- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2.1. Purification of RNase DA-I fro
2.1. Purification of RNase DA-I from sticky digestive liquid
The pieces of filter papers (Advantec, Tokyo) were used to collect the
sticky digestive liquid of D. adelae. Since Drosera responds to mechanical stimuli in seconds [10,11], the collection was quickly performed
(usually within one or two seconds) to avoid contamination of proteins
that may be generated in response to the mechanical stimuli. Then, the
papers were put into the Ultrafree-MC Durapore 0.45 lm filters
(Millipore) and squeezed by centrifugation at 12000 · g for 30 min.
The digestive liquid was collected in eppendorf tubes.
One ml of the sticky digestive liquid of D. adelae was diluted 10-
fold in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) and loaded onto
a DEAE-Toyopearl 650C column (0.5 · 7.0 cm; Tosoh Co. Ltd., Tokyo) equilibrated with the same buffer. The column was eluted at
20 ml/h with a linear gradient of 0–120 mM NaCl in the buffer, and
absorbance was measured at 280 nm. Collected fractions (0.2 ml each)
were assayed for RNase activity according to the method of Uchida
and Egami [12], with slight modifications. Briefly, using 1 ll of each
fraction, the assay was performed in 50 mM sodium acetate (pH
5.0) and 10 mM EDTA with 0.25 mg dialyzed yeast RNA in a final
volume of 0.15 ml. After 10 min incubation at 37 C, 0.15 ml of
30% TCA was added to stop the reaction and precipitate the RNA.
Absorbance of the TCA-soluble material was measured at 260 nm.
One ribonuclease unit was defined as the amount of enzyme causing
an increase in DA260 of 1.0 min1 cm1 ml1 at 37 C, according to
Wilson [13].
2.2. RNase activity gel assay
The RNase activity gel assay was performed according to the method reported by Ye and Droste [14], using a polyacrylamide gel containing 500 lg/ml bakers yeast RNA for the electrophoresis. RNA
molecules in the gel were stained with a solution containing 0.05%
methylene blue and 1 M sodium acetate (pH 5.0).
Abbreviations: RNase, ribonuclease; poly(A), polyadenylic acid;
poly(I), polyinosinic acid; poly(C), polycytidylic acid; poly(U),
polyuridylic acid; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis
*
Corresponding author. Fax: +81 78 435 2539.
E-mail address: ohyama@konan-u.ac.jp (T. Ohyama).
0014-5793/$30.00 2005 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.febslet.2005.09.043
FEBS 30036 FEBS Letters 579 (2005) 5729–5733
2.3. Digestion of homopolyribonucleotides
Polyadenylic acid [poly(A)], polyinosinic acid [poly(I)], polycytidylic
acid [poly(C)] and polyuridylic acid [poly(U)] were used as substrates.
Each reaction mixture (5 ll) contained 400 ng of a substrate, 0.1 U of
RNase DA-I and 50 mM sodium acetate (pH 5.0). The reactions were
performed at 25 C for 20 min, 2 or 12 h, and the reaction products
were subsequently electrophoresed on a 1% agarose gel in 1/2 · TBE
(45 mM Tris–borate/1 mM EDTA, and pH 8.3). RNA molecules in
the gel were stained with methylene blue.
2.4. pH dependence of the activity of RNase DA-I
Reactions were performed at 15, 25 or 37 C for 30 min in a volume
of 150 ll containing 250 lg yeast RNA, 0.18 U of the enzyme, and
100 mM sodium citrate (pH 3.5–6.0) or sodium phosphate (pH 6.0–
8.0). The activity was measured as described above.
2.5. Assay for sensitivity to EDTA
Reactions were performed at 25 C for 20 min in a volume of 5 ll
containing 400 ng poly(A), 0.1 U of the enzyme and 50 mM sodium
acetate (pH 5.0), and in the presence of 10 or 25 mM EDTA, or in
the absence of EDTA. RNA molecules were stained with methylene
blue as described above.
2.6. Determination of partial amino acid sequence
Prior to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), the samples were treated with SDS sample buffer containing 50 mM DTT for
1 h at 60 C, and then pyridylethylated with 4-vinylpyridine for 30 min
at room temperature. SDS–PAGE, staining of proteins with CBB R-
250, and subsequent destaining were performed according to standard
protocols. After destaining, the appropriate bands were excised and
washed several times with 50% acetonitrile/0.1 M ammonium bicarbonate. After the gel pieces were dried, they were treated with 0.5 lg
of modified trypsin (Promega) in 25 mM ammonium bicarbonate,
and incubated at 37 C overnight. The generated peptides were then
extracted from the gel pieces by two treatments with 100 ll of 0.1%
TFA/50% acetonitrile at 37 C, for 30 min each. The extracts were
combined, dried, and then redissolved in 0.1% TFA. Fragments were
separated by reverse-phase chromatography using a Smart System
(Amersham Biotech), and the separated peptides were then sequenced
using an amino acid sequencer model 476A (Applied Biosystems).
2.7. Molecular cloning of cDNA fragments for RNase DA-I
The glandular tentacles of D. adelae were cut from leaves frozen in liquid
N2. Total RNA was isolated using the Concert Plant RNA Reagent (Invitrogen) and poly(A)+ RNA was purified with a Micro-FastTrack
2.0 mRNA Isolation kit (Invitrogen). Using the poly(A)+ RNA and
SMARTcDNASynthesisKit(Clontech),acDNAlibrarywasconstructed
according to the manufacturers instructions. cDNA fragments of RNase
DA-I were then amplified by PCR with primers P1 and P2 (P1, 50-YCCNACNWSNGGNAARCCNCC-30; P2, 50-NGCNACNGGRCAYTCRATRAA-30), which were designed based on partial amino acid
sequences of the enzyme. After size-fractionation by agarose gel electrophoresis, DNA of 493 bp in length was cloned into pUC19. On the basis
of the nucleotide sequence of this DNA, primers P3 and P4 (P3, 50-AATACCCTTGCCAGCCTAAC-30; P4, 50-CTCCGCTGTTATAGTTTGGCC-30) were designed. The complete 30 end of the cDNA was amplified
using P3 and the PCR primer (50-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-30)containedinthecDNASynthesisKit,and50 RACEwascarried
out using P4 and the PCR primer. The cDNA end fragments for RNase
DA-I thus obtained were cloned into pUC19.
Six to eight clones were sequenced in all cases and the major sequences were selected and linked together. The complete cDNA sequence of RNase DA-I thus determined was deposited in the
EMBL, GenBank and DDBJ Nucleotide Sequence Databases under
the Accession No. AB211503.
The pieces of filter papers (Advantec, Tokyo) were used to collect the
sticky digestive liquid of D. adelae. Since Drosera responds to mechanical stimuli in seconds [10,11], the collection was quickly performed
(usually within one or two seconds) to avoid contamination of proteins
that may be generated in response to the mechanical stimuli. Then, the
papers were put into the Ultrafree-MC Durapore 0.45 lm filters
(Millipore) and squeezed by centrifugation at 12000 · g for 30 min.
The digestive liquid was collected in eppendorf tubes.
One ml of the sticky digestive liquid of D. adelae was diluted 10-
fold in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) and loaded onto
a DEAE-Toyopearl 650C column (0.5 · 7.0 cm; Tosoh Co. Ltd., Tokyo) equilibrated with the same buffer. The column was eluted at
20 ml/h with a linear gradient of 0–120 mM NaCl in the buffer, and
absorbance was measured at 280 nm. Collected fractions (0.2 ml each)
were assayed for RNase activity according to the method of Uchida
and Egami [12], with slight modifications. Briefly, using 1 ll of each
fraction, the assay was performed in 50 mM sodium acetate (pH
5.0) and 10 mM EDTA with 0.25 mg dialyzed yeast RNA in a final
volume of 0.15 ml. After 10 min incubation at 37 C, 0.15 ml of
30% TCA was added to stop the reaction and precipitate the RNA.
