคำนวณและเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มการรักษา. CFC. สองวันหลังจากการทดสอบ RAWM หนูได้รับการฝึกฝนในการใช้สาร CFC ระบบเครื่องกลัววิดีโอใกล้อินฟราเรด (Med Associates) กล่องปรับอากาศ (30.5 × 24 × 21 ซม.) กับพื้นตารางสแตนเลสที่ตั้งอยู่ภายในห้องลดทอนเสียงและไฟทางอ้อมจากด้านบน การเคลื่อนไหวถูกบันทึกไว้โดยกล้องวิดีโอที่ติดตั้งอยู่ภายในห้องเสียงลดทอนและวิเคราะห์โดยใช้ซอฟแวร์ตรึงวีดีโอ (Med Associates) เกณฑ์การเคลื่อนไหวถูกกำหนดให้ 19 หน่วยโดยพล (au) และระยะเวลาขั้นต่ำในการแช่แข็ง 1 วินาที Chambers และพื้นตารางถูกทำความสะอาดด้วยวิธีการแก้ปัญหาเอทานอล 20% หลังจากการทดลองแต่ละ. ในช่วงปรับอากาศ, หนูได้รับอนุญาตให้ได้อย่างอิสระสำรวจห้องเป็นเวลา 2 นาทีก่อนที่จะได้รับ 1 วินาที 0.8 mA footshock หลังจากช่วงเวลาต่ำสุด 2, หนูได้รับเป็นครั้งที่สอง 1 วินาที 0.8 mA footshock หนูยังคงอยู่ในห้องเป็นเวลา 1 นาทีหลังจาก footshock ที่สองก่อนที่จะถูกส่งกลับไปยังกรงบ้านของพวกเขา ยี่สิบสี่ชั่วโมงต่อมาสัตว์ที่ถูกส่งกลับไปยังกล่องเครื่องเหมือนกันสำหรับ 5 นาทีการทดสอบการเก็บรักษา ระยะเวลาของการเคลื่อนที่ถูกบันทึกไว้และนำมาใช้เป็นดัชนีของการเรียนรู้. เก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อหนึ่งสัปดาห์หลังจากการทดสอบพฤติกรรมเสร็จหนูถูกฆ่าโดยยาเกินขนาดและโซเดียม Pentobarbital perfused transcardially กับพีบีเอสเย็นที่มี 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเฮ สมองถูกถอดออกและ hemisected พร้อมกึ่ง ซีกโลกหนึ่งถูกชำแหละแยกเยื่อหุ้มสมองและ hippocampus ซึ่งถูกแช่แข็งสำหรับสแน็ปชีวเคมีและซีกโลกอื่น ๆ ที่ได้รับการแก้ไขในการแช่ 4% PFA ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง สมองถูก cryoprotected ในซูโครส 30% ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เนื้อเยื่อถูกแบ่งที่ 35 ไมครอนในระนาบทัใช้แช่แข็งเลื่อน microtome แล้วเก็บไว้ใน cryoprotectant (0.1 มฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7.4, 30% คอลเอทิลีนและกลีเซอรีน 25%) ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งาน. จุลCampbell- สวิตเซอร์ si

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เครื่อง App ตอบสนองต้นสาย 102 ( เตโตะ appswe / IND 102 ; mmrrc หุ้น# 034845-jax ; jankowsky et al . , 2005 ) และเครื่องจากสายบี camkii แอลฟา TTA ( แจ็คสัน ห้องปฏิบัติการ# 3010 ; mayford et al . , 1996 ) เป็นอิสระ backcrossed เพื่อ c57bl / 6j สำหรับ > 25 รุ่น ก่อนที่จะถูก intercrossed สำหรับ การศึกษาเหล่านี้ผลคู่ยีนชายลูกหลานจึงได้เสียกับเมียเพื่อนของ fvb ผลิตทดลองบนพื้นหลัง fvbb6 F1


หนู dox การบริหารงาน ที่ใช้ในการศึกษา คือ ยกบน DOX ปราบปรามการแสดงออกยีนในระหว่างการพัฒนาหลังคลอด .เราได้เคยแสดง กลยุทธ์นี้จะกระเตื้อง ( hyperactivity และปกติน้ำหนักตัวสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมดับเบิลอนุญาตทดสอบความน่าเชื่อถือ ( Rodgers et al . , 2012 ) ลูกกำลังเริ่ม Dox 1 – 3 D หลังคลอดโดยการพยาบาลมารดาที่ให้เฉา ยุทธศาสตร์ 50 mg / kg DOX ( Purina testdiet #โรงสี 5apl ) ที่ฝึกทานอาหารหนูรักษา DOX จนถึงอายุ 6 สัปดาห์ ( Purina โรงสี testdiet # 5sba )

หนูกลับกับเชาปกติสำหรับ 6 เดือนต่อไปนี้ อนุญาตให้ app / เตตราซัยคลิน transactivator ( TTA ) สัตว์ที่จะพัฒนาปานกลางแอมีลอยด์โหลด เพื่อทดสอบศักยภาพของการรับรู้ประโยชน์ระยะสั้น app ที่ 75 เดือนครึ่ง หนูรักษากับ dox เป็นเวลา 2 สัปดาห์ก่อนการทดสอบพฤติกรรมและรักษา DOX จนกระทั่งเก็บเกี่ยว

ในระหว่างหลักสูตรของการศึกษา เราพบว่า เราได้ซื้ออาหารมากมายสำหรับการรักษาหลังคลอดให้ submaximal ยีนปราบ ( 80% ปราบปรามมากกว่า 90 - 95 % ที่เราคาดไว้ที่ ขนาดนี้ ) ดังนั้น ผู้บริหาร 75 เดือน ทำได้โดยฉีด DOX ในน้ำดื่มที่ขนาด 50 μ g / ml ที่เติมซูโครส 5% หน้ากากรสขม .

GSI การบริหาร ตั้งแต่ age-matched
แยกของหนูที่ยังแสดง App สำหรับ 6 เดือน ได้รับการรักษาด้วยยีน GSI ยืนยันว่าพฤติกรรมการกู้คืนโดยการบรรลุ ยีนกับ dox เนื่องจากการลดลงของบีตา .ly411575 บริหารทั้งในน้ำที่ความเข้มข้น 40 μ g / ml ( GSI หุ้นยุบ 100 mg / ml ใน DMSO / เอทานอลให้ผลตอบแทนในการทำงาน โซลูชั่นที่มี DMSO 1% และเอทานอล 0.8% ) หรือผ่านทางอาหารที่ความเข้มข้น 25 มก. / กก. ( bioserv แทะอาหาร# 156166 ) ใน ทั้งสองกรณีการส่งมอบโดยประมาณขนาด 5 มก. / กก. / วัน วิเคราะห์พฤติกรรม เริ่ม 5 D

หลังการรักษาเริ่มต้นพฤติกรรมพฤติกรรมการทดสอบเริ่มขึ้น )
8 เดือนของอายุและรวมเปิดสนาม มอร์ริส น้ำเขาวงกต ( ขยาย ) , รัศมีแขนน้ำเขาวงกต ( rawm ) และบริบทกลัวปรับอากาศ ( CFC ) สัตว์ที่ถูกจัดการ 3 D ก่อนเริ่มทดสอบพฤติกรรม ประเมินกิจกรรมการเคลื่อนไหวใน 1 วัน ตามด้วยการขยายวันที่ 2 – 10 , และการฝึกอบรม rawm ในวันที่ 11