The dried and powdered leaf skin of

The dried and powdered leaf skin ofA. barbadensis(500.0 g)
was extracted three times with 95% EtOH (3 × 1 L) under
ultrasonic. The extract was filtered and concentrated under
reduced pressure to yield a dark residue (34.3 g). The crude
ethanolic extract was suspended in distilled water (500 mL)
and fractionated successively with 3 × 500 mL volumes of
petroleum ether, EtOAc andn-butanol. The EtOAc fraction
(8.1 g) was then subjected to RP-FC and eluted with a gradient
of MeOH–H2O (30:70 to 80:20, v/v) at a flow rate of 20 mL min
–1
to afford 10 fractions (E1–E10). Fraction E3 was further
chromatographed by RP-FC using MeOH–H2O(26:74,v/v)as
mobile phase to yield compounds1(321 mg),2(362 mg) and
3(738 mg). Fraction E5 was purified by semi-preparative HPLC
using a MeOH–H2O (56:44, v/v) system to obtain compounds4
(3 mg,tR11.5 min),5(2 mg,tR12.3 min),6(3 mg,tR13.2 min)
and7(4 mg,tR13.9 min). Fraction E6 was subjected to semipreparative HPLC eluted with an isocratic elution system of
MeOH–H2O (60:40, v/v) to give compounds8(45 mg, tR
8.9 min) and9(63 mg,tR13.5 min). Using the same procedure,
compounds 10(23 mg, tR 13.4 min) and 11(82 mg, tR
15.7 min) were obtained from fraction E7. Fraction E9 was
chromatographed on silica gel column (100 × 10 mm i.d.)
eluted with a step gradient of CH2Cl2–MeOH (10:1 to 7:1, v/v)
to afford compounds12(8 mg),13(3 mg) and14(2 mg). The
n-butanol extract (2.3 g) was purified by RP-FC with MeOH–
H2O (35:65 to 60:40, v/v) as mobile phase, followed by semipreparative HPLC (MeOH–H2O, 58:42, v/v) to yield compounds
15(36 mg,tR15.6 min) and16(45 mg,tR16.5 min).
2.3.1. Aloeresin K (8)
Yellowish amorphous powder; [α]20 D =−130.2° (c0.66,
MeOH); UV (MeOH)λmax: 226, 252 and 300 nm; IR (KBr)νmax:
3376 (br), 2934, 1706, 1650, 1600, 1379, 1246, 1164 and
1103 cm
−1
;positiveESIMSm/z599.19 [M + H]
+
; HRESIMSm/z
621.1973 [M + Na]
+
(calcd. for C31H34O12Na, 621.1942);
1
H
(CD3OD, 400 MHz) and
13
CNMR(CD3OD, 100 MHz) spectral
data seeTable 1.
2.3.2. 6′-O-acetyl-aloin B (9)
Yellow amorphous powder; [α]20 D = −53.8° (c 0.66,
MeOH); UV (MeOH)λmax: 269, 297 and 356 nm; IR (KBr)νmax:
3403 (br), 2876, 1721, 1612, 1286, 1233 and 1069 cm
−1
;
positive ESIMSm/z461.05 [M + H]
+
;HRESIMSm/z483.1279
[M + Na]
+
(calcd. for C23H24O10Na, 483.1262);
1
H(CD3OD,
400 MHz) and
13
C NMR (CD3OD, 100 MHz) spectral data see
Table 1.
2.3.3. Aloeresin J (10)
Yellowish amorphous powder; [α]20 D =−147.8° (c0.69,
MeOH); UV (MeOH)λmax: 225, 251 and 297 nm; IR (KBr)νmax:
3385 (br), 2971, 2926, 1701, 1647, 1599, 1382, 1259, 1166 and
1078 cm
−1
;positiveESIMSm/z571.21 [M + H]
+
; HRESIMSm/z
593.1998 [M + Na]
+
(calcd. for C30H34O11Na, 593.1993);
1
H
(CD3OD, 400 MHz) and
13
CNMR(CD3OD, 100 MHz) spectral
data seeTable 1.
2.3.4. 6′-O-acetyl-aloin A (11)
Yellow amorphous powder; [α]20 D = +5.2° (c 0.63,
MeOH); UV (MeOH)λmax: 269, 297 and 356 nm; IR (KBr)νmax:
3423 (br), 2920, 2872, 1728, 1622, 1236, 1101 and 1032 cm
−1
;
positive ESIMSm/z461.08 [M + H]
+
;HRESIMSm/z483.1285
[M + Na]
+
(calcd. for C23H24O10Na, 483.1262);
1
H(CD3OD,
400 MHz) and
13
C NMR (CD3OD, 100 MHz) spectral data see
Table 1.
2.4. Expression and purification of PDE4D
The protocols for expression and purification of PDE4D
were referred to our previous reports[19–22].Inbrief,the
recombinant plasmid pET15b subcloned with PDE4D2 (catalytic domain, residues 86–413) was introduced into theE. coli
strains BL21 (codonplus) and the transformed cells were
cultivated in LB medium containing 100μgmL–1
ampicillin
and 0.4% glucose at 37 °C until OD600 = 0.7. Then 0.1 mM
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was applied to
induce PDE4D protein expression for another 20 h at 15 °C.
PDE4D protein was purified by Ni-NTA column eluted with
imidazole buffer and the effluent was monitored through
OD280. Typically 40–60 mg of PDE4D was obtained from 1 L cell
culture, with a purity of greater than 90% as determined by
SDS-PAGE.
2.5. Enzymatic assays
The enzymatic activities of the catalytic domain of PDE4D
were assayed by using
3
H-cAMP as substrate. First,
3
H-cAMP
was diluted with the assay buffer containing 50 mM Tris–HCl
70 J.-S. Zhong et al. / Fitoterapia 100 (2015) 68–74
(pH 7.5), 10 mM MgCl2and 0.5 mM DTT to 2 × 10
4
–3×10
4
cpm
per assay. The reaction was carried out in a reaction mixture
containing PDE4D enzyme, substrate and different concentrations of inhibitor dissolved in DMSO at room temperature for
15 min, and terminated by adding 0.2 M of ZnSO4. Then the
reaction product
3
H-AMP was precipitated out by 0.2 N of
Ba(OH)2, whereas unreacted
3
H-cAMP remained in the supernatant. The radioactivity in the supernatant was measured in
2.5 mL of Ultima Gold liquid scintillation cocktails by a liquid
scintillation counter. All of isolates were preliminary screened at
a concentration of 10 μMandtheIC50 values of active
compounds were further measured by nonlinear regression.
Each test was measured in triplicate. Rolipram, a representative
PDE4 inhibitor, was selected as positive control.
2.6. Cytotoxic assays
The cytotoxicity of compounds13and14on the murine
macrophage RAW 264.7 cells (obtained from ATCC, Manassas,
VA, USA) was evaluated by MTT assay. RAW 264.7 cells were
cultured in DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (Zhejiang Tianhang
Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China) in 5% CO2at
37 °C. Cells were seeded into 96-well culture plate with a
density of 1 × 10
4
cells per well and allowed to adhere for 24 h,
and then treated with various concentrations of each compound
for another 24 h. After treatment, cells were incubated with
0.5 mg mL
–1
MTT solution for 4 h at 37 °C and then
the supernatant was discarded and the formazan crystal was
dissolved in DMSO. The optical density at 570 nm was measured
on a FlexStation 3 microplate reader (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA, USA) with SoftMax Pro 5 software onboard.
3. Results and discussion
3.1. Structural elucidation of the isolated compounds
Compound 8 was obtained as a yellowish amorphous
powder. Its molecular formula was established as C31H34O12
from a pseudomolecular ion peak atm/z621.1973 [M + Na]
+
(calcd. for C31H34O12Na, 621.1942) in the HRESIMS. The IR
spectrum of 8 indicated the presence of hydroxyl group
(3376 cm
−1
, br), conjugated ester carbonyl (1706 cm
−1
),
chelated carbonyl group (1650 cm
−1
) and aromatic moiety
(1600 cm
−1
). The UV spectrum gave maximum absorptions at
226, 252 and 300 nm, which were the characteristics of
chromones [23].The1
H-NMR spectroscopic data of 8
(Table 1) combined with its
1
H–
1
H COSY and HSQC spectra
Table 1
1
H(400MHz)and13
C (100 MHz) NMR data of compounds8, 9, 10and11in CD3OD (δin ppm,Jin Hz).
Carbon 8 10 9 11
δC δHmult. δC δHmult. δC δHmult. δC δHmult.
1 162.9 163.2
2 167.2 167.4 114.1 6.85, s 114.5 6.87, s
3 112.6 6.12 (s) 112.6 6.12 (s) 152.3 151.1
4 182.2 182.2 117.2 6.96, s 119.2 6.97, s
5 144.8 144.6 121.3 6.98 (d, 7.4) 119.4 6.90 (d, 7.4)
6 112.6 6.77 (s) 112.5 6.79 (s) 136.0 7.44 (t, 7.9) 137.0 7.45 (t, 7.9)
7 162.0 162.0 117.4 6.84 (d, 8.1) 116.6 6.81 (d, 8.1)
8 111.4 111.8 163.0 162.6
9 44.9 2.83 (dd, 14.2, 5.0) 44.6 2.90 (dd, 14.3, 4.5) 195.4 195.3
2.76 (d, 7.8) 2.76 (d, 8.3)
10 66.3 4.45 (m) 66.0 4.48 (m) 45.4 4.47 (d, 1.6) 45.4 4.42 (d, 1.7)
11 23.7 1.37 (d, 6.2) 23.6 1.35 (d, 6.3) 64.5 4.65 (s) 64.6 4.66 (d, 3.1)
5-CH3 23.7 2.71 (s) 23.6 2.72 (s)
7-OCH3 57.1 3.87 (s) 57.0 3.88 (s)
1a 159.6 159.6 117.8 117.9
4a 117.2 117.2 147.2 142.3
5a 142.3 146.9
8a 119.1 118.8
1′ 72.8 5.20 (d, 10.1) 72.8 5.19 (d, 10.1) 85.9 3.28 (dd, 9.1, 2.5) 85.9 3.28 (dd, 9.6, 1.8)
2′ 73.7 5.75 (dd, 9.8, 9.4) 73.9 5.74 (dd, 9.9, 9.5) 71.7 2.81 (t, 9.3) 71.7 2.81 (t, 9.3)
3′ 77.7 3.75 (d, 9.0) 77.9 3.75 (d, 8.8) 79.7 3.25 (d, 9.1) 79.7 3.25 (d, 9.6)
4′ 72.4 3.57 (m) 72.3 3.57 (t, 8.9) 71.5 3.07 (t, 9.3) 71.4 3.06 (t, 9.3)
5′ 80.1 3.69 (m) 82.9 3.47 (m) 78.7 2.98 (m) 78.8 2.98 (m)
6′ 64.4 4.46 (dd, 11.9, 1.5) 63.1 3.94 (dd, 12.0, 1.9) 64.7 4.06 (dd, 11.7, 2.0) 64.5 4.07 (dd, 11.7, 2.0)
4.26 (dd, 12.1, 6.4) 3.74 (dd, 11.9, 6.4) 3.77 (dd, 11.7, 7.1) 3.76 (dd, 11.7, 7.0)
COCH3 173.0 172.6 172.6
COCH3 20.9 2.03 (s) 20.5 1.88 (s) 20.5 1.88 (s)
1″ 168.0 167.8
2″ 114.6 6.03 (d, 15.9) 115.6 6.10 (d, 15.8)
3″ 146.6 7.35 (d, 16.1) 146.1 7.39 (d, 15.8)
4″ 127.0 128.2
5″ 131.1 7.31 (d, 8.6) 130.9 7.42 (d, 8.7)
6″ 116.9 6.74 (d, 8.6) 115.4 6.89 (d, 8.8)
7″ 161.3 163.2
8″ 116.9 6.74 (d, 8.6) 115.4 6.89 (d, 8.8)
9″ 131.1 7.31 (d, 8.6) 130.9 7.42 (d, 8.7)
7″-OCH3 55.9 3.79 (s)
71 J.-S. Zhong et