Absorbance of the TCA-soluble material was measured at 260 nm.
One ribonuclease unit was defined as the amount of enzyme causing
an increase in DA260 of 1.0 min1 cm1 ml1 at 37 C, according to
Wilson [13].
2.2. RNase activity gel assay
The RNase activity gel assay was performed according to the method reported by Ye and Droste [14], using a polyacrylamide gel containing 500 lg/ml bakers yeast RNA for the electrophoresis. RNA
molecules in the gel were stained with a solution containing 0.05%
methylene blue and 1 M sodium acetate (pH 5.0).
Abbreviations: RNase, ribonuclease; poly(A), polyadenylic acid;
poly(I), polyinosinic acid; poly(C), polycytidylic acid; poly(U),
polyuridylic acid; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis
*
Corresponding author. Fax: +81 78 435 2539.
E-mail address: ohyama@konan-u.ac.jp (T. Ohyama).
0014-5793/$30.00 2005 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.febslet.2005.09.043
FEBS 30036 FEBS Letters 579 (2005) 5729–5733
2.3. Digestion of homopolyribonucleotides
Polyadenylic acid [poly(A)], polyinosinic acid [poly(I)], polycytidylic
acid [poly(C)] and polyuridylic acid [poly(U)] were used as substrates.
Each reaction mixture (5 ll) contained 400 ng of a substrate, 0.1 U of
RNase DA-I and 50 mM sodium acetate (pH 5.0). The reactions were
performed at 25 C for 20 min, 2 or 12 h, and the reaction products
were subsequently electrophoresed on a 1% agarose gel in 1/2 · TBE
(45 mM Tris–borate/1 mM EDTA, and pH 8.3). RNA molecules in
the gel were stained with methylene blue.
2.4. pH dependence of the activity of RNase DA-I
Reactions were performed at 15, 25 or 37 C for 30 min in a volume
of 150 ll containing 250 lg yeast RNA, 0.18 U of the enzyme, and
100 mM sodium citrate (pH 3.5–6.0) or sodium phosphate (pH 6.0–
8.0). The activity was measured as described above.
2.5. Assay for sensitivity to EDTA
Reactions were performed at 25 C for 20 min in a volume of 5 ll
containing 400 ng poly(A), 0.1 U of the enzyme and 50 mM sodium
acetate (pH 5.0), and in the presence of 10 or 25 mM EDTA, or in
the absence of EDTA. RNA molecules were stained with methylene
blue as described above.
2.6. Determination of partial amino acid sequence
Prior to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), the samples were treated with SDS sample buffer containing 50 mM DTT for
1 h at 60 C, and then pyridylethylated with 4-vinylpyridine for 30 min
at room temperature. SDS–PAGE, staining of proteins with CBB R-
250, and subsequent destaining were performed according to standard
protocols. After destaining, the appropriate bands were excised and
washed several times with 50% acetonitrile/0.1 M ammonium bicarbonate. After the gel pieces were dried, they were treated with 0.5 lg
of modified trypsin (Promega) in 25 mM ammonium bicarbonate,
and incubated at 37 C overnight. The generated peptides were then
extracted from the gel pieces by two treatments with 100 ll of 0.1%
TFA/50% acetonitrile at 37 C, for 30 min each. The extracts were
combined, dried, and then redissolved in 0.1% TFA. Fragments were
separated by reverse-phase chromatography using a Smart System
(Amersham Biotech), and the separated peptides were then sequenced
using an amino acid sequencer model 476A (Applied Biosystems).
2.7. Molecular cloning of cDNA fragments for RNase DA-I
The glandular tentacles of D. adelae were cut from leaves frozen in liquid
N2. Total RNA was isolated using the Concert Plant RNA Reagent (Invitrogen) and poly(A)+ RNA was purified with a Micro-FastTrack
2.0 mRNA Isolation kit (Invitrogen). Using the poly(A)+ RNA and
SMARTcDNASynthesisKit(Clontech),acDNAlibrarywasconstructed
according to the manufacturers instructions. cDNA fragments of RNase
DA-I were then amplified by PCR with primers P1 and P2 (P1, 50-YCCNACNWSNGGNAARCCNCC-30; P2, 50-NGCNACNGGRCAYTCRATRAA-30), which were designed based on partial amino acid
sequences of the enzyme. After size-fractionation by agarose gel electrophoresis, DNA of 493 bp in length was cloned into pUC19. On the basis
of the nucleotide sequence of this DNA, primers P3 and P4 (P3, 50-AATACCCTTGCCAGCCTAAC-30; P4, 50-CTCCGCTGTTATAGTTTGGCC-30) were designed. The complete 30 end of the cDNA was amplified
using P3 and the PCR primer (50-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-30)containedinthecDNASynthesisKit,and50 RACEwascarried
out using P4 and the PCR primer. The cDNA end fragments for RNase
DA-I thus obtained were cloned into pUC19.
Six to eight clones were sequenced in all cases and the major sequences were selected and linked together. The complete cDNA sequence of RNase DA-I thus determined was deposited in the
EMBL, GenBank and DDBJ Nucleotide Sequence Databases under
the Accession No. AB211503.
0/5000
2.1 การทำให้บริสุทธิ์ของ RNase ดา-ฉันจากทางเดินอาหารเหลวเหนียวชิ้นส่วนของกระดาษกรอง (Advantec โตเกียว) ใช้ในการเก็บรวบรวมการของเหลวย่อยอาหารเหนียวของ D. adelae เนื่องจากหญ้าตอบสนองต่อสิ่งเร้ากลวินาที [10,11], คอลเลกชันได้อย่างรวดเร็วทำ(ปกติภายในหนึ่ง หรือสองวินาที) เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของโปรตีนที่อาจสร้างขึ้นในการตอบสนองสิ่งเร้ากล นั้นใส่กระดาษลงในตัวกรอง lm Ultrafree MC Durapore 0.45(มาก) และคั้น ด้วย centrifugation ที่ 12000 · กรัมสำหรับ 30 นาทีของเหลวในทางเดินอาหารรวบรวมใน eppendorf หลอดMl หนึ่งของของเหลวที่ใช้ย่อยอาหารเหนียวของ D. adelae ถูกแตกออก 10-พับใน 10 มม.โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และโหลดลงบนคอลัมน์ DEAE-Toyopearl 650C (0.5 · 7.0 ซม. Tosoh จำกัด โตเกียว) equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกัน คอลัมน์ถูก eluted ที่ปริมาณ 20 ml/h กับการไล่ระดับสีแบบเส้นตรงของ 0 – 120 มม. NaCl ในบัฟเฟอร์ และมีวัด absorbance ที่ 280 nm รวบรวมเศษส่วน (0.2 ml แต่ละ)มี assayed RNase กิจกรรมตามวิธีการของ Uchidaและ Egami [12], มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ใช้เวลาสั้น ๆ 1 ll ละเศษส่วน การวิเคราะห์งานใน acetate โซเดียม 50 มม. (pH5.0) และยีสต์ 10 mM EDTA กับ 0.25 mg dialyzed อาร์เอ็นเอในสุดปริมาณ 0.15 ml หลังจากบ่ม 10 นาทีที่ 37 C, 0.15 ml ของ30% TCA เพื่อหยุดปฏิกิริยา และ precipitate อาร์เอ็นเอที่เพิ่มขึ้นถูกวัด absorbance ของ TCA ละลายวัสดุที่ 260 nmหน่วย ribonuclease หนึ่งถูกกำหนดเป็นยอดของเอนไซม์ก่อให้เกิดการเพิ่ม DA260 1.0 นาที 1 ซม. 1 ml 1 ที่ 37 C ตามWilson [13]2.2. RNase กิจกรรมเจวิเคราะห์มีดำเนินการทดสอบเจกิจกรรม RNase ตามวิธีการที่รายงาน โดยเยและ Droste [14], ใช้เจ polyacrylamide ประกอบด้วย 500 lg/ml กัร s ยีสต์อาร์เอ็นเอสำหรับการ electrophoresis อาร์เอ็นเอโมเลกุลในเจถูกสี ด้วยโซลูชันประกอบด้วย 0.05%บลูเมทิลีนไดและ 1 M โซเดียม acetate (pH 5.0)ตัวย่อ: RNase, ribonuclease poly(A), polyadenylic กรดpoly(I), polyinosinic กรด poly(C), polycytidylic กรด poly(U)กรด polyuridylic หน้า เจ polyacrylamide electrophoresis*ผู้ที่เกี่ยวข้อง โทรสาร: +81 78 435 2539ที่อยู่อีเมล: (ต. Ohyama) ใน ohyama@konan-u.ac.jpสภาสมาคมยุโรปชีวเคมี 0014-5793 / $30.00 2005 เผยแพร่ โดย Elsevier b.v สงวนลิขสิทธิ์ทั้งหมดdoi:10.1016/j.febslet.2005.09.043FEBS FEBS 30036 อักษร 579 (2005) 5729-57332.3 การย่อยอาหารของ homopolyribonucleotidesPolyadenylic กรด [poly(A)], polyinosinic [poly(I)], polycytidylic[poly(C)] กรดและกรด polyuridylic [poly(U)] ถูกใช้เป็นพื้นผิวส่วนผสมแต่ละปฏิกิริยา (5 ll) มีอยู่ 400 ng ของพื้นผิว 0.1 U ของRNase ดา-ฉันและ acetate โซเดียม 50 มม. (pH 5.0) ปฏิกิริยาที่ถูก25 C 20 นาที h 2 หรือ 12 และผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาต่อมาถูก electrophoresed ในเจ 1% agarose ใน 1/2 · TBE(45 มมตรี – borate/1 mM EDTA และ pH 8.3) อาร์เอ็นเอโมเลกุลในเจมีสีกับบลูเมทิลีนได2.4 การอาศัย pH ของกิจกรรมของ RNase ดา-ฉันดำเนินปฏิกิริยาที่ 15, 25 หรือมา C 30 นาทีในไดรฟ์ข้อมูล150 จะประกอบด้วยยีสต์ lg 250 อาร์เอ็นเอ 0.18 U ของเอนไซม์ และ100 มม.โซเดียมซิเตรต (pH 3.5-6.0) หรือโซเดียมฟอสเฟต (pH 6.0-8.0) ถูกวัดกิจกรรมที่อธิบายข้างต้น2.5 การวิเคราะห์สำหรับความไวให้ EDTAดำเนินปฏิกิริยาที่ 25 C สำหรับ 20 นาทีปริมาณ 5 จะประกอบด้วย 400 ng poly(A), 0.1 U โซเดียมเอนไซม์และ 50 มม.acetate (pH 5.0), และ ในสถานะ 10 หรือ 25 mM EDTA หรือในการขาดงานของ EDTA อาร์เอ็นเอโมเลกุลถูกสี ด้วยเมทิลีนไดสีฟ้าตามที่อธิบายไว้ข้างต้น2.6 การกำหนดลำดับของกรดอะมิโนบางส่วนก่อนองค์กร – polyacrylamide เจ electrophoresis (หน้า), ตัวอย่างได้รับการรักษา ด้วยบัฟเฟอร์อย่าง SDS DTT 50 มม.ที่ประกอบด้วยในh 1 ที่ 60 C และ pyridylethylated กับ vinylpyridine 4 สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง SDS-หน้า ย้อมสีของโปรตีนกับ CBB R -destaining 250 และต่อมาได้ดำเนินการตามมาตรฐานโปรโตคอลการ หลังจาก destaining วงดนตรีที่เหมาะสมถูก excised และล้างหลาย ๆ ครั้ง ด้วย acetonitrile/0.1 M 50% แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต หลังจากได้แห้งชิ้นเจ พวกเขาได้รับการรักษากับ 0.5 lgของ (Promega) ทริปซินแก้ไขใน 25 มม.แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตและ incubated ที่ 37 C ค้างคืน เปปไทด์ที่สร้างได้แล้วสกัดจากชิ้นเจ โดยรักษาสอง 100 ll ของ 0.1%TFA/50% acetonitrile ที่ 37 C สำหรับ 30 นาที สารสกัดได้รวม แห้ง และ redissolved แล้ว ใน 0.1% TFA แยกส่วนได้โดยใช้ระบบสมาร์ท chromatography กลับเฟส(Amersham ไบโอเทค), และเปปไทด์แยกถูกเรียงลำดับแล้วโดยใช้แบบจำลอง sequencer กรดอะมิโน 476A (Biosystems ใช้)2.7 การโคลนของบางส่วนของ cDNA สำหรับ RNase ดา-ฉันTentacles ต่อมของ D. adelae ถูกตัดจากใบไม้ที่แช่แข็งในของเหลวN2 อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกโดยใช้รีเอเจนต์อาร์เอ็นเอการโรงงานคอนเสิร์ต (Invitrogen) และ poly(A) + อาร์เอ็นเอที่บริสุทธิ์ที่ มีไมโคร-FastTrack2.0 mRNA แยกชุด (Invitrogen) โดยใช้การ poly(A) + อาร์เอ็นเอ และSMARTcDNASynthesisKit (Clontech), acDNAlibrarywasconstructedตามที่ผู้ผลิตตามคำสั่ง ชิ้นส่วน cDNA ของ RNaseดา-ฉันถูกขยาย โดย PCR กับไพรเมอร์ P1 และ p 2 (P1, 50-YCCNACNWSNGGNAARCCNCC-30 P 2, 50-NGCNACNGGRCAYTCRATRAA-30), ซึ่งถูกออกแบบขึ้นอยู่กับกรดอะมิโนบางส่วนลำดับของเอนไซม์นี้ หลังจากการแยกส่วนขนาดโดย agarose เจ electrophoresis ดีเอ็นเอของ 493 bp ความยาวถูกโคลนเป็น pUC19 บนพื้นฐานลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA นี้ ไพรเมอร์ P3 และ P4 (P3, 50-AATACCCTTGCCAGCCTAAC-30 P4, 50-CTCCGCTGTTATAGTTTGGCC-30) ถูกออกแบบ สิ้นสุด 30 สมบูรณ์ของ cDNA ถูกขยายใช้ P3 และ PCR รองพื้น (50-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-30) containedinthecDNASynthesisKit, and50 RACEwascarriedออกใช้ P4 และพื้น PCR ชิ้นส่วนสิ้นสุดของ cDNA สำหรับ RNaseดา-จึงได้รับถูกโคลนเป็น pUC19หก-แปดโคลนถูกเรียงลำดับในทุกกรณี และเลือกลำดับที่สำคัญ และเชื่อมโยงกัน ลำดับ cDNA ที่สมบูรณ์ของ RNase ดา-ฉันจึงกำหนดถูกนำไปวางไว้EMBL, GenBank และฐานข้อมูลลำดับของนิวคลีโอไทด์ DDBJ ภายใต้หมายเลขทะเบียน AB211503