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เสิร์ฟผิวใบไม้แห้ง และบดละเอียด barbadensis(500.0 g)มีสามครั้งสกัด ด้วย 95% EtOH (3 × 1 L) ภายใต้อัลตราโซนิก การดึงข้อมูลที่ถูกกรอง และเข้มข้นภายใต้ความดันที่ลดลงให้ผลตกค้างเข้ม (34.3 กรัม) ดิบสารสกัด ethanolic ถูกระงับในน้ำกลั่น (500 มล.)และ fractionated ติด ๆ กันกับ 3 × 500 mL จำนวนมากปิโตรเลียมอีเทอร์ EtOAc andn-บิวทานอ เศษ EtOAc(8.1 กรัม) แล้วต้อง RP FC และ eluted ด้วยการไล่ระดับสีของทานอเอชทูโอ (30:70 เพื่อ 80:20, v/v) ที่อัตราการไหลของมล. 20 นาที– 1ซื้อได้ 10 ส่วน (E1-E10) ส่วน E3 ถูกเพิ่มเติมchromatographed RP FC โดยใช้ทานอ – H2O(26:74,v/v) เป็นเฟสเคลื่อนที่ให้ผลผลิต compounds1(321 mg), 2(362 mg) และ3(738 mg) ส่วน E5 ไม่บริสุทธิ์ โดยกึ่ง preparative HPLCใช้ระบบทานอเอชทูโอ (56:44, v/v) เพื่อขอรับ compounds4(3 มิลลิกรัม tR11.5 min), 5 (2 มิลลิกรัม tR12.3 min) 6 (3 มิลลิกรัม tR13.2 นาที)and7 (4 มิลลิกรัม tR13.9 นาที) ส่วน E6 ถูกยัดเยียดให้ HPLC eluted กับระบบ isocratic คิด elution ของ semipreparativeทานอเอชทูโอ (60:40, v/v) ให้ compounds8 (45 มิลลิกรัม tR8.9 นอกนาที) and9 (63 มิลลิกรัม tR13.5 min) ใช้ขั้นตอนเดียวสารประกอบ 10 (23 มิลลิกรัม tR 13.4 นาที) และ 11 (82 มิลลิกรัม tR15.7 min) ได้รับจากเศษ E7 มีเศษ E9chromatographed บนคอลัมน์ซิลิก้าเจล (100 × 10 มม.ประชาชน)eluted กับการไล่ระดับขั้นตอนของ CH2Cl2 – ทานอ (10:1 7:1, v/v)ซื้อได้ compounds12(8 mg), 13(3 mg) and14(2 mg) ที่สารสกัดเอ็นบิวทานอ (2.3 กรัม) ที่บริสุทธิ์ โดย RP-FC กับทานอ –เอชทูโอ (35:65 เพื่อ 60:40, v/v) เป็นเฟสเคลื่อนที่ ตาม ด้วย HPLC semipreparative (ทานอเอชทูโอ 58:42, v/v) ให้ผลผลิตสาร15 (36 มิลลิกรัม tR15.6 min) and16 (45 มิลลิกรัม tR16.5 min)2.3.1. Aloeresin K (8)สีเหลืองผงไป [Α] 20 D = −130.2 ° (c0.66ทานอล Λmax UV (ทานอล: 226, 252 และ 300 nm IR (KBr) νmax:3376 (br), 2934, 1706 พัก 1650, 1600, 1379, 1246, 1164 และซม. 1103−1; positiveESIMSm/z599.19 [M + H]+; HRESIMSm/z621.1973 [M + นา]+(ปี. สำหรับ C31H34O12Na, 621.1942);1H(CD3OD, 400 MHz) และ13CNMR (CD3OD, 100 MHz) สเปกตรัมข้อมูล seeTable 12.3.2. 6′-O-acetyl-aloin B (9)สีเหลืองผงไป [Α] 20 D = −53.8 ° (c 0.66ทานอล UV ทานอ) λmax: 269, 297 และ 356 nm IR (KBr) νmax:ซม. (br), 2876, 1721 ค.ศ. 1612, 1286, 1233 และ 1069 3403−1;บวก ESIMSm/z461.05 [M + H]+;HRESIMSm/z483.1279[M + นา]+(ปี. สำหรับ C23H24O10Na, 483.1262);1H (CD3ODความเร็ว 400 เมกะเฮิรตซ์) และ13ดูข้อมูลสเปกตรัม NMR C (CD3OD, 100 MHz)ตารางที่ 12.3.3 J Aloeresin (10)สีเหลืองผงไป [Α] 20 D = −147.8 ° (c0.69ทานอล Λmax UV (ทานอล: 225, 251 และ 297 nm IR (KBr) νmax:3385 (br), 2971, 2926, 1701, 1647, 1599, 1382, 1259, 1166 และ1078 ซม.−1; positiveESIMSm/z571.21 [M + H]+; HRESIMSm/z593.1998 [M + นา]+(ปี. สำหรับ C30H34O11Na, 593.1993);1H(CD3OD, 400 MHz) และ13CNMR (CD3OD, 100 MHz) สเปกตรัมข้อมูล seeTable 12.3.4 พัฒนา. 6′-O-acetyl-aloin (11)สีเหลืองผงไป [Α] 20 D = +5.2 ° (c 0.63ทานอล UV ทานอ) λmax: 269, 297 และ 356 nm IR (KBr) νmax:ซม. (br), 2920, 2872, 1728, 1622, 1236, 1101 และ 1032 3423−1;บวก ESIMSm/z461.08 [M + H]+;HRESIMSm/z483.1285[M + นา]+(ปี. สำหรับ C23H24O10Na, 483.1262);1H (CD3ODความเร็ว 400 เมกะเฮิรตซ์) และ13ดูข้อมูลสเปกตรัม NMR C (CD3OD, 100 MHz)ตารางที่ 12.4 การนิพจน์และฟอก PDE4Dโปรโตคอลสำหรับนิพจน์และฟอก PDE4Dได้อ้างถึงรายงานของเราก่อนหน้านี้ [19-22]Inbrief การrecombinant plasmid pET15b subcloned กับ PDE4D2 (ตัวเร่งปฏิกิริยาโด ตก 86 – 413) ถูกนำเข้าทั้งหลาย coliสายพันธุ์ BL21 (codonplus) และเซลล์ที่แปรรูปปลูกในกลางปอนด์ประกอบด้วย 100μgmL-1แอมพิซิลลินและ 0.4% กลูโคสที่ 37 ° C จนถึง OD600 = 0.7 แล้ว 0.1 มม.มีใช้ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)ก่อให้เกิด PDE4D โปรตีนนิพจน์สำหรับ h อีก 20 ที่ 15 องศาเซลเซียสPDE4D โปรตีนที่บริสุทธิ์ตามคอลัมน์ Ni NTA eluted ด้วยอิมิดาโซลบัฟเฟอร์และน้ำถูกตรวจสอบผ่านOD280 โดยทั่วไป 40-60 มก.ของ PDE4D ได้รับจาก 1 L เซลล์วัฒนธรรม มีความบริสุทธิ์มากกว่า 90% เป็นไปตามSDS-หน้า2.5 assays เอนไซม์ในระบบกิจกรรมเอนไซม์ในระบบโดเมนตัวเร่งปฏิกิริยาของ PDE4Dมี assayed โดย3H-ค่ายเป็นพื้นผิว ครั้งแรก3ค่าย Hถูกผสมกับบัฟเฟอร์วิเคราะห์ประกอบด้วยทริสเรทติ้ง – HCl 50 มม.