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 การทำให้บริสุทธิ์ของ RNase DA-I
จากการย่อยอาหารเหลวเหนียวชิ้นส่วนของกระดาษกรอง(Advantec โตเกียว)
ถูกนำมาใช้ในการเก็บรวบรวมของเหลวเหนียวของการย่อยอาหารดีadelae ตั้งแต่ Drosera ตอบสนองต่อสิ่งเร้ากลในไม่กี่วินาที [10,11] คอลเลกชันที่ได้ดำเนินการอย่างรวดเร็ว
(ปกติภายในหนึ่งหรือสองวินาที)
เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของโปรตีนที่อาจจะเกิดขึ้นในการตอบสนองต่อสิ่งเร้ากล จากนั้นเอกสารที่ถูกใส่ลงไปใน Ultrafree MC-Durapore กรอง 0.45 ไมครอน (ค) และบีบโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ·กรัมเป็นเวลา 30 นาที. ของเหลวย่อยอาหารถูกเก็บรวบรวมไว้ในหลอด Eppendorf. หนึ่งมิลลิลิตรของเหลวเหนียวของการย่อยอาหารดี adelae ถูกเจือจาง 10 เท่าใน 10 มิลลิโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และโหลดลงคอลัมน์ DEAE-Toyopearl 650C (0.5 · 7.0 ซม Tosoh จำกัด โตเกียว) equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกัน คอลัมน์ที่ถูกชะที่20 มล. / ชมที่มีความลาดชันเชิงเส้นของ 0-120 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ในบัฟเฟอร์และการดูดกลืนแสงวัดที่280 นาโนเมตร เศษส่วนเก็บ (0.2 มล. แต่ละคน) ถูก assayed กิจกรรม RNase ตามวิธีการของอุจิและEgami [12] ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ โดยใช้ 1 LL ของแต่ละส่วน, การทดสอบได้รับการดำเนินการใน 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท (pH 5.0) และ EDTA 10 มิลลิกับ 0.25 มิลลิกรัม dialyzed RNA ยีสต์ในขั้นสุดท้ายปริมาณ0.15 มล. หลังจาก 10 นาทีบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 0.15 มิลลิลิตร30% TCA ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อหยุดปฏิกิริยาและเกิดการตกตะกอน RNA ได้. การดูดกลืนแสงของวัสดุ TCA ละลายในวัดที่ 260 นาโนเมตร. หนึ่งหน่วย ribonuclease ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ DA260 1.0 นาที 1 ซม. 1 มล. 1 ที่ 37 องศาเซลเซียสตามที่วิลสัน[13]. 2.2 กิจกรรม RNase เจลทดสอบการวิเคราะห์เจลRNase กิจกรรมที่ได้ดำเนินการตามวิธีการรายงานโดยเจ้าและ Droste [14] โดยใช้เจลอะคริเลตที่มีแอลจี 500 / ขนมปังมล. หรือไม่ RNA ยีสต์สำหรับข่าวคราว อาร์เอ็นเอโมเลกุลในเจลถูกย้อมด้วยวิธีการแก้ปัญหาที่มี 0.05% เมทิลีนสีฟ้าและ 1 M โซเดียมอะซิเตท (pH 5.0). ย่อ: RNase, ribonuclease; โพลี (A), กรด polyadenylic; โพลี (I), กรด polyinosinic; โพลี (C), กรด polycytidylic; โพลี (U), กรด polyuridylic; หน้า, เจลอะคริเลตอิ* ผู้รับผิดชอบ แฟกซ์: 81 78 435 2539 อีเมล์:. ohyama@konan-u.ac.jp (ที Ohyama) 0014-5793 / $ 30.00? 2005 สภาสังคมชีวเคมียุโรป จัดทำโดย Elsevier BV สงวนลิขสิทธิ์. ดอย: 10.1016 / j.febslet.2005.09.043 FEBS 30,036 FEBS 579 ตัวอักษร (2005) 5729-5733 2.3 การย่อย homopolyribonucleotides กรด Polyadenylic [โพลี (A)] กรด polyinosinic [โพลี (I)] polycytidylic กรด [โพลี (C)] และกรด polyuridylic [โพลี (U)] ถูกนำมาใช้เป็นสารตั้งต้น. แต่ละผสมปฏิกิริยา (5 LL) ที่มีอยู่ 400 นาโนกรัมของพื้นผิวที่ 0.1 U ของRNase DA-I และ 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท (pH 5.0) ปฏิกิริยาถูกดำเนินการที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที, 2 หรือ 12 ชั่วโมงและผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาถูกelectrophoresed ต่อมาเจล agarose 1% 1/2 · TBE (45 มิลลิ Tris-borate / 1 มิลลิ EDTA และพีเอช 8.3 ) โมเลกุล RNA ในเจลที่ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนสีฟ้า. 2.4 การพึ่งพาค่า pH ของการทำงานของ RNase DA-I ปฏิกิริยาได้ดำเนินการที่ 15, 25 หรือ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีในปริมาณ150 LL มี 250 จีอาร์เอ็นเอยีสต์ 0.18 U ของเอนไซม์และ100 มิลลิโซเดียมซิเตรท (pH 3.5 -6.0) หรือโซเดียมฟอสเฟต (pH 6.0- 8.0) กิจกรรมที่ได้รับการวัดที่อธิบายข้างต้น. 2.5 ทดสอบเพื่อความไวของการ EDTA ปฏิกิริยาได้ดำเนินการอยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีในปริมาณ 5 LL ที่มีโพลี 400 นาโนกรัม (A) 0.1 U ของเอนไซม์และ 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท(pH 5.0) และในการปรากฏตัวของ 10 หรือ 25 มิลลิ EDTA หรือในกรณีที่ไม่มีEDTA โมเลกุล RNA ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนสีฟ้าที่อธิบายข้างต้น. 2.6 การกำหนดลำดับกรดอะมิโนบางส่วนก่อนที่จะมีข่าวคราว SDS-อะคริเลต (หน้า) กลุ่มตัวอย่างได้รับการรักษาด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS มี 50 มิลลิ DTT สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 60 องศาเซลเซียสและ pyridylethylated แล้วกับ 4 vinylpyridine เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง. SDS-PAGE, การย้อมสีของโปรตีนที่มี CBB R- 250 และ destaining ต่อมาได้ดำเนินการตามมาตรฐานโปรโตคอล หลังจาก destaining วงที่เหมาะสมถูกตัดทิ้งและล้างหลายครั้งด้วย50% acetonitrile / 0.1 M แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต หลังจากที่ชิ้นเจลแห้งพวกเขาได้รับการรักษาด้วย 0.5 จีของtrypsin การแก้ไข (Promega) ในไบคาร์บอเนต 25 มิลลิแอมโมเนียมและบ่มที่อุณหภูมิ37? C ในชั่วข้ามคืน เปปไทด์ที่ถูกสร้างขึ้นแล้วดึงออกจากชิ้นเจลสองการรักษาด้วย 100 LL 0.1% TFA / 50% acetonitrile ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีในแต่ละ สารสกัดถูกรวมแห้งและ redissolved แล้ว 0.1% TFA ชิ้นส่วนที่ถูกแยกจากกันโดยโคเฟสกลับใช้ระบบสมาร์ท(Amersham ไบโอเทค) และเปปไทด์ที่ถูกแยกออกจากกันแล้วติดใจโดยใช้กรดอะมิโนรูปแบบซีเควน476A (Applied Biosystems). 2.7 โคลนเศษ cDNA สำหรับ RNase DA-ผมหนวดของต่อมดีadelae ถูกตัดออกจากใบแช่แข็งในของเหลวN2 รวมอาร์เอ็นเอที่แยกได้โดยใช้พืชคอนเสิร์ตอาร์เอ็นเอรีเอเจน (Invitrogen) และโพลี (A) + อาร์เอ็นเอบริสุทธิ์กับไมโคร FastTrack 2.0 mRNA ชุดแยก (Invitrogen) การใช้โพลี (A) + อาร์เอ็นเอและSMARTcDNASynthesisKit (Clontech) acDNAlibrarywasconstructed ตามที่ผู้ผลิตหรือไม่คำแนะนำ ชิ้นส่วนของยีน RNase DA-ฉันถูกขยายแล้วโดยวิธี PCR ด้วยไพรเมอร์ P1 และ P2 (P1, 50 YCCNACNWSNGGNAARCCNCC-30; P2 50 NGCNACNGGRCAYTCRATRAA-30) ซึ่งได้รับการออกแบบบนพื้นฐานของกรดอะมิโนบางส่วนลำดับของเอนไซม์ หลังจากที่แยกขนาดโดยข่าวคราว agarose ดีเอ็นเอของ 493 bp ในความยาวเป็นโคลนเข้าไปใน pUC19 บนพื้นฐานของลำดับเบสของดีเอ็นเอนี้ไพรเมอร์ P3 และ P4 (P3, 50 AATACCCTTGCCAGCCTAAC-30; P4 50 CTCCGCTGTTATAGTTTGGCC-30) ได้รับการออกแบบ สมบูรณ์ 30 ตอนท้ายของยีนถูกขยายโดยใช้P3 และไพรเมอร์พีซีอาร์ (50 AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-30) containedinthecDNASynthesisKit, and50 RACEwascarried ออกมาใช้ P4 และไพรเมอร์พีซีอาร์ เศษปลาย cDNA สำหรับ RNase DA-ผมจึงได้ถูกโคลนเข้า pUC19. หกถึงแปดโคลนมีลำดับขั้นตอนในทุกกรณีและลำดับที่สำคัญได้รับการคัดเลือกและการเชื่อมโยงกัน ลำดับยีนที่สมบูรณ์ของ RNase DA-ฉันกำหนดจึงถูกฝากไว้ในEMBL, GenBank และ DDBJ เบสฐานข้อมูลลำดับภายใต้การครอบครองฉบับAB211503
จากการย่อยอาหารเหลวเหนียวชิ้นส่วนของกระดาษกรอง(Advantec โตเกียว)
ถูกนำมาใช้ในการเก็บรวบรวมของเหลวเหนียวของการย่อยอาหารดีadelae ตั้งแต่ Drosera ตอบสนองต่อสิ่งเร้ากลในไม่กี่วินาที [10,11] คอลเลกชันที่ได้ดำเนินการอย่างรวดเร็ว
(ปกติภายในหนึ่งหรือสองวินาที)
เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของโปรตีนที่อาจจะเกิดขึ้นในการตอบสนองต่อสิ่งเร้ากล จากนั้นเอกสารที่ถูกใส่ลงไปใน Ultrafree MC-Durapore กรอง 0.45 ไมครอน (ค) และบีบโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ·กรัมเป็นเวลา 30 นาที. ของเหลวย่อยอาหารถูกเก็บรวบรวมไว้ในหลอด Eppendorf. หนึ่งมิลลิลิตรของเหลวเหนียวของการย่อยอาหารดี adelae ถูกเจือจาง 10 เท่าใน 10 มิลลิโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และโหลดลงคอลัมน์ DEAE-Toyopearl 650C (0.5 · 7.0 ซม Tosoh จำกัด โตเกียว) equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกัน คอลัมน์ที่ถูกชะที่20 มล. / ชมที่มีความลาดชันเชิงเส้นของ 0-120 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ในบัฟเฟอร์และการดูดกลืนแสงวัดที่280 นาโนเมตร เศษส่วนเก็บ (0.2 มล. แต่ละคน) ถูก assayed กิจกรรม RNase ตามวิธีการของอุจิและEgami [12] ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ โดยใช้ 1 LL ของแต่ละส่วน, การทดสอบได้รับการดำเนินการใน 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท (pH 5.0) และ EDTA 10 มิลลิกับ 0.25 มิลลิกรัม dialyzed RNA ยีสต์ในขั้นสุดท้ายปริมาณ0.15 มล. หลังจาก 10 นาทีบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 0.15 มิลลิลิตร30% TCA ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อหยุดปฏิกิริยาและเกิดการตกตะกอน RNA ได้. การดูดกลืนแสงของวัสดุ TCA ละลายในวัดที่ 260 นาโนเมตร. หนึ่งหน่วย ribonuclease ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ DA260 1.0 นาที 1 ซม. 1 มล. 1 ที่ 37 องศาเซลเซียสตามที่วิลสัน[13]. 2.2 กิจกรรม RNase เจลทดสอบการวิเคราะห์เจลRNase กิจกรรมที่ได้ดำเนินการตามวิธีการรายงานโดยเจ้าและ Droste [14] โดยใช้เจลอะคริเลตที่มีแอลจี 500 / ขนมปังมล. หรือไม่ RNA ยีสต์สำหรับข่าวคราว อาร์เอ็นเอโมเลกุลในเจลถูกย้อมด้วยวิธีการแก้ปัญหาที่มี 0.05% เมทิลีนสีฟ้าและ 1 M โซเดียมอะซิเตท (pH 5.0). ย่อ: RNase, ribonuclease; โพลี (A), กรด polyadenylic; โพลี (I), กรด polyinosinic; โพลี (C), กรด polycytidylic; โพลี (U), กรด polyuridylic; หน้า, เจลอะคริเลตอิ* ผู้รับผิดชอบ แฟกซ์: 81 78 435 2539 อีเมล์:. ohyama@konan-u.ac.jp (ที Ohyama) 0014-5793 / $ 30.00? 2005 สภาสังคมชีวเคมียุโรป จัดทำโดย Elsevier BV สงวนลิขสิทธิ์. ดอย: 10.1016 / j.febslet.2005.09.043 FEBS 30,036 FEBS 579 ตัวอักษร (2005) 5729-5733 2.3 การย่อย homopolyribonucleotides กรด Polyadenylic [โพลี (A)] กรด polyinosinic [โพลี (I)] polycytidylic กรด [โพลี (C)] และกรด polyuridylic [โพลี (U)] ถูกนำมาใช้เป็นสารตั้งต้น. แต่ละผสมปฏิกิริยา (5 LL) ที่มีอยู่ 400 นาโนกรัมของพื้นผิวที่ 0.1 U ของRNase DA-I และ 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท (pH 5.0) ปฏิกิริยาถูกดำเนินการที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที, 2 หรือ 12 ชั่วโมงและผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาถูกelectrophoresed ต่อมาเจล agarose 1% 1/2 · TBE (45 มิลลิ Tris-borate / 1 มิลลิ EDTA และพีเอช 8.3 ) โมเลกุล RNA ในเจลที่ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนสีฟ้า. 2.4 การพึ่งพาค่า pH ของการทำงานของ RNase DA-I ปฏิกิริยาได้ดำเนินการที่ 15, 25 หรือ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีในปริมาณ150 LL มี 250 จีอาร์เอ็นเอยีสต์ 0.18 U ของเอนไซม์และ100 มิลลิโซเดียมซิเตรท (pH 3.5 -6.0) หรือโซเดียมฟอสเฟต (pH 6.0- 8.0) กิจกรรมที่ได้รับการวัดที่อธิบายข้างต้น. 2.5 ทดสอบเพื่อความไวของการ EDTA ปฏิกิริยาได้ดำเนินการอยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีในปริมาณ 5 LL ที่มีโพลี 400 นาโนกรัม (A) 0.1 U ของเอนไซม์และ 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตท(pH 5.0) และในการปรากฏตัวของ 10 หรือ 25 มิลลิ EDTA หรือในกรณีที่ไม่มีEDTA โมเลกุล RNA ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนสีฟ้าที่อธิบายข้างต้น. 2.6 การกำหนดลำดับกรดอะมิโนบางส่วนก่อนที่จะมีข่าวคราว SDS-อะคริเลต (หน้า) กลุ่มตัวอย่างได้รับการรักษาด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS มี 50 มิลลิ DTT สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 