เจเอส 70 จงร้อยเอ็ด al. / Fitoterapia 100 (2015) 68-74(pH 7.5), MgCl2and 10 mM 0.5 mM DTT กับ 2 × 104–3 × 104หน้า/นาทีต่อการวิเคราะห์ ปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการในส่วนผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วยเอนไซม์ PDE4D พื้นผิว และความเข้มข้นต่าง ๆ ของสารยับยั้งละลายใน DMSO ที่อุณหภูมิห้องใน15 นาที และสิ้นสุดลง โดยการเพิ่ม 0.2 M ของ ZnSO4 นั้นผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา3H-AMP ถูกตะกอนออก โดย 0.2 N ของBa (OH) 2 โดย unreacted3ค่าย H ที่ยังคงอยู่ใน supernatant Radioactivity ใน supernatant ถูกวัดใน2.5 mL ของค็อกเทล scintillation เหลวทองทวีดอัลติมาเป็นของเหลวscintillation นับ ทั้งหมดแยกได้เบื้องต้นฉายที่ความเข้มข้นของค่า μMandtheIC50 10 ใช้งานอยู่สารเพิ่มเติมวัด โดยถดถอยไม่เชิงเส้นทดสอบแต่ละที่วัด triplicate Rolipram ตัวแทนPDE4 เตอร์ ถูกเลือกเป็นค่าบวกควบคุม2.6. cytotoxic assaysCytotoxicity ของ compounds13and14on murineเซลล์ macrophage RAW 264.7 (รับจาก ATCC มานาสซาสVA สหรัฐอเมริกา) ถูกประเมิน โดย MTT assay RAW 264.7 เซลล์ได้อ่างใน DMEM (Gibco BRL เกาะแกรนด์ NY, USA) เสริม ด้วย 10% ครรภ์วัวเซรั่ม (Tianhang เจ้อเจียงเทคโนโลยีชีวภาพ Co., Ltd. หางโจว จีน) ใน CO2at 5%37 องศาเซลเซียส เซลล์ถูก seeded เป็นแผ่น 96 ดีวัฒนธรรมกับการความหนาแน่น 1 × 104เซลล์ต่อดี และได้รับอนุญาตให้ยึดมั่นใน 24 ชมแล้ว ถือว่า มีความเข้มข้นต่าง ๆ ของสารประกอบแต่ละในอีก 24 ชม หลังการรักษา เซลล์ได้ incubated ด้วยมิลลิกรัม 0.5 mL– 1MTT โซลูชันสำหรับ h 4 ที่ 37 ° C แล้วsupernatant ถูกปฏิเสธ และถูกคริสตัล formazanละลายใน DMSO ความหนาแน่นออปติคัลที่ 570 nm ที่วัดบนเครื่องอ่าน microplate FlexStation 3 (อุปกรณ์โมเลกุลSunnyvale, CA, USA) กับ SoftMax Pro 5 ซอฟต์แวร์บนเครื่องบิน3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1. elucidation โครงสร้างของสารแยกต่างหากสารประกอบ 8 ถูกรับเป็นสีออกเหลืองไปผง สูตรโมเลกุลคือก่อเป็น C31H34O12จากไอออน pseudomolecular peak atm/z621.1973 [M + นา]+(ปี. สำหรับ C31H34O12Na, 621.1942) ในการ HRESIMS IRรุ้ง 8 ระบุสถานะของกลุ่มไฮดรอกซิล(3376 ซม.−1, br), กลวง carbonyl เอส (1706 ซม.−1),กลุ่ม carbonyl chelated (พัก 1650 ซม.−1) และ moiety หอม(1600 ซม.−1). คลื่น UV ให้ absorptions สูงสุดที่226, 252 และ 300 nm ซึ่งมีลักษณะของchromones [23]The1ข้อมูลด้าน H NMR ของ 8(ตารางที่ 1) รวมกับความ1H –1โคซี่ H และ HSQC แรมสเป็คตราตารางที่ 11And13 H (400MHz)ข้อมูล NMR C (100 MHz) ของ compounds8, 9, 10and11in CD3OD (δin ppm จิ Hz)คาร์บอน 8 10 9 11ΔC δHmult ΔC δHmult ΔC δHmult ΔC δHmult1 162.9 163.22 167.2 167.4 114.1 6.85, s 114.5 6.87, s3 (s) (s) 152.3 151.1 112.6 6.12 112.6 6.124 182.2 182.2 117.2 6.96, 119.2 6.97 s, s5 144.8 144.6 6.98 121.3 (d, 7.4) 6.90 119.4 (d, 7.4)6 6.77 112.6 (s) (s) 7.44 136.0 (t, 7.9) 112.5 6.79 137.0 7.45 (t, 7.9)7 162.0 162.0 117.4 6.84 (d, 8.1) 6.81 116.6 (d, 8.1)8 111.4 111.8 163.0 162.69 2.83 44.9 (dd, 14.2, 5.0) 2.90 44.6 (dd, 14.3, 4.5) 195.4 195.32.76 (d, 7.8) 2.76 (d, 8.3)10 (m) 4.48 ที่ 66.0 (m) 4.47 45.4 (d, 1.6) 66.3 4.45 4.42 45.4 (d, 1.7)11 23.7 1.37 (d, 6.2) 1.35 23.6 (d, 6.3) 64.5 4.65 (s) 4.66 64.6 (d, 3.1)5-CH3 2.71 23.7 (s) 2.72 23.6 (s)7-OCH3 57.1 3.87 (s) 57.0 3.88 (s)1a 159.6 159.6 117.8 117.94a 117.2 117.2 147.2 142.3ของ 5a 142.3 146.98a 119.1 118.81′ 72.8 5.20 (d, 10.1) 5.19 72.8 (d, 10.1) 85.9 3.28 (dd, 9.1, 2.5) 85.9 3.28 (dd, 9.6, 1.8)2′ 5.75 73.7 (dd, 9.8, 9.4) 73.9 5.74 (dd, 9.9, 9.5) 2.81 71.7 (t, 9.3) 2.81 71.7 (t, 9.3)3′ 3.75 77.7 (d, 9.0) 77.9 3.75 (d, 8.8) (d, 9.1) 79.7 3.25 3.25 79.7 (d, 9.6)4′ (m) 3.57 72.3 (t, 8.9 นอก) 72.4 3.57 อาหาร 3.07 71.5 (t, 9.3) 71.4 3.06 (t, 9.3)5′ 80.1 3.69 (m) 3.47 82.9 (m) 78.7 2.98 (m) 2.98 78.8 (m)6′ (dd, 11.9, 1.5) ที่ 4.46 64.4 63.1 3.94 (dd, 12.0, 1.9) 64.7 4.06 (dd, 11.7, 2.0) 64.5 4.07 (dd, 11.7, 2.0)4.26 (dd, 12.1, 6.4) 3.74 (dd, 11.9, 6.4) 3.77 (dd, 11.7, 7.1) 3.76 (dd, 11.7, 7.0)COCH3 173.0 172.6 172.6COCH3 20.9 2.03 (s) 1.88 20.5 (s) 1.88 20.5 (s)1″ 168.0 167.82 ″ 114.6 6.03 (d, 15.9) 115.6 6.10 (d, 15.8)3 ″ 146.6 7.35 (d, 16.1) 7.39 146.1 (d, 15.8)4 ″ 127.0 128.25″ 131.1 7.31 (d, 8.6) 7.42 130.9 (d, 8.7)6″ (d, 8.6) 116.9 6.74 6.89 115.4 (d, 8.8)7″ 161.3 163.28″ (d, 8.6) 116.9 6.74 6.89 115.4 (d, 8.8)9″ 131.1 7.31 (d, 8.6) 7.42 130.9 (d, 8.7)7″-OCH3 3.79 55.9 (s)เจเอส 71 จงร้อยเอ็ด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผิวใบแห้งและผง OFA Barbadensis (500.0 กรัม)
ถูกสกัดสามครั้งด้วยเอทานอล 95% (3 × 1 ลิตร) ภายใต้การ
อัลตราโซนิก สารสกัดถูกกรองและเข้มข้นภายใต้
ความดันลดลงเพื่อให้ได้สารตกค้างที่มืด (34.3 กรัม) น้ำมันดิบ
สารสกัดถูกระงับในน้ำกลั่น (500 มิลลิลิตร)
และ fractionated เนื่องกับ 3 × 500 มิลลิลิตรปริมาณ
ปิโตรเลียมอีเทอร์, EtOAc รู่-บิวทานอ ส่วน EtOAc
(8.1 กรัม) จากนั้นก็ยัดเยียดให้ RP-เอฟซีและมีความลาดชะ
ของเมธานอล-H2O (30:70 เพื่อ 80:20, v / v) ในอัตราการไหลของปริมาณ 20 มลนาที
-1