60 องศาเซลเซียสและ pyridylethylated แล้วกับ 4 vinylpyridine เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง. SDS-PAGE, การย้อมสีของโปรตีนที่มี CBB R- 250 และ destaining ต่อมาได้ดำเนินการตามมาตรฐานโปรโตคอล หลังจาก destaining วงที่เหมาะสมถูกตัดทิ้งและล้างหลายครั้งด้วย50% acetonitrile / 0.1 M แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต หลังจากที่ชิ้นเจลแห้งพวกเขาได้รับการรักษาด้วย 0.5 จีของtrypsin การแก้ไข (Promega) ในไบคาร์บอเนต 25 มิลลิแอมโมเนียมและบ่มที่อุณหภูมิ37? C ในชั่วข้ามคืน เปปไทด์ที่ถูกสร้างขึ้นแล้วดึงออกจากชิ้นเจลสองการรักษาด้วย 100 LL 0.1% TFA / 50% acetonitrile ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีในแต่ละ สารสกัดถูกรวมแห้งและ redissolved แล้ว 0.1% TFA ชิ้นส่วนที่ถูกแยกจากกันโดยโคเฟสกลับใช้ระบบสมาร์ท(Amersham ไบโอเทค) และเปปไทด์ที่ถูกแยกออกจากกันแล้วติดใจโดยใช้กรดอะมิโนรูปแบบซีเควน476A (Applied Biosystems). 2.7 โคลนเศษ cDNA สำหรับ RNase DA-ผมหนวดของต่อมดีadelae ถูกตัดออกจากใบแช่แข็งในของเหลวN2 รวมอาร์เอ็นเอที่แยกได้โดยใช้พืชคอนเสิร์ตอาร์เอ็นเอรีเอเจน (Invitrogen) และโพลี (A) + อาร์เอ็นเอบริสุทธิ์กับไมโคร FastTrack 2.0 mRNA ชุดแยก (Invitrogen) การใช้โพลี (A) + อาร์เอ็นเอและSMARTcDNASynthesisKit (Clontech) acDNAlibrarywasconstructed ตามที่ผู้ผลิตหรือไม่คำแนะนำ ชิ้นส่วนของยีน RNase DA-ฉันถูกขยายแล้วโดยวิธี PCR ด้วยไพรเมอร์ P1 และ P2 (P1, 50 YCCNACNWSNGGNAARCCNCC-30; P2 50 NGCNACNGGRCAYTCRATRAA-30) ซึ่งได้รับการออกแบบบนพื้นฐานของกรดอะมิโนบางส่วนลำดับของเอนไซม์ หลังจากที่แยกขนาดโดยข่าวคราว agarose ดีเอ็นเอของ 493 bp ในความยาวเป็นโคลนเข้าไปใน pUC19 บนพื้นฐานของลำดับเบสของดีเอ็นเอนี้ไพรเมอร์ P3 และ P4 (P3, 50 AATACCCTTGCCAGCCTAAC-30; P4 50 CTCCGCTGTTATAGTTTGGCC-30) ได้รับการออกแบบ สมบูรณ์ 30 ตอนท้ายของยีนถูกขยายโดยใช้P3 และไพรเมอร์พีซีอาร์ (50 AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-30) containedinthecDNASynthesisKit, and50 RACEwascarried ออกมาใช้ P4 และไพรเมอร์พีซีอาร์ เศษปลาย cDNA สำหรับ RNase DA-ผมจึงได้ถูกโคลนเข้า pUC19. หกถึงแปดโคลนมีลำดับขั้นตอนในทุกกรณีและลำดับที่สำคัญได้รับการคัดเลือกและการเชื่อมโยงกัน ลำดับยีนที่สมบูรณ์ของ RNase DA-ฉันกำหนดจึงถูกฝากไว้ในEMBL, GenBank และ DDBJ เบสฐานข้อมูลลำดับภายใต้การครอบครองฉบับAB211503
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 . การ da-i เลสจากการย่อยอาหารของเหลวเหนียว
ชิ้นส่วนของตัวกรองเอกสาร ( ADVANTEC โตเกียว ) การเก็บรวบรวมของเหลวเหนียวดี adelae
ระบบย่อยอาหาร . ตอบสนองต่อสิ่งเร้าตั้งแต่สกุลหยาดน้ำค้างเครื่องกลในวินาที [ 10,11 ] , คอลเลกชันได้อย่างรวดเร็วดำเนินการ
( ปกติภายในหนึ่งหรือสองวินาที ) เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของโปรตีน
ที่อาจถูกสร้างขึ้นในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าของเครื่องกล งั้น
เอกสารจะถูกใส่ลงไปใน ultrafree MC durapore 0.45 LM ตัวกรอง
( มิลลิ ) และบีบโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12000 ด้วย G สำหรับ 30 นาที
ของเหลวการย่อยอาหารรวบรวมในเพนดอร์ฟหลอด .
1 มล. ของของเหลวการย่อยอาหารเหนียวของ D . adelae เจือจาง 10 -
พับในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 10 มม. pH 6.5 ) และโหลดไปยัง
มีการทำ toyopearl 650c คอลัมน์ ( 0.5 Suite 7.0 ซม. TOSOH จำกัด โตเกียว ) equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกัน คอลัมน์คือตัวอย่างที่
20 ml / h กับลาดเชิงเส้น 0 – 120 mM NaCl ในบัฟเฟอร์และ
นถูกวัดที่ 280 nm . เก็บเศษส่วน ( 0.2 ml แต่ละ )
ถูก assayed โดยเลสตามแบบและ เอกามิ อูชิดะ
[ 12 ] มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ1 จะใช้แต่ละ
เศษส่วน ( แสดงในโซเดียมอะซีเตท 50 มม. ( M
5.0 ) และ 10 mM EDTA 0.25 มก. ผ่านอาร์เอ็นเอยีสต์ในปริมาณขั้นสุดท้าย
0.15 มล. หลังจาก 10 นาทีบ่มที่ 37 C , 0.15 มิลลิลิตร
30% TCA ถูกเพิ่มเพื่อหยุดปฏิกิริยาและตกตะกอน ยีน .
การดูดกลืนแสงของ TCA ที่วัสดุเป็นวัดที่ 260 nm .
หนึ่งหน่วยไรโบนิวคลีเถูกกำหนดไว้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ก่อให้เกิด
เพิ่มใน da260 สำหรับมิน 1 ซม. 1 ml 1 ที่ 37 C ตาม
วิลสัน [ 13 ] .
2.2 . กิจกรรมการทดสอบเลสเจล
กิจกรรมการทดสอบการปฏิบัติเลสเจลตามวิธีการที่รายงานโดยท่าน และโดรสต์ [ 14 ] โดยใช้ polyacrylamide gel บรรจุ 500 มิลลิลิตร เบเกอร์ ของ LG ซึ่งยีสต์สำหรับเรส อาร์เอ็นเอ
โมเลกุลในเจลถูกย้อมด้วยสารละลายที่ประกอบด้วยเมทธิลีน 0.05 %
สีฟ้าและโซเดียมอะซีเตท 1 M ( pH 5.0 ) อักษรย่อ : เลสไรโบนิวคลีเ ;
, poly ( A ) , กรดโพลี polyadenylic ;
( ฉัน ) , polyinosinic กรด ; โพลี ( C ) , polycytidylic กรด ; โพลี ( U )
polyuridylic กรด ; หน้า , polyacrylamide gel electrophoresis
ที่สอดคล้องกันของผู้เขียน โทรสาร : 0 78 435 2539 .
e - mail address : ohyama@konan-u.ac.jp ( ต.โอยาม่า )
0014-5793 / $ 30.00 2005 สหพันธ์สมาคมเคมียุโรป ที่ตีพิมพ์โดยเอลส์เท่าสงวนลิขสิทธิ์ .
ดอย : 10.1016 / j.febslet . 2005.09.043
febs ตัวอักษร 30036 febs 579 ( 2005 ) 5729 – 5733
2.3 การย่อยอาหารของ homopolyribonucleotides
polyadenylic กรด [ poly ( A ) ] , [ polyinosinic กรดโพลี ( I ) ] , กรดโพลี polycytidylic
[ ( C ) ] และ [ polyuridylic กรดโพลี ( U ) ] ที่ใช้พื้นผิว .
แต่ละปฏิกิริยาผสม ( 5 จะ ) ที่มีอยู่ 400 นาโนพื้นผิว 0.1 U
da-i ของเลส และโซเดียมอะซีเตท 50 มม. ( pH 5.0 ) บุค
ดำเนินการ 25 C นาน 20 นาที หรือ 12 ชั่วโมง และผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา
จัดการ electrophoresed ในเจล ( 1 ) 1 / 2 ด้วยทีบี
( 45 มม. นอกจากนี้ – บอเรต / 1 mM EDTA และ pH 8.3 ) โมเลกุล RNA ใน
เจลถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนบลู .
2.4 .ขึ้นอยู่กับ pH ของกิจกรรมของเลส da-i
ปฏิกิริยาจำนวน 15 , 25 หรือ 37 C เป็นเวลา 30 นาทีในหมวด
150 จะประกอบด้วย 250 LG ยีสต์ RNA , 0.18 U ของเอนไซม์และ
ซิเตรทโซเดียม 100 มม. ( พีเอช 3.5 – 6.0 ) หรือโซเดียมฟอสเฟต ( pH 6.0 )
8 ) . กิจกรรมวัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น .
2.5 การทดสอบสำหรับความไวต่อปฏิกิริยาการ EDTA
ที่ 25 C เป็นเวลา 20 นาที ในปริมาณ 5 ll
ที่มี 400 ของ poly ( A ) , 0.1 U ของเอนไซม์โซเดียมอะซีเตท
50 มม. ( pH 5.0 ) และในการแสดงตนของ 10 หรือ 25 mM EDTA หรือ
ไม่มี EDTA โมเลกุล RNA ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนบลู
ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 2.6 การหาลำดับกรดอะมิโนบางส่วน
ก่อน SDS - polyacrylamide gel electrophoresis ( หน้า ) , จำนวนการรักษาด้วย SDS ตัวอย่างบัฟเฟอร์ที่มี 50 - 20 สำหรับ
1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 60 C แล้ว pyridylethylated ด้วย
4-vinylpyridine 30 นาที ที่อุณหภูมิห้อง SDS –หน้าคราบโปรตีนด้วย cbb R -
250 และต่อมา destaining มีการปฏิบัติตามโปรโตคอลมาตรฐาน
หลังจาก destaining วงดนตรีที่เหมาะสมถูกตัดและ
ล้างหลายครั้งกับ 50% ไน / 0.1 M แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต หลังจากเจลชิ้นแห้งพวกเขาได้รับการรักษาด้วย 0.5 LG
ดัดแปลง ( promega ) ในรูปแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 25 มม.
บ่มที่ 37 C ในชั่วข้ามคืน ที่สร้างเปปไทด์แล้ว
สกัดจากเจลชิ้นสองการรักษาด้วย 100 จะ 0.1 %
/ 50% ไนระดับที่ 37 C เป็นเวลา 30 นาทีในแต่ละ สารสกัดถูก
รวม อบแห้ง แล้ว redissolved ในระดับ 0.1 เปอร์เซ็นต์ . ชิ้นส่วนถูก
แยกสามารถใช้ขั้นตอนย้อนกลับ
ระบบสมาร์ท ( ที่สมบูรณ์ ) และแยกเปปไทด์เป็นลำดับ
ใช้กรดอะมิโนแบบซีเควน 476a ( Applied Biosystems ) .
2.7 . การโคลนชิ้น cDNA สำหรับเลสของ da-i
หนวดๆดี. adelae ถูกตัดจากใบแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว
อาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้พืชคอนเสิร์ต RNA Reagent ( Invitrogen ) และพอลิ ( ) ซึ่งถูกแยกด้วยจุลภาคของฟาสต์แทร็ค
2.0 แยกชุด ( Invitrogen ) การใช้โพลี ( ) อาร์เอ็นเอและ
smartcdnasynthesiskit ( clontech ) acdnalibrarywasconstructed
ตามที่ผู้ผลิต ด้วยคำสั่ง เศษชิ้นส่วนของ cDNA เลส
da-i แล้วโดยขยาย PCR ไพรเมอร์ P1 กับ P2 ( P1 และ50-yccnacnwsnggnaarccncc-30 ; P2 , 50-ngcnacnggrcaytcratraa-30 ) ซึ่งถูกออกแบบโดยบางส่วนกรดอะมิโน
ลำดับการทำงานของเอนไซม์ หลังจากแยกตามขนาด , เจล , ดีเอ็นเอของ 493 BP ในความยาวถูกโคลนเข้าไปใน puc19 . บนพื้นฐาน
ของลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอนี้ ไพรเมอร์ ( P3 และ P4 P3 50-aatacccttgccagcctaac-30 ; P4 50-ctccgctgttatagtttggcc-30 ) ได้รับการออกแบบสมบูรณ์ 30 ปลายดีเอ็นเอถูกใช้ P3
และ PCR ไพรเมอร์เบส ( 50-aagcagtggtaacaacgcagagt-30 ) containedinthecdnasynthesiskit and50 racewascarried
, P4 และ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ วิธีจบเศษสำหรับเลส
da-i จึงได้มีการโคลนเข้า puc19 .
หกถึงแปดโคลนนี้ในทุกกรณี และลำดับความคัดสรรและเชื่อมโยงเข้าด้วยกันลำดับของยีนที่สมบูรณ์ da-i เลสจึงตัดสินใจฝากในสัตว
, และฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์พบ ddbj ภายใต้
ภาคยานุวัติไม่ ab211503 .
ชิ้นส่วนของตัวกรองเอกสาร ( ADVANTEC โตเกียว ) การเก็บรวบรวมของเหลวเหนียวดี adelae
ระบบย่อยอาหาร . ตอบสนองต่อสิ่งเร้าตั้งแต่สกุลหยาดน้ำค้างเครื่องกลในวินาที [ 10,11 ] , คอลเลกชันได้อย่างรวดเร็วดำเนินการ
( ปกติภายในหนึ่งหรือสองวินาที ) เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของโปรตีน
ที่อาจถูกสร้างขึ้นในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าของเครื่องกล งั้น
เอกสารจะถูกใส่ลงไปใน ultrafree MC durapore 0.45 LM ตัวกรอง
( มิลลิ ) และบีบโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12000 ด้วย G สำหรับ 30 นาที
ของเหลวการย่อยอาหารรวบรวมในเพนดอร์ฟหลอด .
1 มล. ของของเหลวการย่อยอาหารเหนียวของ D . adelae เจือจาง 10 -
พับในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 10 มม. pH 6.5 ) และโหลดไปยัง
มีการทำ toyopearl 650c คอลัมน์ ( 0.5 Suite 7.0 ซม. TOSOH จำกัด โตเกียว ) equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกัน คอลัมน์คือตัวอย่างที่
20 ml / h กับลาดเชิงเส้น 0 – 120 mM NaCl ในบัฟเฟอร์และ
นถูกวัดที่ 280 nm . เก็บเศษส่วน ( 0.2 ml แต่ละ )
ถูก assayed โดยเลสตามแบบและ เอกามิ อูชิดะ
[ 12 ] มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ1 จะใช้แต่ละ
เศษส่วน ( แสดงในโซเดียมอะซีเตท 50 มม. ( M
5.0 ) และ 10 mM EDTA 0.25 มก. ผ่านอาร์เอ็นเอยีสต์ในปริมาณขั้นสุดท้าย
0.15 มล. หลังจาก 10 นาทีบ่มที่ 37 C , 0.15 มิลลิลิตร
30% TCA ถูกเพิ่มเพื่อหยุดปฏิกิริยาและตกตะกอน ยีน .
การดูดกลืนแสงของ TCA ที่วัสดุเป็นวัดที่ 260 nm .
หนึ่งหน่วยไรโบนิวคลีเถูกกำหนดไว้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ก่อให้เกิด
เพิ่มใน da260 สำหรับมิน 1 ซม. 1 ml 1 ที่ 37 C ตาม
วิลสัน [ 13 ] .