จะจ่าย 10 เศษส่วน (E1-E10) ส่วน E3 ถูกเพิ่มเติม
chromatographed โดย RP-เอฟซีโดยใช้เมธานอล-H2O (26: 74, v / v) เป็น
เฟสเคลื่อนที่เพื่อให้ compounds1 (321 มิลลิกรัม) 2 (362 มิลลิกรัม) และ
3 (738 มก.) ส่วน E5 บริสุทธิ์โดยวิธี HPLC กึ่งเตรียม
ใช้เมธานอล-H2O (56:44, v / v) ระบบที่จะได้รับ compounds4
(3 มิลลิกรัม tR11.5 นาที), 5 (2 มิลลิกรัม tR12.3 นาที), 6 ( 3 มิลลิกรัม tR13.2 นาที)
and7 (4 มิลลิกรัม tR13.9 นาที) ส่วน E6 ถูกยัดเยียดให้ HPLC semipreparative ชะด้วยระบบชะ Isocratic ของ
เมธานอล-H2O (60:40 v / v) เพื่อให้ compounds8 (45 มิลลิกรัม, TR
8.9 นาที) and9 (63 มิลลิกรัม tR13.5 นาที) ใช้วิธีการเดียวกัน,
สาร 10 (23 มก., TR 13.4 นาที) และ 11 (82 มก., TR
15.7 นาที) ที่ได้รับจากส่วน E7 ส่วน E9 ถูก
chromatographed ที่คอลัมน์ซิลิกาเจล (100 × 10 มม id)
ชะกับขั้นตอนของการไล่ระดับสี CH2Cl2-เมธานอล (10: 1-7: 1, v / v)
ที่จะจ่าย compounds12 (8 มก.), 13 (3 มก.) and14 (2 มก.)
สารสกัดจาก n-butanol (2.3 กรัม) บริสุทธิ์โดย RP-เอฟซีกับ MeOH-
H2O (35:65 เพื่อ 60:40, v / v) เป็นเฟสเคลื่อนที่ตาม semipreparative HPLC (เมธานอล-H2O, 58:42, v / V) เพื่อให้ได้สาร
15 (36 มิลลิกรัม tR15.6 นาที) and16 (45 มิลลิกรัม tR16.5 นาที).
2.3.1 Aloeresin K (8)
สีเหลืองผงสัณฐาน; [α] 20 D = -130.2 ° (c0.66,
เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล) λmax: 226, 252 และ 300 นาโนเมตร; IR (KBr) νmax:
3376 (BR), 2934, 1706, 1650, 1600, 1379, 1246, 1164 และ
1103 ซม.
-1
; positiveESIMSm / z599.19 [M + H]
+
; HRESIMSm / Z
621.1973 [M + นา]
+
(calcd สำหรับ C31H34O12Na, 621.1942.)
1
H
(CD3OD, 400 MHz) และ
13
CNMR (CD3OD 100 MHz) สเปกตรัม
. ข้อมูล seeTable 1
2.3.2 6'-O-acetyl-aloin B (9)
เหลืองผงสัณฐาน; [α] 20 D = -53.8 ° (ค 0.66,
เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล) λmax: 269, 297 และ 356 นาโนเมตร; IR (KBr) νmax:
3403 (BR), 2876, 1721, 1612, 1286, 1233 และ 1069 ซม.
-1
;
บวก ESIMSm / z461.05 [M + H]
+
; HRESIMSm / z483.1279
[M + นา]
+
(calcd สำหรับ C23H24O10Na, 483.1262.)
1
H (CD3OD,
400 MHz) และ
13
C NMR (CD3OD 100 MHz) ข้อมูลสเปกตรัมเห็น
. ตารางที่ 1
2.3.3 Aloeresin J (10)
สีเหลืองผงสัณฐาน; [α] 20 D = -147.8 ° (c0.69,
เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล) λmax: 225, 251 และ 297 นาโนเมตร; IR (KBr) νmax:
3385 (BR), 2971, 2926, 1701, 1647, 1599, 1382, 1259, 1166 และ
1078 ซม.
-1
; positiveESIMSm / z571.21 [M + H]
+
; HRESIMSm / Z
593.1998 [M + นา]
+
(calcd สำหรับ C30H34O11Na, 593.1993.)
1
H
(CD3OD, 400 MHz) และ
13
CNMR (CD3OD 100 MHz) สเปกตรัม
. ข้อมูล seeTable 1
2.3.4 6'-O-acetyl-aloin (11)
เหลืองผงสัณฐาน; [α] 20 D + = 5.2 ° (ค 0.63,
เมธานอล); รังสียูวี (เมธานอล) λmax: 269, 297 และ 356 นาโนเมตร; IR (KBr) νmax:
3423 (BR), 2920, 2872, 1728, 1622, 1236, 1101 และ 1032 ซม.
-1
;
บวก ESIMSm / z461.08 [M + H]
+
; HRESIMSm / z483.1285
[M + นา ]
+
(calcd สำหรับ C23H24O10Na, 483.1262.)
1
H (CD3OD,
400 MHz) และ
13
C NMR (CD3OD 100 MHz) ข้อมูลสเปกตรัมดู
ตารางที่ 1.
2.4 การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ PDE4D
โปรโตคอลสำหรับการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ PDE4D
ถูกเรียกรายงานก่อนหน้านี้ของเรา [19-22] .Inbrief,
พลาสมิด recombinant pET15b subcloned กับ PDE4D2 (โดเมนปัจจัยตกค้าง 86-413) ถูกนำเข้าสู่เจ้า coli
สายพันธุ์ BL21 (codonplus) และเซลล์เปลี่ยนได้รับ
การปลูกฝังในสื่อที่มี100μgmL LB-1
ampicillin
และกลูโคส 0.4% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสจน OD600 = 0.7 แล้ว 0.1 มิลลิ
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ถูกนำมาใช้เพื่อ
ก่อให้เกิดการแสดงออกของโปรตีน PDE4D อีก 20 ชั่วโมงที่ 15 ° C.
PDE4D โปรตีนบริสุทธิ์ตามคอลัมน์ Ni-NTA ชะกับ
บัฟเฟอร์ imidazole และน้ำทิ้งได้รับการตรวจสอบผ่าน
OD280 . โดยปกติ 40-60 มิลลิกรัม PDE4D ที่ได้รับจากมือถือ 1 ลิตร
วัฒนธรรมที่มีความบริสุทธิ์มากกว่า 90% ตามที่กำหนดโดย
SDS-PAGE.
2.5 การตรวจเอนไซม์
กิจกรรมของเอนไซม์ของโดเมนเร่งปฏิกิริยาของ PDE4D
ถูก assayed โดยใช้
3
H-ค่ายเป็นสารตั้งต้น ครั้งแรก
3
H-ค่าย
ถูกเจือจางด้วยบัฟเฟอร์ทดสอบมี 50 มิลลิ Tris-HCl
70 J. -S. Zhong และคณะ / Fitoterapia 100 (2015) 68-74
(pH 7.5), 10 มิลลิ MgCl2and 0.5 มิลลิ DTT ถึง 2 × 10
4
× 10 -3
4
แผ่นต่อนาที
ต่อการทดสอบ ปฏิกิริยาจะถูกดำเนินการในการผสมปฏิกิริยา
ที่มีเอนไซม์ PDE4D, พื้นผิวและความเข้มข้นแตกต่างกันของสารยับยั้งการละลายใน DMSO ที่อุณหภูมิห้องนาน
15 นาทีและสิ้นสุดลงโดยการเพิ่ม 0.2 M ของ ZnSO4 จากนั้น
สินค้าปฏิกิริยา
3
H-AMP เกิดขึ้นจะตกตะกอนลง 0.2 ไม่มีของ
Ba (OH) 2 ในขณะที่ unreacted
3
H-ค่ายยังคงอยู่ในสารละลาย กัมมันตภาพรังสีในสารละลายวัดใน
2.5 มิลลิลิตรของของเหลวในที่สุดทองประกายเครื่องดื่มค็อกเทลโดยของเหลว
ประกายเคาน์เตอร์ ทั้งหมดของเชื้อเบื้องต้นได้รับการคัดเลือกที่
เข้มข้น 10 μMandtheIC50คุณค่าของการใช้งาน
สารวัดต่อไปโดยการถดถอยเชิงเส้น.
ทดสอบแต่ละวัดในเพิ่มขึ้นสามเท่า Rolipram ตัวแทน
ยับยั้ง PDE4 ได้รับเลือกเป็นควบคุมบวก.
2.6 การตรวจพิษ
พิษของ compounds13and14on หมา
macrophage RAW 264.7 เซลล์ (ที่ได้รับจาก ATCC ซา,
VA, USA) ได้รับการประเมินโดยการทดสอบ MTT RAW 264.7 เซลล์ที่ถูก
เพาะเลี้ยงใน DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) เสริมด้วย 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (Zhejiang Tianhang
ชีวภาพเทคโนโลยี จำกัด , หางโจว, จีน) ใน 5% CO2at
37 องศาเซลเซียส เซลล์ที่ถูกเมล็ดลงในจานเพาะเลี้ยง 96 ดีกับ
ความหนาแน่นของ 1 × 10
4
เซลล์ต่ออย่างดีและได้รับอนุญาตให้เป็นไปตามเวลา 24 ชั่วโมง,
และได้รับการรักษาแล้วด้วยความเข้มข้นต่างๆของแต่ละสารประกอบ
สำหรับอีก 24 ชั่วโมง หลังจากการรักษาเซลล์ที่ถูกบ่มกับ
0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
-1
แก้ปัญหา MTT 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและจากนั้น
ใสถูกทิ้งและคริสตัล formazan ถูก
ละลายใน DMSO ความหนาแน่นของแสงที่ 570 นาโนเมตรวัด
ใน FlexStation 3 อ่าน microplate (อุปกรณ์โมเลกุล
ซันนีเวล, CA, USA) กับ SoftMax Pro 5 ซอฟต์แวร์ onboard.
3 และอภิปรายผล
3.1 ชี้แจงโครงสร้างของสารที่แยก
สารประกอบ 8 ที่ได้รับเป็นอสัณฐานสีเหลือง
ผง สูตรโมเลกุลของมันได้รับการยอมรับในฐานะ C31H34O12
จากระดับสูงสุดไอออน pseudomolecular ATM / z621.1973 [M + นา]
+
(calcd. สำหรับ C31H34O12Na, 621.1942) ใน HRESIMS IR
สเปกตรัมของ 8 ระบุการปรากฏตัวของกลุ่มไฮดรอกซิ
(3376 ซม.
-1
, BR), เอสเตอร์คาร์บอนิลผัน (1706 ซม.
-1
)
กลุ่มคาร์บอนิลคีเลต (1650 ซม.
-1
) และครึ่งหอม
(1600 cm
-1
) สเปกตรัมรังสียูวีให้การดูดซึมสูงสุดที่
226, 252 และ 300 นาโนเมตรซึ่งเป็นลักษณะของ
chromones [23] .The1
H-NMR ข้อมูลสเปกโทรสโก 8
(ตารางที่ 1) รวมกับของ
1
H-
1
H COSY และ HSQC สเปกตรัม
ตารางที่ 1
1
H (400MHz) and13
C (100 MHz) ข้อมูล NMR ของ compounds8, 9, 10and11in CD3OD ppm (δin, จินเฮิร์ตซ์).
คาร์บอน 8 9 10 11
δCδHmult δCδHmult δCδHmult δCδHmult.
1 162.9 163.2
167.2 167.4 2 114.1 6.85, s 114.5 6.87, s
3 112.6 6.12 (s) 112.6 6.12 (s) 152.3 151.1
182.2 182.2 4 117.2 6.96, s 119.2 6.97, s
5 144.8 144.6 121.3 6.98 (ง 7.4 ) 119.4 6.90 (ง 7.4)
6 112.6 6.77 (s) 112.5 6.79 (s) 136.0 7.44 (t 7.9) 137.0 7.45 (t 7.9)
7 162.0 162.0 117.4 6.84 (ง 8.1) 116.6 6.81 (ง 8.1)
8 111.4 111.8 163.0 162.6
44.9 2.83 9 (DD, 14.2, 5.0) 44.6 2.90 (DD, 14.3, 4.5) 195.4 195.3
2.76 (ง 7.8) 2.76 (ง 8.3)
10 66.3 4.45 (เมตร) 66.0 4.48 (เมตร) 45.4 4.47 (ง 1.6) 45.4 4.42 (ง 1.7)
11 23.7 1.37 (ง 6.2) 23.6 1.35 (ง 6.3) 64.5 4.65 (s) 64.6 4.66 (ง 3.1)
5-CH3 23.7 2.71 (s) 23.6 2.72 (s)
7-OCH3 57.1 3.87 (s) 57.0 3.88 (s)
1a 159.6 159.6 117.8 117.9
117.2 117.2 4a 147.2 142.3
142.3 146.9 5a
8a 119.1 118.8
1 '72.8 5.20 (ง, 10.1) 72.8 5.19 (ง, 10.1) 85.9 3.28 (DD, 9.1, 2.5) 85.9 3.28 (DD, 9.6, 1.8)
2 '73.7 5.75 (DD, 9.8, 9.4) 73.9 5.74 (DD, 9.9, 9.5) 71.7 2.81 (t 9.3) 71.7 2.81 (t, 9.3)
3 '77.7 3.75 (ง 9.0) 77.9 3.75 (ง 8.8) 79.7 3.25 (ง 9.1) 79.7 3.25 (ง 9.6)
4 '72.4 3.57 (เมตร) 72.3 3.57 (t, 8.9) 71.5 3.07 (t 9.3 ) 71.4 3.06 (t 9.3)
5 '80.1 3.69 (เมตร) 82.9 3.47 (เมตร) 78.7 2.98 (เมตร) 78.8 2.98 (เมตร)
6 '64.4 4.46 (DD, 11.9, 1.5) 63.1 3.94 (DD, 12.0, 1.9) 64.7 4.06 (DD, 11.7, 2.0) 64.5 4.07 (DD, 11.7, 2.0)
4.26 (DD, 12.1, 6.4) 3.74 (DD, 11.9, 6.4) 3.77 (DD, 11.7, 7.1) 3.76 (DD, 11.7, 7.0)
COCH3 173.0 172.6 172.6
20.9 COCH3 2.03 (s) 20.5 1.88 (s) 20.5 1.88 (s)
1 "168.0 167.8
2 "114.6 6.03 (ง, 15.9) 115.6 6.10 (ง, 15.8)
3 "146.6 7.35 (ง, 16.1) 146.1 7.39 (ง, 15.8)
4 "127.0 128.2
5 "131.1 7.31 (ง 8.6) 130.9 7.42 (ง 8.7)
6 "116.9 6.74 (ง 8.6) 115.4 6.89 (ง 8.8)
7 "161.3 163.2
8 "116.9 6.74 (ง 8.6) 115.4 6.89 (ง 8.8)
9 "131.1 7.31 (ง 8.6) 130.9 7.42 (ง 8.7)
7 "-OCH3 55.9 3.79 (s)
71-เจเอส Zhong และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และผงใบแห้งของผิว ด่าง ( 500.0 g )
สกัด 3 ครั้ง ด้วยแอลกอฮอล์ 95% ( 3 × 1 L ) ภายใต้
ultrasonic สารสกัดที่ถูกกรองและเข้มข้นภายใต้
ความดันลดลงผลผลิตกากมืด ( 34.3 กรัม ) โดย
สิ่งสกัดถูกระงับในน้ำกลั่น ( 500 มล. )
3 ×โลหิตอย่างต่อเนื่องและ 500 มิลลิลิตร ปริมาณปิโตรเลียมอีเทอร์ etoac
, andn บิวทานอล .การ etoac เศษส่วน
( 8.1 กรัม ) ก็ต้อง rp-fc ตัวอย่างและมีความลาดชันของเมทิลแอลกอฮอล์ ( 30 : 70 )
H2O เพื่อ 80 v / v ) ในอัตรา 20 มิลลิลิตรต่อนาที– 1