2.2 . กิจกรรมการทดสอบเลสเจล
กิจกรรมการทดสอบการปฏิบัติเลสเจลตามวิธีการที่รายงานโดยท่าน และโดรสต์ [ 14 ] โดยใช้ polyacrylamide gel บรรจุ 500 มิลลิลิตร เบเกอร์ ของ LG ซึ่งยีสต์สำหรับเรส อาร์เอ็นเอ
โมเลกุลในเจลถูกย้อมด้วยสารละลายที่ประกอบด้วยเมทธิลีน 0.05 %
สีฟ้าและโซเดียมอะซีเตท 1 M ( pH 5.0 ) อักษรย่อ : เลสไรโบนิวคลีเ ;
, poly ( A ) , กรดโพลี polyadenylic ;
( ฉัน ) , polyinosinic กรด ; โพลี ( C ) , polycytidylic กรด ; โพลี ( U )
polyuridylic กรด ; หน้า , polyacrylamide gel electrophoresis
ที่สอดคล้องกันของผู้เขียน โทรสาร : 0 78 435 2539 .
e - mail address : ohyama@konan-u.ac.jp ( ต.โอยาม่า )
0014-5793 / $ 30.00 2005 สหพันธ์สมาคมเคมียุโรป ที่ตีพิมพ์โดยเอลส์เท่าสงวนลิขสิทธิ์ .
ดอย : 10.1016 / j.febslet . 2005.09.043
febs ตัวอักษร 30036 febs 579 ( 2005 ) 5729 – 5733
2.3 การย่อยอาหารของ homopolyribonucleotides
polyadenylic กรด [ poly ( A ) ] , [ polyinosinic กรดโพลี ( I ) ] , กรดโพลี polycytidylic
[ ( C ) ] และ [ polyuridylic กรดโพลี ( U ) ] ที่ใช้พื้นผิว .
แต่ละปฏิกิริยาผสม ( 5 จะ ) ที่มีอยู่ 400 นาโนพื้นผิว 0.1 U
da-i ของเลส และโซเดียมอะซีเตท 50 มม. ( pH 5.0 ) บุค
ดำเนินการ 25 C นาน 20 นาที หรือ 12 ชั่วโมง และผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา
จัดการ electrophoresed ในเจล ( 1 ) 1 / 2 ด้วยทีบี
( 45 มม. นอกจากนี้ – บอเรต / 1 mM EDTA และ pH 8.3 ) โมเลกุล RNA ใน
เจลถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนบลู .
2.4 .ขึ้นอยู่กับ pH ของกิจกรรมของเลส da-i
ปฏิกิริยาจำนวน 15 , 25 หรือ 37 C เป็นเวลา 30 นาทีในหมวด
150 จะประกอบด้วย 250 LG ยีสต์ RNA , 0.18 U ของเอนไซม์และ
ซิเตรทโซเดียม 100 มม. ( พีเอช 3.5 – 6.0 ) หรือโซเดียมฟอสเฟต ( pH 6.0 )
8 ) . กิจกรรมวัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น .
2.5 การทดสอบสำหรับความไวต่อปฏิกิริยาการ EDTA
ที่ 25 C เป็นเวลา 20 นาที ในปริมาณ 5 ll
ที่มี 400 ของ poly ( A ) , 0.1 U ของเอนไซม์โซเดียมอะซีเตท
50 มม. ( pH 5.0 ) และในการแสดงตนของ 10 หรือ 25 mM EDTA หรือ
ไม่มี EDTA โมเลกุล RNA ถูกย้อมด้วยสีเมทิลีนบลู
ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น 2.6 การหาลำดับกรดอะมิโนบางส่วน
ก่อน SDS - polyacrylamide gel electrophoresis ( หน้า ) , จำนวนการรักษาด้วย SDS ตัวอย่างบัฟเฟอร์ที่มี 50 - 20 สำหรับ
1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 60 C แล้ว pyridylethylated ด้วย
4-vinylpyridine 30 นาที ที่อุณหภูมิห้อง SDS –หน้าคราบโปรตีนด้วย cbb R -
250 และต่อมา destaining มีการปฏิบัติตามโปรโตคอลมาตรฐาน
หลังจาก destaining วงดนตรีที่เหมาะสมถูกตัดและ
ล้างหลายครั้งกับ 50% ไน / 0.1 M แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต หลังจากเจลชิ้นแห้งพวกเขาได้รับการรักษาด้วย 0.5 LG
ดัดแปลง ( promega ) ในรูปแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 25 มม.
บ่มที่ 37 C ในชั่วข้ามคืน ที่สร้างเปปไทด์แล้ว
สกัดจากเจลชิ้นสองการรักษาด้วย 100 จะ 0.1 %
/ 50% ไนระดับที่ 37 C เป็นเวลา 30 นาทีในแต่ละ สารสกัดถูก
รวม อบแห้ง แล้ว redissolved ในระดับ 0.1 เปอร์เซ็นต์ . ชิ้นส่วนถูก
แยกสามารถใช้ขั้นตอนย้อนกลับ
ระบบสมาร์ท ( ที่สมบูรณ์ ) และแยกเปปไทด์เป็นลำดับ
ใช้กรดอะมิโนแบบซีเควน 476a ( Applied Biosystems ) .
2.7 . การโคลนชิ้น cDNA สำหรับเลสของ da-i
หนวดๆดี. adelae ถูกตัดจากใบแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว
อาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้พืชคอนเสิร์ต RNA Reagent ( Invitrogen ) และพอลิ ( ) ซึ่งถูกแยกด้วยจุลภาคของฟาสต์แทร็ค
2.0 แยกชุด ( Invitrogen ) การใช้โพลี ( ) อาร์เอ็นเอและ
smartcdnasynthesiskit ( clontech ) acdnalibrarywasconstructed
ตามที่ผู้ผลิต ด้วยคำสั่ง เศษชิ้นส่วนของ cDNA เลส
da-i แล้วโดยขยาย PCR ไพรเมอร์ P1 กับ P2 ( P1 และ50-yccnacnwsnggnaarccncc-30 ; P2 , 50-ngcnacnggrcaytcratraa-30 ) ซึ่งถูกออกแบบโดยบางส่วนกรดอะมิโน
ลำดับการทำงานของเอนไซม์ หลังจากแยกตามขนาด , เจล , ดีเอ็นเอของ 493 BP ในความยาวถูกโคลนเข้าไปใน puc19 . บนพื้นฐาน
ของลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอนี้ ไพรเมอร์ ( P3 และ P4 P3 50-aatacccttgccagcctaac-30 ; P4 50-ctccgctgttatagtttggcc-30 ) ได้รับการออกแบบสมบูรณ์ 30 ปลายดีเอ็นเอถูกใช้ P3
และ PCR ไพรเมอร์เบส ( 50-aagcagtggtaacaacgcagagt-30 ) containedinthecdnasynthesiskit and50 racewascarried
, P4 และ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ วิธีจบเศษสำหรับเลส
da-i จึงได้มีการโคลนเข้า puc19 .
หกถึงแปดโคลนนี้ในทุกกรณี และลำดับความคัดสรรและเชื่อมโยงเข้าด้วยกันลำดับของยีนที่สมบูรณ์ da-i เลสจึงตัดสินใจฝากในสัตว
, และฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์พบ ddbj ภายใต้
ภาคยานุวัติไม่ ab211503 .
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- คำศัพท์ทางการแพทย์UNo pulmonary infiltra
- Wage
- คำศัพท์ทางการแพทย์UNo pulmonary infiltra
- reduce the cost of a component or a func
- ทีนี้ค่าใช้จ่ายน้อย เนื่องจากเป็นมหาวิทย
- ล้าง Filter
- もちろん
- So horny |wink
- ล้าง Filter
- จ้าง
- เค้กนมสด
- The VIE hotel is located very close to B
- แม้จะมีนักเคลื่อนไหวหรือนักต่อต้านออกมาก
- The lost chance will never come again.
- สินค้าบางชนิด พนักงานยังไม่มีความเข้าใจใ
- Seni çok seviyorum
- อากาศดีมาก
- Chitosan solution preparationChitosan po
- Techniques
- วันที่ส่งคืน
- The stay was relaxing and peaceful, stil
- ความคืบหน้า
- i have a lot of living to do
- when you put something heavy on the pot