ซื้อ 10 เศษส่วน ( E1 ) PCC7942 ) ส่วน E3 ยัง
chromatographed โดย rp-fc ใช้เมทิลแอลกอฮอล์– H2O ( 26 : 74 , V / V )
เฟสเคลื่อนที่ยอม compounds1 ( 321 ) , 2 ( 391 มิลลิกรัม )
3 ( 325 มิลลิกรัม ) ส่วน E5 บริสุทธิ์โดย HPLC
= กึ่งใช้เมทิลแอลกอฮอล์– H2O ( 56:44 , V / V ) ระบบเพื่อให้ได้ compounds4
3 มิลลิกรัม tr11.5 มิน ) , 5 ( 2 มิลลิกรัม tr12.3 มิน ) , 6 ( 3 มิลลิกรัม tr13.2 มิน )
7 ( 4 มิลลิกรัม tr13.9 มิน ) ส่วนรุ่นภายใต้ semipreparative HPLC ตัวอย่างด้วยระบบการชะ Isocratic ของปริมาณ H2O ( 60 : 40 ,
( v / v ) เพื่อให้ compounds8 ( 45 มก. , TR
8 นาที ) and9 ( 63 มิลลิกรัม tr13.5 มิน ) โดยใช้วิธีการเดียวกัน
สารประกอบ 10 ( 23 มิลลิกรัม , TR 13.4 นาที ) และ 11 ( 82 มิลลิกรัม , TR
157 นาที ) ตามลำดับส่วน E7 . ส่วน e9 คือคอลัมน์
chromatographed บนซิลิกาเจล ( 100 × 10 มิลไอดี )
ตัวอย่างด้วยขั้นตอนการ ch2cl2 ( 10 : 1 ) ของปริมาณถึง 7 : 1 v / v )
เท่าใด compounds12 ( 8 มิลลิกรัม ) , 13 ( 3 มก. ) and14 ( 2 มก. )
n-butanol ( 2.3 กรัม สารสกัดบริสุทธิ์จาก rp-fc ด้วยเมทิลแอลกอฮอล์–
H2O ( 35:65 ถึง 60 : 40 , v / v ) เป็นเฟสเคลื่อนที่ตาม semipreparative HPLC ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) H2O , อาหาร ,v / V ) ให้ผลผลิตสารประกอบ
15 ( 36 มิลลิกรัม tr15.6 มิน ) and16 ( 45 มิลลิกรัม tr16.5 มิน )
2.3.1 . aloeresin K ( 8 )
ผงสัณฐานเหลือง ; [ α ] 20 D = − 130.2 องศา ( c0.66
เมทิลแอลกอฮอล์ , ) ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์ : 226 , และ 300 nm ; และ ( KBR ) νแม็กซ์ :
ผู้ ( br ) , 2934 1706 , 1650 , 1600 , 1388 246 , เยี่ยม , และ

− 1 1103 cm
; positiveesimsm / z599.19 [ M ]

; hresimsm / Z
621.1973 [ M na ]

( Calcd . สำหรับ c31h34o12na 621.1942 , ) ;
1

( cd3od H ,400 MHz ) และ

cnmr ( cd3od 13 , 100 MHz ) ข้อมูลสเปกตรัม seetable 1
.
2.3.2 . 6 ดูแล - o-acetyl-aloin B ( 9 )
ผงสัณฐานเหลือง ; [ α ] 20 D = − 53.8 องศา ( C .
, เมทิลแอลกอฮอล์ ) ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์ : 269 , และ 356 nm ; และ ( KBR ) νแม็กซ์ :
สุดสวย ( br ) , 2876 1721 1231 ที่สุด , , แล้ว 807 , − 1 ซม.

;
บวก esimsm / z461.05 [ M ]

; hresimsm / z483.1279
[ ]

( Calcd M นา . สำหรับ c23h24o10na 483.1262 ) ;
1
, H ( cd3od
, 400 MHz ) และ 13

C NMR ( cd3od 100 MHz ) ตารางที่ 1 ข้อมูลสเปกตรัมดู
.
2.3.3 . aloeresin J ( 10 )
ผงป่นเหลือง ; [ α ] 20 D = − 147.8 องศา ( c0.69
เมทิลแอลกอฮอล์ , ) ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์ : 225 , 251 แล้ว 297 nm ; และ ( KBR ) νแม็กซ์ :
3385 ( br ) , 2971 3006 1701 , , จาก , 873 , 947 , นี้ 1 , 992 , − 1 ซม. และ


; positiveesimsm / z571.21 [ M ]

; hresimsm / Z
593.1998 [ M na ]

( Calcd . สำหรับ c30h34o11na 593.1993 , ) ;
1
H
( cd3od 400 MHz ) และ 13

cnmr ( cd3od 100 MHz ) ข้อมูลสเปกตรัม seetable 1
.
2.3.4 . 6 - o-acetyl-aloin MBC ( 11 )
ผงป่นสีเหลือง ; [ α ] 20 D = 5.2 องศา ( C = 0.63 ,
เมทิลแอลกอฮอล์ ) ; UV ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) λแม็กซ์ : 269 , และ 356 nm ; และ ( KBR ) νแม็กซ์ :
3423 ( BR ) 2920 เอเซียโดย 1622 , , , , พวกและ 1032 , − 1 ซม.

;
บวก esimsm / z461.08 [ M ]

; hresimsm / z483.1285
[ ]

( Calcd M นา . สำหรับ c23h24o10na 483.1262 ) ;
1
, H ( cd3od
, 400 MHz ) และ

C NMR ( cd3od 13 ,100 MHz ) ตารางที่ 1 ข้อมูลสเปกตรัมดู
.
2.4 . การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ pde4d
โปรโตคอลสำหรับการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ pde4d
ถูกอ้างถึงของเรารายงานก่อนหน้านี้ [ 19 – 22 ] inbrief ,
pet15b ของรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่มี pde4d2 ( catalytic domain , ตกค้าง 86 ( 413 ) ที่ใช้เป็น " โคไลสายพันธุ์ BL21 ( codonplus

เปลี่ยน cells ) และเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 100 ปอนด์μ GML – 1

ampicillin และ 0.4% กลูโคสที่ 37 ° C ถึง od600 = 0.7 แล้ว 0.1 mm
isopropyl บีตา - d-1-thiogalactopyranoside ( เอนไซม์ ) ใช้
กระตุ้นการแสดงออกของโปรตีน pde4d อีก 20 ชั่วโมง 15 ° C .
pde4d โปรตีนบริสุทธิ์โดยคอลัมน์ผมค้าขาย ตัวอย่างกับ
บัฟเฟอร์อิมิดาโซลและน้ำถูกตรวจสอบผ่าน
od280 .โดยทั่วไป 40 – 60 มิลลิกรัม pde4d ได้จากการเพาะเลี้ยงเซลล์
1 L ที่มีความบริสุทธิ์มากกว่าร้อยละ 90 ถูกกำหนดโดย
.
2.5 พบกิจกรรมเอนไซม์เอนไซม์
ของโดเมนการ pde4d
ถูก assayed โดย
3
h-camp เป็นสับสเตรท ก่อน
3

h-camp เจือจางด้วย ( บัฟเฟอร์ที่มีกำไร 50 mm – 70 J - S . HCl
จง et al . / fitoterapia 100 ( 2015 ) 68 และ 74
( pH 7.5 ) ,10 มม. mgcl2and 0.5 mM DTT 2 × 10
4
- 3 × 10
4

ต่อครั้ง ตามลำดับ ปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการในปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์ผสม
pde4d ตั้งต้นและความเข้มข้นแตกต่างกันของ DMSO ที่ใช้ละลายในอุณหภูมิห้อง
15 นาที และจบด้วยการเพิ่ม 0.2 M ของ znso4 . แล้ว

3
h-amp ปฏิกิริยาผลิตภัณฑ์มาตกตะกอน โดย 0.2 N
Ba ( OH ) 2
3
เข้าสู่ ในขณะที่h-camp ยังคงอยู่ในน่าน . กัมมันตภาพรังสีในน่านมีวัดใน
2.5 มิลลิลิตรของน้ำทองประกายค็อกเทลโดยของเหลว
ข้อมูลนับ ทุกสายพันธุ์เป็นเบื้องต้นการคัดกรองที่เข้มข้นค่า

mandtheic50 10 μใช้สารประกอบได้ โดยวัดจากการถดถอยแบบไม่เชิงเส้น
ทดสอบแต่ละวัดทั้งสามใบ
rolipram ผู้แทนpde4 ซึ่งถูกเลือกเป็นตัวควบคุมบวก .
2.6 เป็นพิษต่อเซลล์มะเร็ง compounds13and14on )

264.7 เซลล์แมคโครฟาจ RAW ที่ ~ ( ที่ได้รับจาก ATCC ซาส
, , VA , USA ) ที่ประเมินโดย MTT assay พบ ดิบ 264.7 cells ที่เลี้ยงใน dmem
( gibco BRL Grand Island , NY , USA ) เสริมด้วย 10% เซรั่มและทารกในครรภ์ ( Zhejiang tianhang
ชีวภาพ เทคโนโลยี จำกัด หางโจวจีน ) 5 % co2at
37 องศา เซลล์มีเมล็ดเป็น 96 ดีวัฒนธรรมจานกับ
ความหนาแน่น 1 × 10
4
เซลล์ต่อได้ดี และได้รับอนุญาตให้ปฏิบัติตาม 24 H ,
แล้วถือว่ามีความเข้มข้นของแต่ละสารต่างๆ
อีก 24 ชั่วโมง หลังการรักษา เซลล์ถูกบ่มกับ
0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ( 1

MTT โซลูชั่นสำหรับ 4 ชั่วโมง 37 ° C แล้วนำทิ้ง

และปฏิบัติการคริสตัลถูกละลายใน DMSO .ความหนาแน่นของแสงที่ 570 nm วัด
ในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน flexstation 3 โมเลกุลอุปกรณ์
Sunnyvale , CA , USA ) กับ softmax Pro 5 ซอฟต์แวร์ onboard .
3 ผลและการอภิปราย
3.1 . หาสูตรโครงสร้างของสารประกอบที่แยกได้สารประกอบ 8
ได้เป็นเหลืองไป
แป้ง สูตรโมเลกุลของก่อตั้งขึ้นเป็น c31h34o12
จาก pseudomolecular ไอออนสูงสุด ATM / z621 .1973 [ M na ]

( Calcd . สำหรับ c31h34o12na 621.1942 ) , ใน hresims . IR
8 พบการปรากฏตัวของสเปกตรัมของหมู่ไฮดรอกซิล
( ผู้ซม
− 1
, BR ) , และเอสเทอร์คาร์บอนิล ( 1706 ) − 1

)
chelated หมู่คาร์บอนิล ( 1650 ) − 1

) และหอมแน่นอน
( 1600 cm − 1

) ยูวีคลื่นความถี่ให้โมล่า
สูงสุดที่ 226 , และ 300 นาโนเมตร ซึ่งมีลักษณะของ

the1 โครโมนส [ 23 ]ข้อมูลผลิตภัณฑ์ทาง 8
( ตารางที่ 1 ) รวมกับ
1
H
1
H และอบอุ่น และ hsqc Spectra
ตาราง 1
1
H ( บน ) and13
C ( 100 MHz ) ข้อมูล NMR ของ compounds8 , 9 , 10and11in cd3od ( δใน ppm จิน Hz )
8 คาร์บอน 10 9 54
δ C δ hmult . δ C δ hmult . δ C δ hmult . δ C δ hmult .
1 มีระดับ 163.2
2 167.2 167.4 114.1 6.85 , รายได้ 6.87 S
3 112.6 6.12 ( s ) 112.6 6.12 ( s ) 152.3 151.1
4 182.2 182.2 117.2 ไก 119.2 เป็นตัว S ,s
5 144.8 144.6 121.3 6.98 ( D , 7.4 ) 119.4 6.90 ( D , 7.4 )
6 112.6 6.77 ( s ) 112.5 6.79 ( s ) 136.0 7.44 ( T , 7.9 ) 137.0 7.45 ( T , 7.9 )
7 162.0 162.0 117.4 6.84 ( D , 8.1 ) 116.6 6.81 ( D ,
5 ) 8 111.4 111.8 163.0 162.6
9 44.9 2.83 ( DD , 14.2 , 5.0 ) 44.6 2.90 ( DD , 1.5 , 4.5 ) 195.4 195.3
2.76 ( D , 7.8 ) 2.76 ( D , 8.3 )
10 คน ( M ) 66.0 4.48 4.45 ( M ) 45.4 4.47 ( D , 1.6 ) 45.4 4.42 ( D 1.7 )
11 23.7 1.37 ( D , 6.2 ) 236 ระดับ ( D , 6.3 ) 64.5 4.65 ( s ) ที่ 64.6 4.66 ( D , 3.1 )
5-ch3 23.7 2.71 ( s ) 23.6 2.72 ( s )
7-och3 57.1 3.87 ( s ) 57.0 3.88 ( s )
8 159.6 159.6 ได้อย่าง 117.9
4 117.2 117.2 147.2 142.3
5a 142.3 146.9 119.1 118.8

8A 1 ดูแล 72.8 5.20 ( D , 10.1 ) 72.8 5.19 ( D , 10.1 ) 85.9 3.28 ( DD , 9.1 , 2.5 ) 85.9 3.28 ( DD , 9.6 , 1.8 )
2 ได้รับ 73.7% 5.75 ( DD , 9.8 , 9.4 ) 73.9 5.74 ( DD , 9.9 , 9.5 ) ได้รับ 2.81 ( T , 9.3 ) 2.81 ริ ( T , 9.3 )
3 นั้น 77.7 375 ( D , 9.0 ) 77.9 3.75 ( D , 8.8 ) 79.7 3.25 ( D , 9.1 ) 79.7 3.25 ( D , 9.6 )
4 ได้รับ 60 3.57 ( M ) เฉพาะ 3.57 ( T , 8.9 ) 71.5 3.07 ( T , 9.3 ) 71.4 3.06 ( T , 9.3 )
5 ได้รับ 80.1 3.69 ( M ) 161 3.47 ( M ) 78.7 2.98 ( M ) 78.8 2.98 ( M )
6 นั้น 64.4 4.46 ( DD , 11.9 , 1.5 ) ความต้องการความปลอดภัย ( DD , 12.0 , 1.9 ) 64.7 4.06 ( DD , 11.7 , 2.0 ) 64.5 4.07 ( DD , 11.7 , 2.0 )
4.26 ( DD 12.1 ( 6.4 ) ( DD , 11.9 6.4 ) 3.77 ( DD , 11.7 , 7.1 ) 3.76 ( DD , 11.7 , 7.0 )
coch3 173.0 172.6 172.6
coch3 20.9 2.03 ( s ) 20.5 1.88 ( s ) 20.5 1.88 ( s )
1 เพลง 168.0 167.8
2 เพลง 114.6 แมคโอเอส ( D , C ) 115.6 6.10 ( D , 15.8 )
3 เพลง 146.6 7.35 ( D , 16.1 ) 146.1 7.39 ( d ,
4 127.0 15.8 ) บอกว่า 128.2
5 เพลง 131.1 7.31 ( D 8.6 ) 130.9 7.42 ( D , 8.7 )
6 เพลง 116.9 6.74 ( D 8.6 ) 115.4 90 ( D , 8.8 )
7 เพลง 161.3 163.2
8 เพลง 116.9 6.74 ( D 8.6 ) 115.4 90 ( D , 8.8 )
9 เพลง 131.1 7.31 ( D 8.6 ) 130.9 7.42 ( D , 8.7 )
7 เพลง - och3 55.9 3.79 ( s )
- S . จงและ 71 J